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要約

We describe whole-animal imaging and flow cytometry-based techniques for monitoring expansion of antigen-specific CD8+ T cells in response to immunization with nanoparticles in a murine model of vaccination.

要約

Traditional vaccine adjuvants, such as alum, elicit suboptimal CD8+ T cell responses. To address this major challenge in vaccine development, various nanoparticle systems have been engineered to mimic features of pathogens to improve antigen delivery to draining lymph nodes and increase antigen uptake by antigen-presenting cells, leading to new vaccine formulations optimized for induction of antigen-specific CD8+ T cell responses. In this article, we describe the synthesis of a “pathogen-mimicking” nanoparticle system, termed interbilayer-crosslinked multilamellar vesicles (ICMVs) that can serve as an effective vaccine carrier for co-delivery of subunit antigens and immunostimulatory agents and elicitation of potent cytotoxic CD8+ T lymphocyte (CTL) responses. We describe methods for characterizing hydrodynamic size and surface charge of vaccine nanoparticles with dynamic light scattering and zeta potential analyzer and present a confocal microscopy-based procedure to analyze nanoparticle-mediated antigen delivery to draining lymph nodes. Furthermore, we show a new bioluminescence whole-animal imaging technique utilizing adoptive transfer of luciferase-expressing, antigen-specific CD8+ T cells into recipient mice, followed by nanoparticle vaccination, which permits non-invasive interrogation of expansion and trafficking patterns of CTLs in real time. We also describe tetramer staining and flow cytometric analysis of peripheral blood mononuclear cells for longitudinal quantification of endogenous T cell responses in mice vaccinated with nanoparticles.

概要

伝統的なワクチンの開発は、主に試行錯誤の経験的なアプローチを採用しています。しかし、生体材料および免疫活性化の分子決定の発見の広い配列の最近の開発と、それが合理的に病原体1,2に由来し、生物物理学的および生化学的な手がかりでワクチン製剤を設計することが可能になりました。具体的には、様々な粒子状薬物送達プラットフォームはリンパに存在する分解からワクチン成分を保護し、抗原提示細胞への抗原提示細胞（APC）を、それらの同時送達を増強、それらは、サブユニット抗原および免疫刺激剤と共ロードされるように、ワクチン担体として検討されていますノード（LNS）は、このように免疫刺激と活性化3-5を最大化します。以前に強力なワクチンplatforとして実証されている。この報告書では、我々は、「病原体模倣」ナノ粒子系の合成を記載呼ばれるinterbilayer架橋多層小胞（ICMVs）、強固な細胞傷害性Tリンパ球（CTL）および全身および粘膜組織区画6-9両方における体液性免疫応答の誘発のために、M。特に、ICMVsでのワクチン接種は、従来のアジュバントを用いたワクチン接種（ 例えば、ミョウバンとモンタニド）7と比較して、マラリア抗原に対して実質的に強化された血清IgGレベルを達成し、また、マウス9中の腫瘍細胞とウイルス攻撃モデルに対して強力なCTL応答を誘発しました。ここでは、モデルのワクチンナノ粒子系としてICMVsを使用して、我々は凍結切片組織7の共焦点イメージングを利用するのLNを排出する粒子径とゼータ電位測定と粒子輸送の追跡（dLNs）を含むワクチンナノ製剤の特徴付けのための方法を記載しています。また、我々は、ルシフェラーゼ発現抗原特異的CD8 + T細胞9,10の養子移入後のマウスにおけるCTL応答の展開を分析する全動物イメージングベースの方法を提示します。最後に、デナノ粒子6,9をワクチン接種したマウスにおける内因性のT細胞応答の長手方向の定量化のための末梢血単核細胞（PBMC）のスクライブテトラマー染色。

