Method Article
高解像度融解分析は、不均一な集団中の単一塩基多型を区別する能力を提供するが、変異対立遺伝子の増幅偏りは、試料内の比較的低い割合で存在する対立遺伝子を検出する能力を高めることができます。このプロトコルは、高分解能融解分析の感度を向上させる改良が記載されています。
撲滅活動の数十年にもかかわらず、マラリアは世界的な負担のまま。地域除去し、グローバル撲滅の最近の新たな関心は、抗マラリア薬に対する感受性の低下に関連する地理的集団の特性だけでなく、変形を含むマラリアの原因とマラリア原虫寄生虫種、約増加ゲノム情報を伴っています。
一つの共通の遺伝的変異、一塩基多型(SNP)は、寄生虫の遺伝子型決定のための魅力的な標的を提供しています。これらのマーカーは、薬剤耐性マーカーを追跡するならず、薬物または他の選択的圧力下でマーカーを用いて寄生虫集団を追跡するだけでなく、有用です。
SNPの遺伝子型決定法は、薬物耐性を追跡するだけでなく、特にeliminatに近づい地域におけるマラリアコントロールの努力に応じて、人口の監視のため、個々の寄生虫を指紋する能力を提供しますイオン状態。
有益なSNPは、特定の遺伝子型決定技術にとらわれないことが確認されているが、高解像度融解(HRM)分析は、フィールドベースの研究に特に適しています。単一標識プローブの個々のSNPを必要とし、複数のゲノム(polygenomic)を含有する試料中のSNPを検出するために、せいぜい10%の感度を提供し、標準的な蛍光プローブベースの方法に比べて、HRMは、2〜5%の感度を提供しています。マイナーアレルの増幅に向けて、このようなブロックされたプローブおよび非対称のプライマー濃度だけでなく、バイアスPCRに増幅アニーリング温度の最適化などのHRMへの変更、さらにHRMの感度を高めます。感度の向上は、特定のアッセイに依存するが、我々は、マイナーな対立遺伝子の1%未満に検出感度が増加しています。
マラリア撲滅に近づい地域では、新興またはインポート薬剤耐性の早期発見は、広報のために不可欠ですOmpT応答。同様に、polygenomic感染を検出し、不可解な地元の貯水池からのインポート寄生虫の種類を区別する能力は、制御プログラムに通知することができます。
この原稿は、患者サンプル中のpolygenomic感染を識別するために、その感度を向上させる高解像度融解技術への変更について説明します。
マラリアコントロールと撲滅で新たな関心にもかかわらず、マラリアはサハラ以南のアフリカ1において、特に子供、感染の危険性のある世界の人口の半分近く、年間以上55万死亡で、世界的な負担のまま。
これらの新しいコントロールと撲滅プログラムは、配列決定マラリア原虫の大規模な数字で、ゲノムルネッサンスでサポートされていると減少し、薬剤感受性に関連する変異のために分析されている、人口特性2,3のため、毒性を増加させました。一塩基多型(SNP)は、最も一般的に同定された遺伝的変異体4-7の間です。
ポータブルSNPの遺伝子型決定法は、オンサイトとリアルタイム人口監視および追跡8提供しています。個々の寄生虫をフィンガープリントに加えて、「分子バーコード」はまた、対立遺伝子頻度の劇的な時間的なずれを検出するために使用されますだけでなく、分散などの感染9の人口規模と複雑さに有効。
有益なSNPのこのセットは簡単に多くのジェノタイピング・プラットフォームに適合されているが、高解像度は(HRM)の分析は特に敏感と簡単な操作と低コストで新たな変異の検出は、配列決定及び他のと比べて研究を、ベースのフィールドによく適している溶融しますアプローチは資源の乏しい設定で魅力的です。
HRMは、蛍光色素を組み込んだ標準的なポリメラーゼ連鎖反応(PCR)で始まります。ポストPCR融解分析は、ピークアンプリコンの融解温度を決定します。短いアンプリコン内の単一のSNPの差は、実質的なピーク融解温度(Tm)の違いをもたらすことができます。
この方法のいくつかの改良が(クラスIV(AT)のSNPを含むSNPを区別し、存在する複数の対立遺伝子を有する試料中のマイナーな突然変異対立遺伝子を検出するために、より良い遺伝子型判定の解像度を提供するポリGenomic感染)。まず、アッセイは、異なる濃度で存在するプライマーを順方向および逆方向に加えて、SNP領域の上に中心短いプローブを組み込みます。これらのブロックされたプローブは、プローブによるテンプレート産物の産生を増加させる非対称のプライマー濃度にPCR中に増幅するが、過剰に産生さ鎖に結合しています。過剰鋳型鎖に結合したプローブからなるこれらの独立した二本鎖アンプリコンは〜20〜30塩基対です。彼らは大幅に10のミスマッチ単一または複数の基地プローブ-テンプレートに関連付けられてはるかに大きなTmの差に全体のアンプリコン(80〜150 bp)のリード線に比べて長さを減少させました。
