Методы повышения чувствительности с высоким разрешением Melting полиморфизм единичного нуклеотида генотипирования в малярией

Резюме

В то время как анализ высокого разрешения плавления дает возможность дифференцировать между отдельными нуклеотидных полиморфизмов в гетерогенной популяции, мутантный аллель смещения усиления может увеличить свою способность обнаруживать аллели, присутствующие при относительно низких процентах в образце. Этот протокол описывает улучшения, которые улучшают чувствительность анализа плавления с высоким разрешением.

Аннотация

Несмотря на десятилетия усилий по искоренению, малярия остается глобальное бремя. Последние возобновление интереса к региональной и глобальной ликвидации искоренения сопровождается повышенной геномной информации о Plasmodium паразитов видов, ответственных за малярией, в том числе характеристик географических популяций, а также изменения, связанные с уменьшением восприимчивости к противомалярийных препаратов.

Один из распространенных генетических вариаций, однонуклеотидных полиморфизмов (SNP), предлагает привлекательные цели для паразита генотипирования. Эти маркеры могут быть использованы не только для отслеживания маркеров лекарственной устойчивости, но и для отслеживания популяций паразита, используя маркеры не под наркотиками или другими селективным давлением.

SNP генотипирования методы дают возможность отслеживать лекарственную устойчивость, а также по отпечатку отдельных паразитов для наблюдения населения, в частности, в ответ на усилия по борьбе с малярией в регионах приближается eliminatионный статус.

В то время как информационные ОНП были определены, которые агностик конкретных технологий генотипирования, анализ высокого разрешения плавления (HRM) особенно подходит исследования на местах на основе. По сравнению со стандартными методами, основанными флуоресцентный зонд-что требуют отдельных ОНП в одном меченым зондом и предлагают в лучшем 10% чувствительность для обнаружения в образцах ОНП, которые содержат несколько геномов (polygenomic), HRM предлагает 2-5% чувствительность. Модификации HRM, такие как блокированных зондов и праймеров концентрации асимметричных а также оптимизации температуры отжига амплификации ПЦР для смещения в направлении усиления минорного аллеля, дополнительно повысить чувствительность HRM. В то время как улучшение чувствительности зависит от конкретного анализа, мы увеличили чувствительность обнаружения до менее чем 1% минорного аллеля.

В регионах, приближающихся по ликвидации малярии, раннее выявление новых или импортного лекарственной устойчивости имеет важное значение для PROmpT ответ. Точно так же, способность обнаруживать polygenomic инфекции и дифференцировать типы импортируемых паразитов из загадочных местных водоемов можете сообщить программ управления.

Эта рукопись описывает изменения в технологии плавления с высоким разрешением, что дальнейшего повышения его чувствительности, чтобы определить polygenomic инфекции в образцах пациента.

Введение

Несмотря возобновлению интереса в борьбе с малярией и искоренению, малярия остается во всем мире бремя, почти половина населения мира в опасности инфекции и более 550000 смертей в год, особенно детей в Африке к югу от Сахары ^1.

Эти новые программы борьбы и ликвидации были поддержаны геномной ренессанса, с большим количеством малярийных паразитов секвенированных и анализируемых мутаций, связанных с пониженной чувствительностью наркотиков, повышенной вирулентностью, и характеристики населения ^2,3. Однонуклеотидных полиморфизмов (SNP) являются одними из наиболее часто выявленных генетических вариантов ^4-7.

Портативные SNP генотипирования методы предлагают на месте и наблюдения населения в режиме реального времени и отслеживания ^8. В дополнение к отпечатков пальцев каждого паразита индивидуально, то "молекулярная штрих 'также используется для обнаружения драматические временные сдвиги в частот аллелейа также отклонений эффективного размера популяции и сложности инфекции ^9.

В то время как этот набор познавательной ОНП легко адаптируется ко многим генотипирования платформ, высокое разрешение плавления (HRM) анализа, в частности, хорошо подходит для полевых основе исследования, где чувствительный и простой операции и выявление новых мутаций при низких затратах по сравнению с секвенирования и других подходы являются привлекательными в условиях ограниченных ресурсов.

