Imagerie animal entier et cytométrie de flux techniques pour T CD8 + Analyse des réponses spécifiques de l'antigène de cellule après nanoparticules vaccination

Résumé

We describe whole-animal imaging and flow cytometry-based techniques for monitoring expansion of antigen-specific CD8+ T cells in response to immunization with nanoparticles in a murine model of vaccination.

Résumé

Traditional vaccine adjuvants, such as alum, elicit suboptimal CD8+ T cell responses. To address this major challenge in vaccine development, various nanoparticle systems have been engineered to mimic features of pathogens to improve antigen delivery to draining lymph nodes and increase antigen uptake by antigen-presenting cells, leading to new vaccine formulations optimized for induction of antigen-specific CD8+ T cell responses. In this article, we describe the synthesis of a “pathogen-mimicking” nanoparticle system, termed interbilayer-crosslinked multilamellar vesicles (ICMVs) that can serve as an effective vaccine carrier for co-delivery of subunit antigens and immunostimulatory agents and elicitation of potent cytotoxic CD8+ T lymphocyte (CTL) responses. We describe methods for characterizing hydrodynamic size and surface charge of vaccine nanoparticles with dynamic light scattering and zeta potential analyzer and present a confocal microscopy-based procedure to analyze nanoparticle-mediated antigen delivery to draining lymph nodes. Furthermore, we show a new bioluminescence whole-animal imaging technique utilizing adoptive transfer of luciferase-expressing, antigen-specific CD8+ T cells into recipient mice, followed by nanoparticle vaccination, which permits non-invasive interrogation of expansion and trafficking patterns of CTLs in real time. We also describe tetramer staining and flow cytometric analysis of peripheral blood mononuclear cells for longitudinal quantification of endogenous T cell responses in mice vaccinated with nanoparticles.

Introduction

Développement traditionnel de vaccin a principalement utilisé l'approche empirique de l'essai-erreur. Cependant, avec le développement récent d'un large éventail de biomatériaux et de découverte de déterminants moléculaires de l'activation immunitaire, il est maintenant possible de concevoir rationnellement des formulations de vaccins avec des indices biophysiques et biochimiques dérivées d'agents pathogènes ^1,2. En particulier, diverses plates-formes de distribution de médicaments particulaires ont été examinés en tant que supports de vaccins, car ils peuvent être co-chargés avec des antigènes de sous-unités et agents immunostimulants, protéger les composants du vaccin contre la dégradation, et de renforcer leur collaboration livraison à cellules présentatrices d'antigène (CPA) résidant dans la lymphe nœuds (LNS), maximisant ainsi la stimulation et l'activation immunitaire ^3-5. Dans ce rapport, nous décrivons la synthèse d'un système de nanoparticules "pathogène imitant", appelé interbilayer réticulé vésicules multilamellaires (ICMVs), qui ont déjà été démontrées comme un platfor de vaccin puissantm pour le déclenchement de solide lymphocytes T cytotoxiques (CTL) et des réponses immunitaires humorales dans les deux compartiments de tissus muqueux et systémiques ^9.6. En particulier, la vaccination avec ICMVs atteint des niveaux d'IgG sérique sensiblement améliorée contre un antigène de la malaria, par rapport à la vaccination avec des adjuvants classiques (par exemple, l'alun et Montanide) ⁷ et également provoqué des réponses CTL puissantes contre les cellules tumorales et des modèles de provocation virale chez la souris ^9. Ici, en utilisant ICMVs comme un système de nanoparticules de vaccin de modèle, nous décrivons des procédés de caractérisation de vaccins nano-formulations, y compris la taille des particules et des mesures de potentiel zêta et le suivi du trafic de particule de ganglions drainants (DLNS) en utilisant l'imagerie confocale des tissus cryosectioned ^7. En outre, nous présentons une méthode d'analyse de l'expansion de réponses CTL chez des souris après le transfert adoptif de lymphocytes T CD8 + spécifiques de l'antigène exprimant la luciférase basé ^{9,10-imagerie-ensemble} des animaux. Enfin, nous avons describe coloration tétramère de cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC) pour la quantification longitudinal de réponses de cellules T endogènes dans les souris vaccinées avec des nanoparticules ^6,9.