ICMVsその後、化学的にジチオール架橋剤6と脂質層内の架橋マレイミド官能化リン脂質頭部基によって安定化されている多層構造の中に簡単なリポソームの制御融合することにより合成脂質ベースのナノ粒子製剤です。 ICMVsが合成されると、ナノ粒子の小部分は、粒子サイズとゼータ電位動的光散乱（DLS）システムとゼータ電位アナライザーでの（ すなわち 、粒子の表面電荷）を決定するために使用することができます。 DLSは、拡散係数および粒子11の流体力学的サイズの決定を可能にする、粒子懸濁液の光散乱の変化を測定します。バッチからバッチ合成に一貫性の粒子サイズを達成することは非常に重要です以来、粒子サイズはdLNsおよびAPC 12,13によるその後の細胞取り込みにワクチン粒子のリンパ排水に影響を与える主な要因の一つです。また、ゼータ電位は、粒子と粒子表面電荷11の電気泳動移動度を決定することができる電流が印加された粒子の速度を測定することによって得ることができます。粒子の表面電荷は、貯蔵中およびin vivo投与後の14,15粒子分散液に直接影響するコロイド安定性を決定するため、粒子の一貫したゼータ電位値を確保することが重要です。 dLNsに粒子の局在化を追跡するために、ICMVsは、親油性染料と共有結合的にタグ化抗原を含む、所望のフルオロフォアで標識することができます。免疫化の後、マウスは、種々の時点で切除dLNsを安楽死させ凍結切片、および共焦点顕微鏡を用いて分析することができます。この技術は、リンパのDraIの可視化を可能にdLNsへのナノ粒子ワクチン担体および抗原の両方の寧。組織切片は、さらに、蛍光標識抗体で染色し、そのような我々は以前に7を示しているように胚中心の抗原および形成に関連する細胞の種類として、より多くの情報を得るために利用することができます。

粒子合成が最適化され、dLNsへトラフィッキングが確認されると、それは、 インビボ CTL拡張の誘発を検証することが重要です。ナノ粒子ワクチン接種に応答して、抗原特異的CD8 + T細胞の誘発を分析するために、我々は、詳細な免疫学的な分析を可能にOVA 257-264ペプチド（SIINFEKL）免疫優性CD8 + T細胞エピトープと、モデル抗原、オボアルブミン（OVA）を利用しています初期ワクチン開発16,17のための抗原特異的T細胞応答の。具体的には、抗原特異的CD8 + T細胞の増殖および移動の動態を調べるために、我々が生成しました（H-2K bの関連で）SIINFEKLに特異的なT細胞受容体（TCR）とCD8 + T細胞を有するOT-Iトランスジェニックマウスを用いて、ホタルルシフェラーゼを発現するトランスジェニックマウス（リュック）を交配することによって、二重トランスジェニックマウスモデル。これらのOT-I / Lucのマウスから、ルシフェラーゼを発現する、OT-I CD8 + T細胞を単離し、ナイーブC57BL / 6マウスへの養子移入のために調製することができます。播種後、OVA含有ナノ粒子で成功免疫は、動物全体のイメージングシステム9,10で生物発光シグナルを監視することによって追跡することができる転送T細胞の拡大をもたらします。この非侵襲的な全身イメージング技術は、長手方向の様式で末梢組織へのT細胞のリンパ組織の拡大と普及に関与するプロセスを明らかに、過去18〜20の他のウイルスまたは腫瘍抗原で使用されてきました。

養子移入の抗原特異的CD8 + T細胞の分析に相補的なendogeno米国T細胞応答が使用される、ワクチン接種は、4つのフルオロフォアタグ化MHCクラスI分子からなるペプチド-MHC四量体複合体は、ペプチドエピトープを負荷したペプチド-主要組織適合遺伝子複合体（MHC）四量体アッセイ21を用いて検査することができるポスト抗原特異的にTCRとラベルCD8 + T細胞に結合します。ペプチド-MHC四量体アッセイは、リンパ系および末梢組織中の抗原特異的CD8 + T細胞を同定するための端子剖検研究にまたは連続採血から得られた末梢血単核細胞（PBMC）と縦断的研究のいずれかで行うことができます。ペプチドMHC四量体でリンパ球を染色した後、フローサイトメトリー分析CTLの表現型またはCD8 + T細胞のうち、その頻度の定量に詳細な分析を行います。