HRM начинается с стандартным полимеразной цепной реакции (ПЦР), которая включает флуоресцентный краситель. После ПЦР плавления анализ определяет температуру плавления пик ампликон; один различие SNP в короткий ампликоном может привести к существенным температуры пик плавления (Tm) различий.

Несколько уточнений к этому методу предложить лучше генотипирования разрешение дифференцировать ОНП в том числе класса IV (AT) ОНП, и обнаружить незначительные мутантные аллели в образцах с множественными аллелями, присутствующих (polygenomic инфекции). Во-первых, анализы включают коротких зондов по центру над области SNP в дополнение к прямого и обратного праймеров, которые присутствуют в различных концентрациях. Эти заблокированные зонды не усиливается во время ПЦР, но связываться с цепи производится в избытке из-за асимметричных концентрации праймеров, которые увеличивают производство зонд-шаблона продукта. Эти отдельные двухцепочечной ампликоны, состоящие из зонда, связанного с избыточным матричной цепи составляют ~ 20-30 б.п.; их значительно уменьшилось по сравнению с длиной всего ампликоном (80-150 б.п.) приведет к гораздо большей разницы Tm, связанных с одной или несколькими базовой зонда-шаблона соответствует ^10.

Во-вторых, мутантный аллель смещения усиления (MAAB) понижает температуру отжига реакции для смещения реакцию на мутантных аллелей, присутствующих в низких показателей в polygenomic инфекций. Температура отжига находится между ТМС прекрасно согласованного (дикого типа) и несогласованной (мутантного) зондас. При этой температуре, связывание аллель дикого типа является достаточно стабильным, что амплификация затруднено по сравнению с его несоответствием эквивалента, таким образом, смещение усиления к мутантного аллеля, когда оба присутствуют в одном образце ^10.

С помощью этих HRM уточнений, эта технология позволила отслеживать происхождение и идентичность паразитов, связанных с эпидемическим инфекций в Южной Америке ¹¹ и обнаружения новых мутаций, дифференциации нескольких SNP, расположенных в непосредственной близости друг к другу в последовательности, и мутаций присутствует менее чем 1 % из аллелей в polygenomic образцов ^10.

Повышенная чувствительность особенно важно в регионах, приближающихся статус предварительной ликвидации и людей, подверженных риску новых лекарственной устойчивости. Возможность быстро и легко идентифицировать ввезенные паразитов и ОНП, связанные с пониженной чувствительностью на месте сообщает усилия надзора и контроля о программыэффективность их реализации и определяет горячие точки для активизации усилий по искоренению малярии и ликвидации. Этот протокол описывает способы заблокированного-зонда на основе и MAAB для повышенная чувствительность HRM генотипирование.

протокол

Примечание: Этот протокол включает в себя объемы и концентрации для 96-луночного планшета, 8-штрипса и систем на основе капиллярных (10 мкл реакционного объема); Однако, HRM также может быть выполнена в системах на основе пластинчатых 384-луночных с реакционном объеме 5 мкл путем масштабирования все объемы соответственно. Диапазон обнаружения для большинства систем 10 мкг до 10 нг матричной ДНК.