ICMVs sont une formulation de nanoparticules à base de lipides synthétisés par fusion contrôlée de liposomes multilamellaires à des structures simples, qui sont ensuite stabilisés chimiquement par des groupes de reticulation tête de phospholipides à fonction maléimide à l'intérieur de couches lipidiques avec des agents de reticulation ⁶ dithiol. Une fois ICMVs sont synthétisés, une petite fraction de nanoparticules peut être utilisée pour déterminer la taille des particules et le potentiel zêta (c.-à-charge de surface des particules) d'un système de diffusion de lumière dynamique (DLS) et un analyseur potentiel zêta. DLS mesure les changements dans la diffusion de lumière dans des suspensions de particules, permettant de déterminer le coefficient de diffusion et la taille hydrodynamique des particules ^11. Atteindre la taille des particules cohérente de lot à la synthèse des lots est essentielleétant donné que la taille des particules est un des principaux facteurs qui influent sur ​​le drainage lymphatique de particules de vaccin à DLNS et l'absorption cellulaire ultérieur par des APC ^12,13. En outre, le potentiel zêta peut être obtenue par mesure de la vitesse des particules quand un courant électrique est appliqué, ce qui permet la détermination de la mobilité électrophorétique des particules et la surface de la charge particulaire ^11. Assurer des valeurs de potentiel zêta de particules cohérentes est important car la charge de surface des particules détermine la stabilité colloïdale, ce qui a un impact direct sur ​​la dispersion de particules pendant le stockage et après l'administration in vivo ^14,15. Afin de suivre la localisation des particules à DLNS, ICMVs peuvent être marquées par des fluorophores désirés, y compris les colorants lipophiles et les antigènes de façon covalente-marqués. Après immunisation, les souris peuvent être euthanasiés à différents points dans le temps, DLNS réséqués, cryosectioned, et analysées par microscopie confocale. Cette technique permet de visualiser drai lymphatiquening des deux porte-vaccins de nanoparticules et de l'antigène à DLNS. Les sections de tissu peuvent en outre être colorés avec des anticorps marqués par fluorescence et utilisé pour obtenir plus d'informations, tels que les types de cellules associées à l'antigène et la formation de centres germinatifs comme nous l'avons indiqué précédemment ^7.

Une fois la synthèse des particules est optimisée et le trafic aux DLNS est confirmé, il est important de valider le déclenchement de l'expansion dans vivo de CTL. Afin d'analyser le déclenchement des cellules spécifiques de l'antigène T CD8 + en réponse à la vaccination de nanoparticules, nous avons utilisé un antigène modèle, l'ovalbumine (OVA), avec de l'OVA _257-264 peptide (SIINFEKL) d'un epitope immunodominant de cellule T CD8 +, ce qui permet des analyses immunologiques détaillées des réponses de cellules T spécifiques de l'antigène pour ^16,17 initiale de développement d'un vaccin. En particulier, pour interroger la dynamique d'expansion et de la migration des cellules spécifiques de l'antigène T CD8 +, nous avons généré unmodèle de la double-souris transgénique en traversant la luciférase de luciole exprimant souris transgéniques (Luc) avec des souris transgéniques OT-I qui possèdent des cellules avec le récepteur des cellules T (TCR) spécifique pour SIINFEKL (en association avec H-2K ^b) T CD8 +. A partir de ces souris OT-I / Luc, exprimant la luciférase, les cellules OT-I T CD8 + peuvent être isolées et préparées pour le transfert adoptif dans des souris C57BL / 6 naïves. Une fois ensemencée, l'immunisation réussie avec des nanoparticules contenant OVA se traduira par l'expansion des cellules T transférées, qui peuvent être suivis en surveillant le signal de bioluminescence avec un ensemble de ^9,10 Système d'imagerie par animal. Cette technique d'imagerie du corps entier non invasif a été utilisé avec d'autres antigènes viraux ou tumoraux dans le passé ^{18 à 20,} les processus impliqués dans l'expansion des cellules T dans les tissus lymphoïdes et la diffusion dans les tissus périphériques de manière longitudinale révélateur.

