Bitkilerde Buz Çekirdeklenme ve Buz Yayma Çalışmaları Yüksek çözünürlüklü kızılötesi Termografi (HRIT) Kullanımı

Özet

Here we present a protocol that allows one to visualize sites of ice formation and avenues of ice propagation in plants utilizing high resolution infrared thermography (HRIT).

Özet

Freezing events that occur when plants are actively growing can be a lethal event, particularly if the plant has no freezing tolerance. Such frost events often have devastating effects on agricultural production and can also play an important role in shaping community structure in natural populations of plants, especially in alpine, sub-arctic, and arctic ecosystems. Therefore, a better understanding of the freezing process in plants can play an important role in the development of methods of frost protection and understanding mechanisms of freeze avoidance. Here, we describe a protocol to visualize the freezing process in plants using high-resolution infrared thermography (HRIT). The use of this technology allows one to determine the primary sites of ice formation in plants, how ice propagates, and the presence of ice barriers. Furthermore, it allows one to examine the role of extrinsic and intrinsic nucleators in determining the temperature at which plants freeze and evaluate the ability of various compounds to either affect the freezing process or increase freezing tolerance. The use of HRIT allows one to visualize the many adaptations that have evolved in plants, which directly or indirectly impact the freezing process and ultimately enables plants to survive frost events.

Giriş

Bitkilerin aktif büyüyor meydana dondurucu soğuklar bitki çok az veya hiç donma toleransının sahip, özellikle öldürücü olabilir. Böyle don olayları sık sık tarımsal üretim üzerinde yıkıcı etkileri ve özellikle alpin, alt-arktik ve arktik ekosistemler ^1-6, bitkilerin doğal popülasyonlarında toplum yapısının şekillenmesinde önemli bir rol oynayabilir. Şiddetli ilkbahar donlarından Episodes son yıllarda ^7-9 ABD ve Güney Amerika'da meyve üretiminde önemli etkileri vardı ve daha tipik ortalama düşük sıcaklıklarda ardından sıcak hava erken başlangıçlı şiddetlenir edilmiştir. Erken sıcak hava no frost hoşgörü ^1,3,10-12 çok az var hepsi yeni sürgünler, yapraklar, çiçekler ve büyümesini aktive kırmak için tomurcukları neden olur. Böyle düzensiz hava desenleri devam eden iklim değişikliği doğrudan yansıması olduğu bildirilmiştir ve ormanının için ortak bir hava desen olması bekleniyoreeable gelecek ^13. Artan don toleransı sağlayabilir, ekonomik, etkili ve çevre dostu yönetim teknikleri ya da agrokimyasallar sağlamak için çabalar nedenlerle bir dizi için sınırlı bir başarı oldu ama bu kısmen tolerans donma ve bitkilerde kaçınma mekanizmaları donma karmaşık doğası isnat edilebilir. ¹⁴

Bitkilerde don sağkalım ile ilişkili adaptif mekanizmalar geleneksel hoşgörü dondurma ve kaçınma dondurma, iki kategoriye ayrılır oylandı. Birinci kategori bitkilerin varlığı ve dokuları buz dehidratif etkisiyle ilişkili stresini tolere izin spesifik bir gen grubu ile düzenlenir biyokimyasal mekanizmaları ile ilişkilidir. İkinci kategori, tipik olarak, ama sadece değil, bir bitkinin ¹⁴ yapısal olmadığını belirlemek, bir bitkinin yönleri ve buz formları ile ilişkili iken. Bir reklam dondurarak kaçınma yaygınlığı rağmenaptive mekanizma, az araştırma altında yatan mekanizmaları ve donma kaçınma düzenleme anlamak için son zamanlarda tahsis edilmiştir. okuyucu bu konuda daha ayrıntılı bilgi için, bir son gözden ¹⁵ olarak adlandırılır.