1. Подготовьте шаблоны

1. Получить образцы малярийного плазмодия прямо из крови, полученной от больных, участвующих в исследованиях на местах и ​​сайта хранится в виде цельной крови, гранулированных эритроцитов, или на фильтровальной бумаге.
   Примечание: Образцы могут быть также культура приспособлены расти в пробирке; некоторые стандартные лабораторные штаммы для анализа могут быть заказаны с малярией исследования и справочных реагентов ресурсного центра (MR4, образцы могут быть использованы непосредственно из гранулированных эритроцитов или культуры или извлечены из цельной крови, эритроцитов, или фильтровальной бумаги.
2. ДНК извлекается изфильтровальная бумага или культурно-адаптированных штаммов
   Примечание: HRM чувствителен к концентрации соли; различия концентрации из-за переменных методов экстракции может существенно повлиять на температуру плавления. Хотя конкретные конечные буферы не являются существенным фактором для достижения успеха, использовать стандартный общий элюирования или ресуспендирования буфера (т.е., вода, 1x Те ['низкий Те' или 'ДНК подвески буфер': 10 мМ Трис-Cl, 0,10 мМ ЭДТА] или 1x ТЕ [10 мМ Трис-Cl, 1 мМ ЭДТА]) для всех образцов, чтобы избежать аномальных или противоречивые кривые расплава.
   1. Подготовьте шаблон разведения 10 пг -10 нг на мкл в стандартном Те, ТЕ, или воды для каждой реакции 10 мкл.
3. Прямое усиление из гранулированных эритроцитов
   1. Определить паразитемии красных кровяных клеток с помощью тонкой микроскопии мазка
      Примечание: Методы определения паразитемии зараженных эритроцитов доступны из Центров по контролю и профилактике заболеваний (CDC): HTTP: //www.cdc.gov/dpdx/diagnosticProcedures/blood/microexam.html
   2. Развести parasitemias выше 0,5% 1: 400 в ПЦР-класса воды, ТЕ, или Те. Используйте 3 мкл для каждого 5- 10 мкл реакции.
4. Управления
   Примечание: HRM может быть использован для сканирования генов для обнаружения вариантов последовательности в популяции ^12; Однако, точное генотипирование требует стандарты последовательность-проверено содержать SNP допрашивают. Плазмиды конструкции или малярия изолирует с известными генотипами могут быть использованы. Для большинства приложений, 3D7 (MR4 МРА-151) используется в качестве контроля дикого типа. В связи с между-счете изменчивости, всегда включают в себя положительные и отрицательные элементы управления.
   1. Положительные контроли: Подготовка 10 PG - 10 нг на 1 мкл разведения плазмиды или стандартов с порядковым-проверено SNP генотипов.
   2. Отрицательный контроль: Используйте ПЦР класса воды в качестве контроля не-шаблона (NTC) для реакций амплификации.

ve_title "> 2. ПЦР-амплификация

1. Подготовка реакционной смеси
   1. (Необязательно) Минеральное масло Наложение. Примечание: Некоторые системы HRM автономные платформы плавления и не имеют с подогревом крышку, чтобы предотвратить испарение конденсата и продукта во время усиления.
      1. Перед загрузкой реакционной смеси добавить 20 мкл минерального масла светло-в каждую лунку пластины.
   2. Подготовка 10x рабочие запасы всех анализов
      1. Обратитесь к Таблице 1 для рекомендуемых рабочих 10х фондовых концентраций, а также конечных концентраций для блокированного зонда на основе HRM генотипирования.
   3. Подготовка реакционных смесей
      1. В каждую лунку в пластины или трубки, добавить 1 мкл 10х работает запас прямого и обратного праймеров и зондов, 4,0 - 5,0 мкл 2.5x или 2.0x HRM мастер микс, 1 шаблон мкл, и ПЦР класса воды для общего объема реакции 10 мкл ,
   4. Накладки или трубы
      1. Используйте оптический плита SИлс для усиления пластины на основе, оптические колпачки для систем стрип-ламповый и пластиковые колпачки для капиллярных системах на основе. Будьте уверены, что охват является полным и тарелки и крышки полностью герметична и закреплены, чтобы предотвратить испарение в процессе амплификации.
   5. Образцы спин
      1. Спин пластины 3 мин при 1800 х г чтобы удалить пузырьки воздуха и отделить нефти и водной фаз при использовании минерального масла.
2. Протокол Усиление
   1. Поместите реакции пластин или труб в термоциклер. Запустите стандартные протоколы усиления заблокирован зонда или MAAB (таблицы 2 и 3, соответственно). Обратите внимание на разницу в температуре отжига между этими методами.