第二に、変異対立遺伝子増幅バイアス(MAAB)はバイアスに反応アニール温度polygenomic感染の低い比率で存在する突然変異対立遺伝子に向かって反応を低下させます。アニール温度は、完全に一致した(野生型)のTMSおよび不一致(変異体)プローブの間に設定されています秒。この温度では、野生型対立遺伝子の結合は、増幅は、このように両方の単一のサンプル10内に存在する変異対立遺伝子の増幅に向けて付勢、そのミスマッチ同等に比べて阻害されるに十分に安定です。
これらのHRMの改良では、この技術が起源と南米11と1未満に存 在する新たな変異、順番にすぐ隣同士に配置された複数のSNPの分化、および変異の検出に流行感染症に関連する寄生虫の身元の追跡を可能にしましたpolygenomicサンプル10における対立遺伝子の%。
感度の増加は、事前に消去状態と新興薬剤耐性のリスクがあるものに接近する地域では特に重要です。迅速かつ簡単にオンサイト感受性低下に関連するインポート寄生虫やSNPを同定する能力は、サーベイランスと制御プログラムについての通知しますその実装と増加したマラリア撲滅と排除の努力のための識別のホットスポットの有効性。このプロトコルは、増加したHRMジェノタイピング感度のためブロックされたプローブベースとMAABのための方法を説明します。
注:このプロトコルは、96ウェルプレート、8チューブストリップ、およびキャピラリーベースのシステム(10μlの反応容量)のためのボリュームと濃度を含み、しかしながら、HRMはまた、それに応じてすべてのボリュームをスケーリングすることにより5μlの反応体積で384ウェルプレートベースのシステムで実行することができます。ほとんどのシステムの検出範囲は、10 ngの鋳型DNAには10pgです。
1.テンプレートを準備します
3. HRM解析
データは、解析ソフトウェア及び機器に応じて、いくつかの異なる方法で視覚化することができます。一般的に、温度の結果に対する温度(-dF / DT)に対して正規化した蛍光の負の導関数のプロットは、融解ピークを可視化し、遺伝子型を決定するための最も簡単です。
完全溶融ウィンドウ(40℃〜80℃)の両方のアンプリコンおよびプローブ融解領域になります。 図1両方の領域のための正規化された融解ピークの一例を示しています。特定のSNPに対応するピークの明確な差別でちょうどプローブ領域の結果を分析ウィンドウを設定する( 図2)。
プローブベースの分析は、ホモ接合のSNPのピーク( 図3)に一致融解温度を有する個々のピークとして両方の対立遺伝子の存在を示しています。
図4はそのprogressiを示していますvely混合対立遺伝子( 図4B)の集団での変異対立遺伝子のための感受性の増加、その結果、変異対立遺伝子(左側のピーク)( 図4A)の偏りに増幅(MAAB)の結果の間にアニール温度を低下させます。
図1.プローブとアンプリコン融解領域。ワイドの両方のプローブ(より低い温度)で溶融ウィンドウ結果と分析することができるアンプリコンの融解ピークを超える温度に対する正規化された蛍光の負の導関数をプロットします。 (ダニエルズらから適応DOI:10.1128 / AAC.05737-11) この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2.プローブ融解ピークのSNPの不一致は(グレー)より低い融解温度を有する。パーフェクトマッチ(通常は野生型対立遺伝子)は、より高い融解ピーク(赤)になる。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3. Polygenomic融解ピーク。両方の対立遺伝子がサンプル中に存在する場合、プローブベースのHRM解析は、単一の対立遺伝子サンプル(赤とグレー)と一致したピークを持つ2つのピーク曲線(オレンジ色)のように両方の対立遺伝子を表しています。 (ダニエルズらから適応DOI:10.1128 / AAC.05737-11) より大きいVを表示するには、こちらをクリックしてくださいこの図のERSION。
図4.変異対立遺伝子増幅バイアス(MAAB)。A.次第に増幅アニーリング温度を低下させることがpolygenomicまたはpolyallelic試料中の変異体(より低い温度)対立遺伝子に対応するピークに向かって融解ピーク反応を付勢します。 B. MAABはpolygenomicまたはpolyallelicサンプル中の1%未満で存在するマイナー対立遺伝子を検出するために、HRMの感度になります。 (パートBはダニエルズらDOIから適応:10.1128 / AAC.05737-11) この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
プローブベースの高解像度融解増幅反応の表1.セットアップ。