Düşük sıcaklıklarda buz oluşumu basit bir süreç gibi görünse de, birçok faktör bitkinin içinde yayılır bitki dokularında hangi buz çekirdekleşirken ve nasıl sıcaklığın belirlenmesinde katkıda bulunur. Böyle çekirdek oluşturucularının Dışsal ve içsel buz varlığı, heterojen vs homojen çekirdeklenme olayları, termal-histerezis (antifriz) proteinler, belirli şekerler ve diğer osmolitler varlığı ve bitkinin yapısal yönlerini bir dizi gibi parametreler geleni önemli oynamak Bitkilerde dondurma işleminde rolü. Topluca, bu parametreler buz başlatmış ve büyür nasıl nerede bir bitki, donuyor hangi sıcaklığı etkiler. Ayrıca, elde edilen, buz kristallerinin morfolojisi etkileyebilir.Çeşitli yöntemler LTSEM'ye (nükleer manyetik rezonans spektroskopi ^{(NMR), 16,} manyetik rezonans görüntüleme ^{(MRI), 17,} kriyo-mikroskopi ^18-19, ve düşük sıcaklık tarama elektron mikroskopisi de dahil olmak üzere laboratuar koşulları altında bitkilerde dondurma işlemi incelemek için kullanılmıştır ). laboratuvar ve saha ortamlarında tüm bitkilerin ²⁰ Donma, ancak esas termokupl ile takip edilmektedir. dondurma incelemek için termokupl kullanımı su, katı bir sıvı bir faz geçişi uğrar ısı kurtuluş (füzyon entalpisi) dayanmaktadır. Donma sonra ekzotermik olay olarak kaydedilir. ^21-23 termokuplar bitkilerde donma okuyan tercih tipik yöntemi olmasına rağmen, bunların kullanımı bir donma olayı sırasında elde edilen bilgilerin miktarını sınırlamak birçok sınırlamalar vardır. Örneğin, termokupl ile o yayar nasıl buz, bitkilerde başlatılan yeri belirlemek için neredeyse imkansız zordur,bir hatta hızında yayılır eğer ve bazı dokular buz serbest kalırsa.

Yüksek çözünürlüklü kızılötesi termografi (HRIT) ^24-27 Gelişmeler Bununla birlikte, önemli ölçüde bir diferansiyel görüntüleme modunda kullanıldığında, özellikle bütün bitkilerde donma süreci hakkında bilgi edinmek için yeteneğini artırmıştır. ^28-33, mevcut raporda, donma sürecinin çeşitli yönlerini nerede ve ne sıcaklık buz at bitkilerde başlatılan etkileyen çeşitli parametreleri incelemek için bu teknolojinin kullanımını tarif eder. Bir protokol yüksek, sıfırın altındaki bir sıcaklıkta otsu bitkiye dondurma başlatan bir dış çekirdek oluşturucu olarak hareket etmek buz çekirdeklenme aktif (INA) bakterinin yeteneğinin, Pseudomonas syringae (Cit-7) göstermektedir ki sunulacaktır.

Yüksek çözünürlüklü kızılötesi kamera

Bu raporda belgelenen protokol ve örnekler kızılötesi yüksek çözünürlük kullananVideo radyometre. radyometre (Şekil 1), kızılötesi ve görünür spektrum görüntü ve sıcaklık verileri bir kombinasyonunu temin eder. Kameranın spektral tepkisi 7,5-13,5 um aralığındadır ve 640 x 480 piksel çözünürlükte içerir. Tarafından oluşturulan görünür spektrum görüntüleri dahili kamera kompleksi, termal görüntülerin yorumlanmasını kolaylaştıran gerçek zamanlı, IR görüntüleri ile kaynaşmış olabilir. Kamera için lensler bir dizi close-up ve mikroskobik incelemelerde bulunmak için kullanılabilir. Kamera bir stand-alone modunda kullanılan, ya da arabirim ve propietary yazılımını kullanarak bir dizüstü bilgisayar ile kontrol edilebilir. yazılımı kaydedildi videoları yerleşmiş olan termal çeşitli verileri elde etmek için kullanılabilir. Bu kızılötesi ışıma ölçerlerin geniş bir yelpazede piyasada mevcut olduğunu not etmek önemlidir. Bu nedenle, araştırmacı bilgili bir ürün mühendisi ile amaçlanan uygulama tartışmak ve araştırmacı herhangi specifi yeteneğini test esastırc radyometre gerekli bilgileri sağlamak. açıklanan protokol kullanılan görüntüleme radyometre akrilik kutusunda Strafor i n ısınma ve soğutma protokolleri esnasında yoğunlaşma maruziyeti caydırmak amacıyla yalıtılmış (Şekil 2) yerleştirilir. Bu koruma, tüm kameralar ya da uygulamalar için gerekli değildir.

Protokol

Bitki Materyallerinin Hazırlanması 1.