Complémentaire à l'analyse des adoptive cellules spécifiques de l'antigène transférés T CD8 +, endógenoles réponses des lymphocytes nous T après la vaccination peut être examiné avec le complexe peptide-complexe majeur d'histocompatibilité (CMH) de dosage de tétramère ^21, dans lequel un complexe tétramère peptide-CMH, composé de quatre fluorophore marqués MHC-molécules de classe I chargé avec des epitopes peptidiques, est utilisé à lier le TCR et l'étiquette des cellules T CD8 + d'une manière spécifique à un antigène. L'essai de tétramère MHC-peptide peut être effectuée soit dans des études d'autopsie terminaux afin d'identifier les cellules T CD8 + spécifiques de l'antigène dans les tissus périphériques et lymphoïde ou dans des études longitudinales avec des cellules mononucléaires de sang périphérique (PBMC) obtenues à partir de sang en série tire. Après coloration des lymphocytes avec un peptide tétramère MHC, la cytométrie en flux analyse est effectuée pour des analyses détaillées sur le phénotype des CTL ou la quantification de leur fréquence chez les cellules T CD8 +.

Protocole

Toutes les expériences décrites dans le présent protocole ont été approuvés par le Comité de l'Université sur l'utilisation et l'entretien des animaux (UCUCA) à l'Université du Michigan et réalisés selon les politiques et les lignes directrices établies.

1. Synthèse et caractérisation de ICMVs Co-chargé avec de la protéine antigène et adjuvant Molécules

1. Mélanger 1: 1 de rapport molaire de 1,2-dioleoyl- sn-glycéro-3-phosphocholine (DOPC) et de 1,2-dioleoyl- sn-glycéro-3-phosphoethanolamine- N - [4- (p -maleimidophenyl) butyramide] (MPB) dans du chloroforme, en maintenant la quantité de lipides totaux à 1,26 umol par lot (par exemple, 500 pg de DOPC et 630 ug de MPB) dans un flacon en verre de 20 ml (diamètre = 28 mm et hauteur = 61 mm).
2. Ajouter médicaments lipophiles, tels que le monophosphoryl lipide A (MPLA) ou des colorants lipophiles (par exemple, a fait), à la solution de lipides à la concentration souhaitée. Bien enlever le solvant organique par purge à nitroge extra-secn gaz et plaçant les échantillons sous vide O / N.
3. Hydrater le film de lipide par addition de 200 ul de 10 mM de bis-tris propane (BTP, pH 7,0) contenant des médicaments solubles dans l'eau (par exemple, des antigènes de protéines). Vortex pendant 10 secondes toutes les 10 minutes pendant 1 heure à température ambiante.
4. Transférer le contenu du flacon en verre dans un tube de 1,5 ml, placer les échantillons dans un bain d'eau glacée, et soniquer en continu pendant 5 min en utilisant le réglage sur une 125 W / 20 kHz pointe de sonde sonicator intensité de 40%.
5. Ajouter 4 pi de dithiothréitol 150 mM (DTT) à chaque lot (concentration de travail de 2,4 mM), vortex et centrifuger brièvement en utilisant une microcentrifugeuse de table.
6. Ajouter 40 ul de 200 mM de _CaCl2 et mélanger avec la pipette (concentration de travail de 33 mm). Incuber les échantillons à 37 ° C pendant 1 heure pour permettre la réticulation du MPB-contenant des couches lipidiques avec la TNT.
7. Centrifuger les échantillons à 20000 g pendant 15 min, retirer le surnageant et remettre en suspension dans 200 pi de ddiH ₂ O.
8. Répétez l'étape 1.7 et centrifuger à nouveau après le deuxième ddiH ₂ O lavage pour éliminer CaCl _2, qui n'a pas réagi de la TNT, et des matériaux de fret non encapsulées à partir du surnageant.
9. Préparer 10 mg / ml de 2 kDa polyéthylène glycol-thiol (PEG-SH) en ddiH ₂ O. Remettre en suspension chaque échantillon ICMV dans 100 ul de solution de PEG-SH et incuber à 37 ° C pendant 30 min.
10. Effectuer deux ddiH ₂ O lavages (étape 1.7) et remettre le culot ICMV finale dans PBS et conserver à 4 ° C. Avant l'utilisation, mélanger la suspension ICMV, comme des particules peuvent se déposer au fond après un stockage prolongé.
11. Pour la caractérisation de particules, retirer une petite quantité aliquote (~ 10%) du ICMVs de chaque lot individuel et diluer à un volume total de 1 ml de ddiH ₂ O. Placer un échantillon unique dans une cellule Zetasizer taille et la mesure des particules, l'indice de polydispersité, et le potentiel zêta des échantillons en utilisant un système DLS et de mesure de potentiel zêta (selon le protocole du fabricant).