プロトコル

このプロトコルで説明されているすべての実験は、ミシガン大学で動物の使用およびケアに関する大学委員会（UCUCA）によって承認され、確立されたポリシーとガイドラインに従って行いました。

ICMVsの1の合成とキャラクタリゼーションタンパク質抗原およびアジュバント分子との共同ロード

  1. - [4-（p個の -maleimidophenyl）ブチルアミド] 1,2- dioleoyl- SN -glycero -3-ホスホコリン（DOPC）および1,2- dioleoyl- SN -glycero-3-phosphoethanolamine- Nのモル比1：1を混ぜますのクロロホルム（MPB）、バッチ当たり1.26マイクロモルで合計脂質量を維持する（ すなわち、DOPC500μgのとMPBの630μgの）20mlのガラスバイアル（直径= 28ミリメートル、高さ= 61ミリメートル）で。
  2. 所望の濃度の脂質溶液に、モノホスホリルリピドA（MPLA）のような親油性薬物、または親油性染料（ 例えば、DID）を追加します。徹底的に余分な乾燥nitrogeでパージすることによって有機溶媒を除去Nガス及び真空O / Nの下でサンプルを置きます。
  3. 水溶性薬剤（ 例えば、タンパク質抗原）を含有する10mMのビス-トリスプロパン（BTP、pH7.0）中の200μLを加えることによって脂質膜を水和。 10秒室温で1時間ごとに10分間ボルテックス。
  4. 1.5 mlのマイクロチューブにガラスバイアルから内容を転送氷水浴中で場所のサンプル、および125 W / 20 kHzのプローブ先端の超音波処理器に設定40％の強度を用いて5分間連続して超音波処理します。
  5. 各バッチ（使用濃度2.4 mM）の、渦、および卓上マイクロ遠心を使用して簡単に遠心に150mMのジチオスレイトール（DTT）の4μlを添加します。
  6. 200 mMのCaCl 2を40μlを添加して、ピペット（使用濃度33 mM）のと混合。 DTTでの脂質層をMPB含有の架橋を可能にするために1時間37℃でサンプルをインキュベートします。
  7. 遠心分離機15分間20,000×gでのサンプル、上清を除去し、ddiH 2 Oの200μl中に再懸濁
  8. 上清からのCaCl 2、未反応のDTT、およびカプセル化されていない貨物の物質を除去するための第2のddiH 2 O洗浄後の手順を繰り返し、再び1.7遠心操作します。
  9. ddiH 2 Oで2 kDaのポリエチレングリコールチオール（PEG-SH）の10 mg / mlでの準備PEG-SH溶液100μlで各ICMVサンプルを再懸濁し、30分間37℃でインキュベートします。
  10. 2 ddiH 2 O回の洗浄（ステップ1.7）を実行し、4℃での最終的なICMVのPBSでペレットと店を懸濁します。粒子は、長期保存後に底に沈殿することができるように、使用ICMV懸濁液を混合する前に。
  11. 粒子の特徴付けのために、各バッチからICMVs少量の（〜10％）を除去し、ddiH 2 Oの1ミリリットルの全容量で個別に希釈DLSと（製造業者のプロトコルに従って）ゼータ電位測定システムを使用して試料のゼータサイザーセルと測定粒子径、多分散性指数、およびゼータ電位に単一のサンプルを置きます。