1. Konu bitki materyali ya yaprakları veya tüm bitkiler (Hosta spp. Veya Phaseolus vulgaris) kullanın.

Buz Çekirdeklenme Aktif (INA) Bakteri İçeren Su Çözümleri 2. Hazırlık

1. Kültür INA bakteri Pseudomonas syringae 25 ° C Pseudomonas Agar F'ta petri kaplarına (soy Cit-7), üreticinin yönde 100% gliserol, 10 g / L ile hazırlandı.
2. Kültürler, 4 ° C 'de yeteri kadar yer büyüdü sonra gerekli ama buz nükleasyon aktivitesi yüksek düzeyde sağlamak için önce iki gün boyunca 4 ° C'de tutun kadar.
3. Tek kullanımlık bir plastik, ağarın yüzeyinden, tek bir levhadan bakteri Pençe ya da yeniden kullanılabilir metal bir spatula kullanımı ve yer zamanda iyonu giderilmiş su, 10-15 ml 25 ml'lik atılabilir bir küvet içinde. konsantrasyonu, ^· 1 x 10 ⁷ x 1 ila 10, ⁹ aralığında olmalıdır Ml ^-1. Çözelti bulanık görünecektir. Konsantrasyon sadece yaklaşık gerekirse bir hemasitometre veya spektrofotometre kullanılarak konsantrasyon onaylamak için gerek yoktur.
4. Bakteri dağıtmak için 10 saniyelik bir en az küvet vorteksleyin.
   Not: Elde edilen INA karışımın belirli bir konsantrasyonu önemli değildir ve açıklanan protokol buz nükleasyon aktivitesi yeterli düzeyden daha fazla verecektir. INA bakteri ve su Bu karışım çekirdeklenme deneylerde daha sonra kullanılacaktır.

3. Donma Deneme Oluşturma

1. Koruyucu akrilik kutusunun içindeki yüksek çözünürlüklü kızılötesi kamera (SC-660) yerleştirin, böylece kutunun önündeki açıklıktan mercek projeleri ve kutunun arka delikten bir dizüstü bilgisayar veya kayıt cihazı çıkmak için kamera bağlantı telleri . Kutunun kapağını sabitleyin ve bir yerde çevre odasında veya derin dondurucuda içine kutusu yerleştirmek tüm olacakow konu bitki materyali görülebilir.
   1. Yansıyan kızılötesi enerjiden girişimi önlemek için siyah inşaat kağıt ile odasının duvarlarını kaplayan bitki materyali etrafında karanlık bir arka plan sağlamak.
   2. Görünür dalga boylarında kayıt görüntüleri gerektiğinde ışık kaynağından ısıtma aza indirmek için LED aydınlatma ile odasını takınız. Bitkiler kamerası tarafından görünür olmasını böyle bir pille çalışan dolap ışığı veya diğer küçük led aydınlatma cihazı olarak sadece minimum, gereklidir.
      1. Konu bitki materyali görünür görüntüleri alınır sonra, LED aydınlatma kapatın. Bir liman ya da odasında diğer delikten kameraya tüm harici kablolu bağlantıları (bilgisayar firewire bağlantısı, güç kablosu, vb) dağıtın.
   3. Önlemek veya bölme içinde sıcaklık değişimleri azaltmak için köpük yalıtım malzemesi ile liman ya da açılış herhangi fazladan boşluk doldurun. 1 ° C'de odasının ilk sıcaklığını ayarlamak.
2. Bitki materyali kameranın görüş alanı görünümünde ve bitki materyali uzaktan izleme ekranında veya seçilen yazılımın içinde görünür şekilde bitkiler ya da bitki parçaları hizalayın.
3. Bitkiler önceden kontrollü bir dondurma deney başlamadan, bitki malzemesinin boyutuna bağlı olarak, 1 saat 30 dakika boyunca 1 ° C'de dengelenmeye bırakın. Bu donma deneyi başlatılır sonra bitkinin sıcaklığı birçok derece hava sıcaklığı gerisinde değil garanti eder. Bitkisel malzemenin sıcaklığı, hava sıcaklığı 0.5 ° C'lik bir fark dahilinde olduğunda Dengeleme elde edilir.
   1. Saksı bitkileri kullanılması durumunda saksı bitkileri toprak üstünde Strafor yalıtım katmanı yerleştirin. Bitkiler dengeye ulaştıktan sonra, bölmenin soğutma başlar.
      Not: pot toprak yüzeyinde yalıtım tabakası tesisi çevreleyen havaya pot devam ısı kaybı miktarını azaltır ve fre kökleri engellerezing, bu tipik olarak sebebiyle toprakta kalan ısı mevcut kitlesel deposuna doğada bir don olayı sırasında meydana olmaz.
4. 3.4.1-3.4.4 tartışıldığı gibi, istenen kamera parametrelerini (renk paleti, sıcaklık aralığı, belirli ilgi alanları, vb) ayarlayın.
   1. Canlı görüntüyü izlerken sıcaklık değişimlerini görüntülemek için gökkuşağı paleti seçin.
   2. Sadece yazılımı görüntüsünün altında bulunan sıcaklık çubuğunu ayarlayarak 5 ° C sıcaklık aralığını ayarlayın.
   3. Seçilen paleti (gökkuşağı) tarafından tanımlanan sahte renk görüntü içine kızılötesi verileri dönüştürmek için doğrusal ölçek (algoritma) seçin ve 5 ° C'ye sıcaklık aralığını ayarlamak ve resmin göre otomatik olarak izlemek için. Deney yapılırken Alternatif olarak, manuel ayar aralığını ayarlayın.
      1. Softw tarafından sağlanan ilgi tanımlanan alan içinde belirli bir noktaya sıcaklığını ya da ortalama sıcaklık kullanınbulunmaktadır. . Kaydedilen video dizisinden veya görüntü dosyasında gömülü bilgilerden tüm piksellerin sıcaklık verileri almak 3 ResearchIR yazılım içinden tipik bir ekran göstermektedir.
   4. Ilgi belirli bir noktayı temsil bitki dokusu üzerinde bir yere bir imleci yerleştirin. Noktalarında (boyutu 1 -3 piksel), kutular, çizgiler, elips ya da çevrelerin gibi ilgi alanını tanımlayın. Noktalarla şekiller çoklu kombinasyonları görüntünün üzerinde yer alabilir.
5. Bir video dizisi kaydetme
   1. 60 Hz ve kayıt elle durdurulması için kaydetmek için kamerayı ayarlayın.
   2. Kaydedilen video dosyası alınacaktır bilgisayara veya harici sürücüde yerini belirtin.
   3. Kayıt başlar.
      Not: büyük video dosyalarını oluşturulur çünkü harici sabit sürücüye kayıt şiddetle tavsiye edilir. Kaydedilen video dosyaları sonra KD içeren yalnızca bir bölümünü içerecek şekilde düzenlenebilircessary bilgiler. Bu büyük ölçüde dosya boyutunu azaltacaktır.
   4. 0.5 -1.0 ° C aşamalı odasının ısısını düşürün. Bitki sıcaklığı hava sıcaklığı ile equilibrates kadar bekleyin ve ardından 0.5-1.0 ° C tekrar sıcaklığını düşürmek. Bitki gözlemlenen dokusu ve morfolojisinin kütlesine bağlı olarak, dengeleme 10 dakika 15 alabilir. Bu nedenle, yaklaşık 4 ° C / saatlik bir soğutma hızını vermek.
   5. Bitki donuyor ve gözlemler tamamlanıncaya kadar bu şekilde devam edin. Dondurma işlemi tamamlandığında Kaydı bitirmek.
      Not: aynı sıcaklıkta olduğundan, bitki materyali ve arka plan rengi olduğunda, aynı bitki dokusu hava sıcaklığı ile dengelenmiş. Arka plan sıcaklığı ve bitki doku sıcaklığı aynı olduğundan, bu yeniden daha düşük sıcaklığa ve bitki doku ve a arasındaki sıcaklık farkı olana kadar, bitki malzemesinin görselleştirmek zor olabilirir sıcaklık.