2. Examen des ganglions lymphatiques Evacuation des ICMVs fluorescence étiqueté avec la microscopie confocale

1. Préparation de ICMVs chargé avec un antigène marquée par un fluorophore et un colorant fluorescent lipophile
   1. Préparer fluorophore protéine à marquage, tel que mis à réagir avec de l'ovalbumine Alexa Fluor 555-succinimidyl ester, selon les instructions du fabricant.
   2. Pour préparer ICMVs marqués avec fluorophore dans l'enveloppe lipidique, ajouter lipophile colorant fluorescent, (par exemple, 1,1 dioctadécyl-3,3,3 ', 3'-Tetramethylindodicarbocyanine, (DID)) pendant la préparation du film lipidique (Étape 1.2) à 0,05% quantité de lipides molaire. Pour le film lipidique hydratation (Étape 1.3), tampon d'utilisation contenant l'antigène marquée par un fluorophore, et la synthèse de ICMV complète telle que décrite dans les étapes 1.4 à 1.11.
2. Administration sous-cutanée de nanoparticules à base de la queue
   1. Anesthésier la souris au moyen d'un évaporateur à flux contrôlé équipé d'une chambre d'induction utilizing 3% d'isoflurane et 1,5 l / min de débit d'oxygène selon l'une IACUC a approuvé le protocole de l'animal. Une fois que la souris est inconscient, effectuez les étapes suivantes rapidement avant l'anesthésie se dissipe pour permettre un accès optimal au site de l'injection et de minimiser l'inconfort à l'animal. Vous pouvez également utiliser un cône de nez bon raccord pour maintenir l'anesthésie. Si les souris sont anesthésiées pendant plus de 5 minutes, appliquer du lubrifiant nécessaire de minimiser l'irritation de l'oeil après l'intervention.
   2. Pulvériser la base de la queue avec 70% d'éthanol pour désinfecter et mouiller la fourrure partie les cheveux mouillés pour exposer une petite parcelle de peau visible, qui peut être utilisé pour visualiser l'aiguille sous la peau.
   3. Préparez particule suspension injectable contenant la quantité désirée de l'antigène et de l'adjuvant pour 100 ul de dose de vaccination dans du PBS (par exemple, 10 pg d'OVA et 0,3 ug MPLA pour 100 ul de dose d'injection a été utilisé dans le passé ^{de 6,9).}
   4. Dessinez le int suspension de particulesoa seringue avec une aiguille 27-29 G et insérer l'aiguille à la base de la queue (~ 5 mm de la racine des cheveux) avec le biseau vers le haut et injecter 50 pi de la suspension de particules ^22.
   5. Attendez quelques secondes pour que la pression pour égaliser à prévenir tout refoulement excessive et retirez l'aiguille. Répéter l'injection de l'autre côté de la base de la queue de cibler les ganglions inguinaux de drainage.
3. Préparation des lymphatiques cryosections de noeuds et de l'examen par microscopie confocale.
   1. Euthanasier la souris avec CO ₂ asphyxie, suivie d'un pneumothorax induite selon un IACUC approuvé le protocole de l'animal. Extrait ganglions inguinaux selon le protocole démontré dans Bedoya ²³ et laver le sang en plaçant les tissus dans 1 ml de 4 ° C PBS.
   2. Absorber le PBS à partir des tissus avec les tissus et les placer dans le tissu cryomoules de tissus (10 x 10 x 5 mm ³⁾ pré-remplie à ras OCT milieu de congélation ^24. Aligner geler le tispoursuivre bloc dans l'azote liquide pendant 30 sec. Sinon, placez bloc de tissu sur glace sèche pendant 30 min. Stockez tissu congelé à -80 ° C dans le congélateur.
   3. Couper des sections de tissus 5-10 um d'épaisseur dans un cryostat fixé à -20 ° C ^24.
   4. Si nécessaire, effectuez l'étiquetage d'immunofluorescence, et d'examiner le tissu avec la microscopie confocale comme précédemment démontré ^24.