共焦点顕微鏡で蛍光タグ付きICMVsのリンパ節排出する2.検討

  1. フルオロフォアタグ付き抗原と親油性蛍光色素を負荷しICMVsの調製
    1. オボアルブミンなどのフルオロフォア標識タンパク質を、準備製造元の指示に従って、アレクサフルオロ555 - スクシンイミジルエステルと反応させました。
    2. 脂質シェルでフォアでタグ付けICMVsを製造するために、親油性蛍光色素（ 例えば、1,1'-ジオクタデシル-3,3,3 '、3'- Tetramethylindodicarbocyanine、（）DID）（脂質フィルムの製造中にステップを追加します1.2）0.05％モル脂質量で。脂質フィルムの水和（ステップ1.3）、フルオロフォアタグ付き抗原を含む使用バッファ、および完全なICMV合成の工程1.4から1.11に概説されるように。
  2. 尾の基部のナノ粒子の皮下投与
    1. 導入室Uを搭載した制御フロー気化器を用いてマウスを麻酔IACUCに応じて3％イソフルランと酸素流量の1.5 L /分をtilizingは、動物プロトコルを承認しました。マウスは無意識になると、注射部位への最適なアクセスを可能にし、動物に不快感を最小限に抑えるため、身に着けている麻酔に素早く前に次の手順を実行します。あるいは、麻酔を維持するために、適切なフィットノーズコーンを使用。マウスを、より長い5分間麻酔した場合は、手順後の刺激を最小限にするために必要な眼の潤滑を適用します。
    2. サニタイズと皮膚の下に針を視覚化するために使用することができます目に見える皮膚の小さなパッチを公開するために毛皮のパートに濡れた髪を濡らす70％エタノールで尾の付け根をスプレーします。
    3. PBSでワクチン接種量100μlのあたり抗原およびアジュバントの所望の量を含む粒子注入懸濁液（ 例えば、10μgのOVAと注入量100μlのあたり0.3μgのMPLAが過去6,9で使用されている）を準備します。
    4. 粒子懸濁int型を描きます27-29 G針を有するOA注射器と上向きにベベルと尾（生え際から〜5ミリメートル）の基部に針を挿入し、粒子懸濁液22の50μLを注入します。
    5. 過度の逆流を防止し、針を引き出すために均等に圧力を数秒待ちます。両方の排水鼠径LNををターゲットにするテールベースの​​反対側に注射を繰り返します。
  3. リンパ節の凍結切片を、共焦点顕微鏡での検査の準備。
    1. 動物プロトコルを承認しIACUCに応じて誘導され気胸に続くCO 2窒息でマウスを安楽死させます。 Bedoya 23で実証プロトコルに従って鼠径のLNを抽出し、4℃で1mlのPBSに組織を配置することによって、血液を洗い流します。
    2. 組織と組織からPBSを吸収し、組織cryomoldsで組織を置く（10×10×5ミリメートル3）10月は、媒体24を凍結してトップに予め充填されました。スナップTISを凍結します30秒間液体窒素中でブロックを訴えます。代わりに、30分間ドライアイス上で組織ブロックを配置します。 ℃の冷凍庫で-80凍結組織を保管してください。
    3. -20℃24に設定したクライオスタットに5〜10ミクロンの厚さの組織切片をカットします。
    4. 必要に応じて、免疫蛍光標識を行い、以前に示さ24と共焦点顕微鏡を用いて組織を調べます。