Sonuçlar

Ice + bakteri buz çekirdeklendirici aktivitesi Pseudomonas syringae (suş Cit-7)

10 ul su damlası ve P. ihtiva eden su içinde 10 ul syringae (Cit-7), bir Hosta yaprağın alt yüzeyi üzerine yerleştirilmiştir (Hosta spp.) (Şekil 4). Gösterildiği gibi, INA bakteriler içeren su damlası, ilk dondu ve yaprak yüzeyi üzerindeki suyun damla donmamış kalırken dondurmak için yaprak indüklemek için sorumludur.

Tartışmalar

Kuyu, 0 ° C'nin altındaki sıcaklıklarda ve su oldukça değişken olabilir donacağı sıcaklığa süper-soğutmaya tabi yeteneğine sahiptir. Saf su ^süper-36 sıcaklık limiti yaklaşık -40 ° C'dir ve homojen çekirdekleşme noktası olarak tanımlanmaktadır. Sıcak sıcaklıklarda su donmakta daha -40 ° C ila daha sonra buz oluşumu ve büyümesi için bir katalizör olarak hizmet eden oluşturulması için küçük buz embriyolar etkinleştirmek çekirdek oluşturucularının heterojen va...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Infrared Camera	FLIR	SC-660	Many models available depending on application
Infrared Analytical Software	FLIR	ResearchIR 4.10.2.5	$3,500
Pseudomonas syringae (strain Cit-7)			Kindly provided by Dr. Steven Lindow, University of California  Berkeley icelab@berkeley.edu
Pseudomonas Agar F	Fisher Scientific	DF0448-17-1