成分 | 再あたりの体積アクション(96ウェルプレートおよびキャピラリーチューブ) | 反応あたりのボリューム(384ウェルプレート) | 最終濃度 |
HRMマスターミックス | 4-5μL | 2〜2.5μlの | 1× |
10×過剰プライマー | 1μL | 0.5μlの | 0.50μM |
10×その他のプライマー | 1μL | 0.5μL | 0.1μM |
10倍のプローブ | 1μL | 0.5μlの | 0.40μM |
PCRグレードの水 | 1-2μL | 0.5-1μL | |
テンプレートDNA | 1μL | 0.5μlの | 0.01〜10 ngの/μL |
10μlの | 5μL |
表2 StandarD高解像度融解増幅条件。
温度 | 時間 | |
ホールド | 95°C | 120秒 |
45サイクル | 95°C | 30秒 |
68°Cの* | 30秒 | |
1サイクル | 95°C | 30秒 |
28°C | 30秒 |
*この温度は、アンプリコンに依存します
変異対立遺伝子の増幅偏り表3.増幅条件。
温度 | 時間 | サイクル | ランプ速度 | 取得モード | 分析モード | |
変性 | 95°C | 30秒 | 1 | 20 | なし | なし |
サイクル | 95°C | 2秒 | 55 | 20 | なし | 定量 |
56°Cの* | 15秒 | 20 | シングル | |||
融液 | 40°C | 0秒 | 0.3 | なし | なし | |
45°Cの* | 0秒 | 連続 | 融液 | |||
90°Cの* | 0秒 |
*この温度は、アンプリコンに依存し、MAABを行う際に削減されます
連続HRMはPCR後の分析ステップです。従って、サンプルおよびアッセイセットアップは、高解像度融解工程中に二本鎖の一本鎖DNAへの移行を追跡するために使用される蛍光インターカレート色素の追加の取り込みと、標準的なPCRプロトコールと同様です。成功したHRM分析のための単一の最も重要な要因は、強固なPCR産物です。アッセイ設計が鍵であり、HRMアッセイ設計に最適化されたいくつかのツールは、市販品として、オンライン13可能です。 〜20塩基対を伴う80-150塩基対のアンプリコンの長さは、プローブ領域内のSNPだけでなく、複数のSNPのハプロタイプを区別するために、SNPまたは関心の仕事最良のSNPの上の中心のプローブをブロックしました。プローブは、増幅の間に伸長を防ぐれ、3 '末端にC3スペーサーまたは2塩基対ミスマッチの3'のいずれかを使用してブロックすることができます。プローブは、ワトソンクリックまたはテンプレート鎖と一致するように設計することができます。選択許容可能な融解ピークを生成するプローブ設計を決定するために実験的なテストに依存します。フォワード過剰又はリバースプライマーは、ブロックされたプローブにアニールする一本鎖増幅産物を生成するために使用されます。プローブはフォワード鎖配列が含まれている場合、次に、プライマーが過剰に使用される逆一般的に1:5の比率、およびリバース鎖に一致するプローブに対するその逆。
同様に、HRMは、十分な堅牢なPCR産物に最適です。 PCR反応の最適化は、最適なアニーリング温度を決定するために、勾配PCR及びアガロースゲルまたはバイオアナライザー分析を必要とします。鋳型濃度は、鋳型濃度13を増加させるために 、低プライマー濃度とサイクル数を使用して、すべてのターゲットの前増幅、バイアスされた多重化された増幅のような方法を用いて増加させることができます。
楽器のほんの一握りは、MAABと互換性があります。私使用されるガラスキャピラリー管の熱特性nは、これらのシステムは、この方法を容易にします。毛細血管の小内径並びにガラスを通して急速な熱伝達は、プラスチックの断熱特性に起因するアニーリングおよび変性サイクル間の遅い遷移速度を持つ標準的なPCRプラスチック製品、より厳しい温度制御を提供します。この方法では、検出感度は、野生型と突然変異対立遺伝子10の混合物中の変異体対立遺伝子の1%未満に2-5%から減少させることができます。
HRMは、癌遺伝子変異体のための感染症サーベイランスからのスキャンに、設定や多数の種々の用途にSNP遺伝子型決定のために、容易な、効率的、かつ経済的なツールです。このようなナノロシュとライトサイクラーシステム(480及び96)と同様に、標準的な増幅、リアルタイム、およびコピー数の機能に加えて、エコリアルタイムPCRシステムオファーHRMなどのいくつかの他の楽器、。高スループット機を使用して、HRMのバーコードは、コストレすべての試薬や消耗品など、私たちの手でのアッセイにつき$ 0.50より秒。