動物全体のイメージングとナノ粒子ワクチン接種後の抗原特異的、ルシフェラーゼを発現するCD8 + T細胞の3モニタリング拡張

  1. OT-I / LucをトランスジェニックマウスからのOVA特異的257-264、ルシフェラーゼを発現するCD8 + T細胞の単離
    1. CO 2窒息とOT-I /リュックトランスジェニックマウスを安楽死させると、動物のプロトコルを承認しIACUCに応じて気胸を誘発します。腹腔にアクセスし、慎重に膵臓23から組織を取り外して滅菌方法で脾臓を収穫し、組織培養フードに転送するために4℃でPBS + 2％FBS 5ml中の場所。
    2. （一度に3脾臓まで）50mlコニカル遠心分離管の上に70ミクロンのナイロンストレーナの脾臓を置きます。 3ミリリットルのシリンジからプランジャーを使用して、ストレーナを介して細胞を粉砕​​。
    3. PBS + 2％FBSでプランジャとストレーナーを洗浄し、廃棄します。 300×gで10分間、10ミリリットル/ 50 mlチューブで脾臓に全量を血球計数器で計数するために、細胞懸濁液の少量のサンプルを取り、遠心。
    4. 市販の磁気陰性選択キットを用い、製造者の指示に従って、CD8 + T細胞集団を単離します。
    5. PBSで細胞を洗浄した後、単離されたCD8 + T細胞の数を数えます。単離されたCD8 + T細胞の純度を評価するために、次にαCD8-APC抗体の20μlを添加、10分間マウスCD16 / 32抗体（0.025 mg / mlの）20μlに〜20,000〜30,000細胞をインキュベート（0.005 mg / mlの）そして30分間インキュベートします。ペーBSA w / vのrform PBS中4℃でのインキュベーションは全て+ 1％。フローサイトメトリー分析25を行います。
  2. 養子単離されたCD8 + T細胞の移動およびその拡張ワクチン接種後の可視化
    1. 静脈尾静脈注射22（日-1）を介して、200μlのPBS体積で1-10×10 5個の細胞を投与することによって、ナイーブC57BL / 6マウスに、単離されたOT-I /リュックCD8 + T細胞の養子移入を行います。マウスは剃毛アルビノC57BL / 6、C57BL / 6マウスにおいて、毛皮、黒皮パッチは、生物発光信号を妨害する可能性があることを考慮すると、これらの研究に最適です。
    2. 以前（2.2節）に記載のように1日（0日）後、ワクチンを投与します。
    3. 300μlのPBSの容量で腹腔内キロマウス体重あたりルシフェリン150mgのを管理します。 10分後、（ステップ2.2.1のように）をイソフルランでマウスを麻酔し、5〜10分間Wの生物発光シグナルを取得することによりOT-I / LucのCD8 + T細胞を可視化動物全体のイメージングシステムi番目（IVIS;詳細な指示のためにウィルソン26を参照）。長期的な研究のために必要に応じて繰り返します。

抗原特異的CD8 + T細胞の分析のためのPBMCの4ペプチドMHCテトラマー染色

注：以下のプロトコル手順は、養子養子移入することなく、OT-I / LucのCD8 + T細胞またはC57BL / 6マウスで転送C57BL / 6マウスのいずれかを用いて行うことができます。

  1. ワクチン接種後の所望の時点で、K 2 EDTAでコーティングされたチューブに顎下出血法27を介してマウスからの血液の約100μLの（4-6滴）を採取し、凝固を防止するために数回転倒。
  2. 、マイクロ遠心チューブに血液の100μLを移すの溶解緩衝液1mlを添加し、赤血球（RBC）を除去するために、2〜3分間インキュベートします。 1,500×gで5分間遠心分離サンプル、上清を除去します。ペレットがまだの場合（RBCの不完全な除去を示す）赤ppearsは、溶解バッファーの短時間のインキュベーション（<1分）で溶解工程を繰り返します。
  3. 5分間1,500×gで1（/ BSA V W PBS + 1％）のFACS緩衝液mlの遠心分離で、残りのPBMCを洗ってください。
  4. 吸引し上清と非特異的結合とのFcR媒介性の抗体をブロックするために、マウスCD16 / 32抗体（0.025 mg / mlの）の20μlのサンプルを再懸濁します。 RTで10分間インキュベートします。
  5. 4ミリリットル丸底FACSチューブに微小遠心管から細胞を転送します。各サンプルに、製造業者の仕様書に従って、OVA四量-SIINFEKL-PEの溶液 B、H-2Kの20μlを添加して、氷上で30分間インキュベートします。
  6. 抗体カクテルを準備する（ 例えば、αCD8-APC、αCD44-FITC、およびαCD62L-PECy7抗体（それぞれ0.005、0.005、0.002 mg / mlの濃度、））。各実験サンプルに20μl加え、氷上で20分間インキュベートします。ラにより、単一の蛍光体のコントロールを準備します上に示した濃度の各蛍光団タグ付き四量体または抗体で細胞をbeling。
  7. FACS緩衝液で2回洗浄し、DAPIを2μg/ mlを含有するFACS緩衝液中に最終ペレットを再懸濁します。細胞は現在、フローサイトメトリー分析（詳細と例はScheffold 25に記載されています）の準備ができています。

結果

ICMVsの合成に関与するステップは、図1~6に示されている。簡単に言えば、任意の親油性薬剤または蛍光色素を含む脂質膜は、親水性薬物の存在下で水和します。例えばCa 2+などの二価カチオンは、多重膜小胞にアニオン性のリポソームの融合を駆動するために添加されます。例えば、DTTなどのチオール架橋剤は、脂質層を並置の「ステープル」マレイミド官能化?...