3. Suivi Expansion de l'antigène spécifique, la luciférase exprimant T CD8 + après vaccination avec des nanoparticules entier imagerie animale

1. Isolement de _OVA257-264 spécifique de cellules de luciférase exprimant CD8 + T de souris transgénique OT-I / Luc
   1. Euthanasier une souris transgénique OT-I / Luc avec CO ₂ asphyxie et d'induire un pneumothorax selon un IACUC approuvé le protocole de l'animal. Récolter la rate d'une manière stérile en accédant à la cavité péritonéale et soigneusement détacher le tissu du pancréas ^23, etdans 5 ml de PBS à 4 ° C + 2% de FBS pour le transfert de la culture de tissus capot.
   2. Placer la rate sur un tamis en nylon de 70 pm sur un tube de centrifugation conique de 50 ml (jusqu'à 3 rates à la fois). L'utilisation d'un plongeur d'une seringue de 3 ml, broyer les cellules à travers le tamis.
   3. Laver le piston et la crépine avec PBS + 2% de FBS et le jeter. Porter le volume total à 10 ml / rate dans le tube de 50 ml, prendre un petit échantillon de la suspension cellulaire de compter avec un hémocytomètre, et centrifuger pendant 10 min à 300 x g.
   4. Utilisation d'un kit disponible dans le commerce de sélection négative magnétique, isoler la population de cellules T CD8 + en suivant les instructions du fabricant.
   5. Après avoir lavé les cellules avec du PBS, compter le nombre de cellules T CD8 + isolées. Afin d'évaluer la pureté des cellules T CD8 + isolées, incuber ~ 20.000-30.000 cellules dans 20 ul de CD16 de souris / anticorps 32 (0,025 mg / ml) pendant 10 min, puis ajouter 20 ul d'anticorps αCD8-APC (0,005 mg / ml) et incuber pendant 30 min. Perform toutes les incubations à 4 ° C dans du PBS + 1% p / v de BSA. Effectuer flux analyse cytométrique ^25.
2. Le transfert adoptif de lymphocytes T CD8 + isolés et la visualisation de leur vaccination l'expansion de poste
   1. Effectuer le transfert adoptif de cellules isolées OT-I / Luc T CD8 + naïfs en C57BL / 6 souris par administration de 1 à 10 x 10 ⁵ cellules dans un volume de 200 ul de PBS par voie intraveineuse via la queue injection dans la veine ²² (jour -1). Considérant que la fourrure et de la peau noire correctifs dans C57BL / 6 peut interférer avec le signal de bioluminescence, albinos rasé souris C57BL / 6 sont idéales pour ces études.
   2. Après une journée (jour 0), administrer le vaccin comme décrit précédemment (section 2.2).
   3. Administrer 150 mg de luciférine par kg de poids corporel de la souris par voie intraperitoneale dans un volume de 300 ul de PBS. Après 10 min, anesthésier les souris avec l'isoflurane (comme à l'étape 2.2.1) et visualiser les cellules OT-I / Luc T CD8 + par l'acquisition du signal de bioluminescence pendant 5-10 min wvec tout un système d'imagerie animale (IVIS; se référer à Wilson ²⁶ pour des instructions détaillées). Répéter au besoin pour les études longitudinales.

Les cellules T CD8 + peptide-CMH 4. La coloration tétramère de PBMC pour l'analyse de l'antigène-spécifiques

Remarque: La procédure de protocole qui suit peut être effectuée en utilisant soit des souris C57BL / 6 avec des cellules transférées de manière adoptive OT-I / Luc T CD8 + ou des souris C57BL / 6 sans le transfert adoptif.

1. A un point de temps souhaité après la vaccination, de recueillir environ 100 pi de sang (4-6 gouttes) de souris via submandibular technique de saignements ²⁷ dans un tube revêtu de K ₂ EDTA et inverser plusieurs fois pour empêcher la coagulation.
2. Transférer 100 ul de sang dans un tube à centrifuger, ajouter 1 ml de tampon de lyse, et incuber pendant 2 à 3 min pour éliminer les globules rouges (hématies). Centrifuger les échantillons pendant 5 min à 1500 xg et retirer le surnageant. Si la pastille encoreppears rouges (indiquant une élimination incomplète des globules rouges), répéter l'étape de lyse avec une brève incubation (<1 min) de tampon de lyse.
3. Laver les PBMC restantes avec 1 ml de tampon FACS (PBS + 1% p / v de BSA) et centrifuger à 1500 g pendant 5 min.
4. Aspirer le surnageant et remettre en suspension l'échantillon dans 20 pi de CD16 / 32 anticorps de souris (0,025 mg / ml) pour bloquer la liaison non spécifique d'anticorps et à médiation par FcR. Incuber pendant 10 min à température ambiante.
5. Transfert cellules de microtubes en 4 ml tubes FACS à fond rond. Ajouter 20 pi de H-2K ^b solution OVA Tétramère-SIINFEKL-PE selon les spécifications du fabricant pour chaque échantillon et incuber pendant 30 min sur la glace.
6. Préparer le cocktail d'anticorps (par exemple, αCD8-APC, αCD44-FITC, et αCD62L-PECy7 anticorps (0,005, 0,005 et 0,002 mg / ml concentration, respectivement)). Ajouter 20 ul à chaque échantillon expérimental, et incuber pendant 20 min sur de la glace. Préparer des témoins fluorophores simples par laBeling cellules avec chaque anticorps tétramère ou fluorophore marqués à la concentration indiquée ci-dessus.
7. Laver deux fois avec du tampon FACS et remettre en suspension le culot final dans du tampon FACS contenant 2 ug / ml de DAPI. Les cellules sont maintenant prêts pour l'analyse par cytométrie en flux (détails et des exemples peuvent être trouvés dans Scheffold ^25).