ここで説明する文脈では、フィールドベースのアプリケーションは、減少人口の多様性、インポートされた寄生虫の種類の検出、および減少した薬剤感受性と関連するSNPの出現と普及など、マラリア対策の取り組み、関連付けられた変更のためのリアルタイムの人口の監視を可能にします。この方法に改良がマラリアの除去と根絶に向けた進捗状況を通知するための有用な追加の感度を提供します。
著者らは、開示することは何もありません。
著者は、技術開発や研修への支援のためにビル・アンド・メリンダ・ゲイツ財団に感謝します。
Name | Company | Catalog Number | Comments |
LightScanner Master Mix | BioFire Defense | HRLS-ASY-0003 | |
Light mineral oil | Sigma | M5904 | for BioFire Defense plate-based HRM systems |
TE | Teknova | T0226 | |
Te | Teknova | T0221 | TE buffer with reduced EDTA |
PCR grade water | Teknova | W3330 | |
Plasmodium falciparum standards | MR4 | MRA-151, 156, 205, 330 | MR4.org offers free genomic DNA |
Light Scanner Primer Design Software | BioFire Defense | commercial sofware for HRM assay design | |
LightCycler 480 High Resolution Melting Master Mix | Roche | 4909631001 | For use in LightCycler-480, -96, and nano. 2x concentration |
Bioanalyzer | Agilent | G2938A | Agilent 2100 bioanalyzer |
LightCycler 2.0 | Roche | 3531414001 | Capillary-based system for MAAB |
LightCycler Nano | Roche | 6407773001 | Strip tube-based HRM and amplification |
LightCycler 96 | Roche | 5815916001 | Strip-tube and plate-based HRM and amplification |
LightCycler 480 | Roche | 5015278001 | plate-based HRM (96 and 384-well plates) and amplification |
LightScanner-96 | BioFire Defense | LSCN-ASY-0011 | plate-based HRM (96-well) |
LightScanner-384 | BioFire Defense | LSCN-ASY-0001 | plate-based HRM (96-well) |
96-well plates | Roche | 4729692001 | 96-well plates for HRM (LightCycler |
384-well plates | Roche | 4729749001 | 384-well plates for HRM (LightCycler) |
96-well plates | Bio-Rad | HSP-9665 | 96-well plates for HRM (LightScanner) |
384-well plates | Bio-Rad | HSP-3865 | 384-well plates for HRM (LightScanner) |
LightCycler 8-Tube Strips (clear) | Roche | 6327672001 | strip tubes for HRM (Light Cycler 96 and Light Cycler Nano) |
LightCycler Capillaries (20 μl) | Roche | 4929292001 | capillaries for HRM |
Optical plate seals | Roche | 4729757001 | other brands also work |
このJoVE論文のテキスト又は図を再利用するための許可を申請します
許可を申請This article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2023 MyJoVE Corporation. All rights reserved