ディスカッション

この資料に記載されているプロトコルは、新たな脂質ベースのナノ粒子系の合成および特徴付けを記載ICMVsと呼ばれる、抗原特異的CD8 + T細胞応答を誘導するために、ナノ粒子ベースのワクチン製剤の有効性を検証する方法を提供します。 ICMV合成は、典型的には、多くの場合の損失をもたらす、製造のための有機溶媒を必要とする他の一般的に使用されるポリマーナノ粒子システム（ 例え...

開示事項

パーキンエルマーは、この資料の出版物中に発生し、生産コストを提供しました。

謝辞

この研究は、米国立衛生研究所が1K22AI097291-01を付与することにより支持され、受賞数UL1TR000433下で国立衛生研究所のトランスレーショナル科学を前進させるための国立センターによるましました。また、MITの教授ダレルアーバインとワクチンナノ粒子とOT-I /リュックトランスジェニックマウスの初期の作品の彼らの貢献のためのフレッド·ハッチンソンがんセンター教授マティアスステファンを認めます。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
1. Synthesis and characterization of ICMVs co-loaded with protein antigen and adjuvant molecules
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[4-(p-maleimidophenyl)butyramide] (sodium salt) (MPB)Avanti Polar Lipids, INC.870012
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)Avanti Polar Lipids, INC.850375
Monophosphoryl Lipid A (Synthetic) (PHAD™) (MPLA)Avanti Polar Lipids, INC.699800
20 mL glass vialsWheaton0334125D
Symphny Vacuum OvenVWR414004-580
Ovalbumin (OVA)Worthington3054
Bis-Tris Propane (BTP)FisherBP2943
Q125 Sonicator (125W/20kHz)QsonicaQ125-110
Dithiothreitol (DTT)FisherBP172
2 kDa Thiolated Polyethylene Glycol (PEG-SH)Laysan BioMPEG-SH-2000-1g
Malvern ZetaSizer Nano ZSP Malvern
ZetaSizer CuvettesMalvernDTS1070
2. Examination of lymph node draining of fluorescence-tagged ICMVs with confocal microscopy
1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindodicarbocyanine, 4-Chlorobenzenesulfonate Salt (DID)Life TechnologiesD-7757
Alexa Fluor 555-succinimidyl ester (AF555-NHS)Life TechnologiesA37571
Tissue-Tek OCT freezing medium VWR25608-930
Tissue CryomoldsVWR25608-922
3. Monitoring expansion of antigen-specific, luciferase-expressing CD8+ T cells after nanoparticle vaccination with whole animal imaging
C57BL/6 miceJackson000664
Albino C57BL/6 miceJackson000058
OT-1 C57BL/6 miceJackson003831
70 μm nylon strainerBD352350
EasySep™ Mouse CD8+ T Cell Isolation KitStemCell19853
IVIS® whole animal imaging systemPerkin Elmer
4. Peptide-MHC tetramer staining of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) for flow cytometric analysis of antigen-specific CD8+ T cells
K2EDTA tubesBD365974
ACK lysis bufferLife TechnologiesA10492-01 
Anti-CD16/32 Fc BlockEbioscience14-0161-86
H-2Kb OVA TetramerMBLTS-5001-1C
Anti-CD8-APCBD553031
Anti-CD44-FITCBD553133
Anti-CD62L-PECy7Ebioscience25-0621-82
4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI)SIGMAD8417-10MG
CyAn Flow CytometerBeckman Coulter
FlowJo SoftwareFlowJo

参考文献

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