Résultats

Les étapes impliquées dans la synthèse de ICMVs sont illustrés sur la figure 1 ^6. En bref, un film lipidique contenant des médicaments lipophiles ou des colorants fluorescents est hydraté en présence de médicaments hydrophiles. Les cations divalents, tels que Ca2 ^+, sont ajoutés pour conduire la fusion de liposomes anioniques dans des vésicules multilamellaires. Dithiol agent de reticulation, tel que le DTT, est ajoutée aux lipides à fonction maléimide "discontinu...

Discussion

Le protocole fourni dans cet article décrit la synthèse et la caractérisation d'un nouveau système de nanoparticules à base de lipides, appelé ICMVs, et fournit le processus de validation efficacité des formulations de vaccins à base de nanoparticules à induire CD8 + réponses des lymphocytes T spécifiques de l'antigène. Synthèse ICMV est terminée dans tous les état ​​aqueuse, qui est un avantage majeur par rapport aux autres systèmes couramment utilisés polymères de nanoparticules (par ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1. Synthesis and characterization of ICMVs co-loaded with protein antigen and adjuvant molecules
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[4-(p-maleimidophenyl)butyramide] (sodium salt) (MPB)	Avanti Polar Lipids, INC.	870012
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)	Avanti Polar Lipids, INC.	850375
Monophosphoryl Lipid A (Synthetic) (PHAD™) (MPLA)	Avanti Polar Lipids, INC.	699800
20 mL glass vials	Wheaton	0334125D
Symphny Vacuum Oven	VWR	414004-580
Ovalbumin (OVA)	Worthington	3054
Bis-Tris Propane (BTP)	Fisher	BP2943
Q125 Sonicator (125W/20kHz)	Qsonica	Q125-110
Dithiothreitol (DTT)	Fisher	BP172
2 kDa Thiolated Polyethylene Glycol (PEG-SH)	Laysan Bio	MPEG-SH-2000-1g
Malvern ZetaSizer Nano ZSP	Malvern
ZetaSizer Cuvettes	Malvern	DTS1070
2. Examination of lymph node draining of fluorescence-tagged ICMVs with confocal microscopy
1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindodicarbocyanine, 4-Chlorobenzenesulfonate Salt (DID)	Life Technologies	D-7757
Alexa Fluor 555-succinimidyl ester (AF555-NHS)	Life Technologies	A37571
Tissue-Tek OCT freezing medium	VWR	25608-930
Tissue Cryomolds	VWR	25608-922
3. Monitoring expansion of antigen-specific, luciferase-expressing CD8+ T cells after nanoparticle vaccination with whole animal imaging
C57BL/6 mice	Jackson	000664
Albino C57BL/6 mice	Jackson	000058
OT-1 C57BL/6 mice	Jackson	003831
70 μm nylon strainer	BD	352350
EasySep™ Mouse CD8+ T Cell Isolation Kit	StemCell	19853
IVIS® whole animal imaging system	Perkin Elmer
4. Peptide-MHC tetramer staining of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) for flow cytometric analysis of antigen-specific CD8+ T cells
K2EDTA tubes	BD	365974
ACK lysis buffer	Life Technologies	A10492-01
Anti-CD16/32 Fc Block	Ebioscience	14-0161-86
H-2Kb OVA Tetramer	MBL	TS-5001-1C
Anti-CD8-APC	BD	553031
Anti-CD44-FITC	BD	553133
Anti-CD62L-PECy7	Ebioscience	25-0621-82
4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI)	SIGMA	D8417-10MG
CyAn Flow Cytometer	Beckman Coulter
FlowJo Software	FlowJo