3. Анализ HRM

1. Плавиться
   1. После ПЦР-амплификации, перейдите к плавления анализ. Для автономных систем плавки, которые не имеют встроенных усиления (например., BioFire обороны LightScanner систем), повторнодвигаться усиленный пластины из термоциклер и место в HRM инструмента. Из интерфейса программного обеспечения системы, растопить плиту от 40 - 80 ° С для получения как зонд и Amplicon пиков плавления.
      Примечание: Чтобы сохранить плавления и анализа времени, окно плавления может быть сокращен, чтобы покрыть диапазоны температуры для всего исследовать или регионы ампликон плавления. После плавления, пластины и трубы могут быть переплавку, если это необходимо, и хранили при -20 ° С или 4 ° С. Магазин стеклянные трубки только при 4 ° С, чтобы предотвратить растрескивание труб.
2. Растопить анализ
   1. Удалить негативные образцы
      1. В программное обеспечение для анализа, удаления от дальнейших анализа образцы, которые не усиливают или имеют зубчатые пики плавления. Примечание: После выбора режима анализа для отдельного файла запуска, прибор автоматически группирует положительные и отрицательные образцы. Перед генотипирования каждый подмножество, пользователь может вручную изменять звонки.
         1. Либо из плавлениякривой или пик плавления вид, щелкните правой кнопкой мыши на кривых, чтобы быть удалены, чтобы выбрать их. После выбора неверной классификации образцов, перейдите в раздел "Новый вызов", выберите соответствующий группировку, и нажмите кнопку "Применить Изменить".
   2. Нормализовать
      1. С отрицательной производной нормированного флуоресценции по отношению к температуре (-dF / дТ) ('разница Кривые "), сдвиньте нормализации бары, чтобы окружить зонд область расплава.
         Примечание: Зонд расплава область является низкая температура двух областей плавления. Нормализация бары должны быть у основания пиков плавления.
   3. Рассчитать группы
      1. После нормализации, выберите 'Calculate группы ", чтобы автоматически назначать образцы групп.
         При необходимости, вручную переназначить образцы для определенных групп.
         Примечание: Некоторые программы анализ имеет высокие пороги чувствительности, которые не могут быть изменены; в этих случаях сoftware может назначить образцы различных групп, которые визуально принадлежащих к другой.
   4. Связать генотипы
      1. Связать генотипов для каждой группы на основе стандартов (положительные контроли).
         1. После того как пользователь подтверждает, что расчетные группы правильно (если нет, что правильные изменения были сделаны на вкладке Группировка выбрав неправильно классифицирован образцы и выбора правильного группу из выпадающего окна рядом "Новый звонок"), выберите "Изменить группу имен "под вкладке" Группировка ".
         2. Ввод генотипы стандартам в соответствующий цветной коробке (например, если стандартный 3D7 имеет известную генотипа и находится в красной группе, красный группа имеет генотип). Нажмите "ОК" и сохранить результаты.
   5. Экспорт результатов
      1. Экспорт генотип вызывает в электронную таблицу для дальнейшего анализа выборки населения.

Результаты

Данные могут быть визуализированы в нескольких различных способов, в зависимости от программного обеспечения для анализа и инструмента. Как правило, участок отрицательного производной нормированной флуоресценции по отношению к температуре (-df / дТ) против температуры приводит это самый простой для визуализации пиков плавления и определения генотипа.

Полный окна плавления (40 ° С-80 ° С) приведет к обеим ампликона и плавления зонда регионов. Рисунок 1 иллюстрирует пример нормированных пиков плавления для обоих регионов. Установка окна анализа, чтобы только результаты зонд области в четкой дифференциации пиков, соответствующих конкретным ОНП (рисунок 2).

Зонд на основе анализа ясно показывает присутствие обоих аллелей, как отдельных пиков с температурами плавления, которые соответствуют гомозиготных SNP пики (рисунок 3).

Рисунок 4 показывает, что progressiVely снижения температуры отжига в процессе амплификации (MAAB) приводит к смещению в сторону мутантного аллеля (левая сторона) (пик фиг.4А), что приводит к увеличению чувствительности мутантного аллеля в популяции смешанных аллелей (фиг.4В).

Рисунок 1. зонд и ампликон плавления регионы. Построение отрицательную производную нормированной флуоресценции по отношению к температуре в широком результатов оконных плавления в обоих зондов (более низкой температуре) и пики плавления ампликон которые могут быть проанализированы. (Взято из Daniels др DOI: 10,1128. / AAC.05737-11) Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2. Зонд пиков плавления. Совершенные матчи (обычно аллели дикого типа) в результате более высоких пиков плавления (красный), в то время как SNP несоответствия имеют более низкие температуры плавления (серый). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 3. Polygenomic плавления пики. Когда оба аллеля присутствуют в образце, зонд на основе анализа HRM представляет обоих аллелей, как двухпиковые кривых (оранжевый) с пиками, которые соответствуют отдельные образцы-аллель (красный и серый). (Взято из Daniels др DOI: 10,1128. / AAC.05737-11) Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенное Version этой фигуры.

Рисунок 4. мутантный аллель усиления смещения (MAAB). А. Постепенно снижая температуру отжига усиление смещает пик плавления реакция на пик, соответствующий мутант (низкая температура) аллеля в polygenomic или polyallelic образца. Б. MAAB приводит чувствительности HRM обнаружить незначительные аллелей, присутствующих на менее чем 1% в polygenomic или polyallelic образцов. (Часть B взята из Daniels др DOI: 10,1128. / AAC.05737-11) Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Таблица 1. Установить вверх высоким разрешением усиления таяния реакций зонда на основе.

Компонент	Объем за реДействие (96-луночного планшета и капиллярная трубка)	Объем за реакции (384-луночный планшет)	Конечная концентрация
HRM Мастер Mix	4-5 мкл	2-2,5 мкл	1 х
10 х Превышение праймеров	1 мкл	0,5 мкл	0.50 мкМ
10 х Другое праймеров	1 мкл	0,5 мкл	0,1 мкм
10x зонд	1 мкл	0,5 мкл	0.40 мкМ
ПЦР-класса воды	1-2 мкл	0.5-1 мкл
ДНК-матрицы	1 мкл	0,5 мкл	0,01-10 нг / мкл
	10 мкл	5 мкл

Таблица 2. StandarD высокого разрешения условия амплификации плавления.

Температура	Время
Держать	95 ° С	120 сек
45 циклов	95 ° С	30 сек
	68 ° C *	30 сек
1 цикл	95 ° С	30 сек
	28 ° С	30 сек

* Эта температура зависит от ампликон

Таблица 3. Усиление условия для мутантного аллеля предвзятости усиления.

Температура	Время	Циклы	Градиент скорости	Режим Приобретение	Режим анализа
Денатурировать	95 ° С	30 сек	1	20	Ни одной	Ни одной
Цикл	95 ° С	2 сек	55	20	Ни одной	Квантификация
	56 ° C *	15 сек		20	Один
Плавиться	40 ° С	0 сек		0,3	Ни одной	Ни одной
	45 ° C *	0 сек			Непрерывная	Плавиться
	90 ° C *	0 сек

* Эта температура ампликон-зависимой и будет уменьшаться при выполнении MAAB

Обсуждение

Непрерывное HRM является шагом анализ пост-ПЦР; Поэтому, выборки и анализа установки аналогичен стандартным протоколам ПЦР, с дополнительным включением флуоресцентным красителем интеркалирующего используется для отслеживания переход от двухцепочечной чтобы одноцепочечной ДНК во время стадии плавления с высоким разрешением. Самым важным фактором для успешного анализа HRM является надежный продукт ПЦР. Анализ дизайн является ключевым, и несколько инструментов, оптимизированных для дизайна HRM анализа имеются в продаже и в Интернете ^13. Длина ампликона 80-150 пар оснований с сопутствующей ~ 20 пар оснований заблокирован зонды, сосредоточенные на SNP или ОНП на процентной работы лучших дифференцировать ОНП, а также гаплотипов нескольких ОНП в регионе зонда. Зонды могут быть заблокированы с использованием либо 3 'C3 прокладку или 2 пар оснований несоответствие на 3'-конце, которые предотвращают расширение в процессе амплификации. Зонды могут быть разработаны в соответствии с Уотсон или Крик шаблона прядь; выборзависит от эмпирического тестирования для определения, какой датчик дизайн производит приемлемые пиков плавления. Избыточные вперед или обратный праймеры используются для производства одноцепочечной продукт амплификации, что отжигов на заблокированных зондов. Если зонд содержит последовательность вперед нити, то обратный праймер используют в избытке, как правило, в соотношении 1: 5, и наоборот для зондов, которые соответствуют обратную цепь.

Точно так же, HRM лучше всего работает с достаточной и надежной продукта ПЦР. ПЦР оптимизации реакция требует градиентных ПЦР и агарозном геле или анализа Bioanalyzer определить оптимальные температуры отжига. Шаблон концентрация может быть увеличена с помощью таких методов, как пре-амплификации, необъективной мультиплексной амплификации всех целей с использованием низкой концентрации праймера и число циклов, чтобы увеличить концентрацию шаблона ^13.

Только горстка инструментов совместимы с MAAB. Тепловые свойства стеклянных капилляров труб используется Iп эти системы облегчают этот метод. Небольшой внутренний диаметр капилляров, а также быстрая передача тепла через стекла предлагают более строгий контроль температуры, чем стандартный PCR Пластик, который имеет более медленные темпы перехода между отжига и денатурации циклов в связи с теплоизоляционными свойствами пластика. С помощью этого метода, чувствительность обнаружения может быть уменьшена с 2-5% до менее чем 1% мутантного аллеля в смеси дикого типа и мутантных аллелей ^10.

HRM является поверхностным, эффективным и экономичным средством для SNP генотипирования в различных условиях и многочисленных приложений, от эпиднадзора за инфекционными болезнями к сканированию для вариантов гена рака. Несколько другие инструменты, такие как Roche Nano и LightCycler систем (480 и 96), а также эко режиме реального времени система ПЦР предложение HRM в дополнение к стандартной усиления, в режиме реального времени, и копия чисел функциональности. Использование выше пропускная способность машины, HRM штриховое кодирование стоит лес чем $ 0,50 за анализе в наших руках, в том числе всех реагентов и расходных материалов.

В контексте описанной здесь, на местах на основе приложения позволяют наблюдение населения в режиме реального времени для изменений, связанных с борьбы с малярией, включая сокращение разнообразия населения, выявление паразитов, ввозимых видов и появления и распространения ОНП, связанных с пониженной чувствительностью наркотиков. Уточнения к методу предлагать дополнительную чувствительность полезную для информирования прогресса на пути к ликвидации малярии и ликвидации.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
LightScanner Master Mix	BioFire Defense	HRLS-ASY-0003
Light mineral oil	Sigma	M5904	for BioFire Defense plate-based HRM systems
TE	Teknova	T0226
Te	Teknova	T0221	TE buffer with reduced EDTA
PCR grade water	Teknova	W3330
Plasmodium falciparum standards	MR4	MRA-151, 156, 205, 330	MR4.org offers free genomic DNA
Light Scanner Primer Design Software	BioFire Defense		commercial sofware for HRM assay design
LightCycler 480 High Resolution Melting Master Mix	Roche	4909631001	For use in LightCycler-480, -96, and nano. 2x concentration
Bioanalyzer	Agilent	G2938A	Agilent 2100 bioanalyzer
LightCycler 2.0	Roche	3531414001	Capillary-based system for MAAB
LightCycler Nano	Roche	6407773001	Strip tube-based HRM and amplification
LightCycler 96	Roche	5815916001	Strip-tube and plate-based HRM and amplification
LightCycler 480	Roche	5015278001	plate-based HRM (96 and 384-well plates) and amplification
LightScanner-96	BioFire Defense	LSCN-ASY-0011	plate-based HRM (96-well)
LightScanner-384	BioFire Defense	LSCN-ASY-0001	plate-based HRM (96-well)
96-well plates	Roche	4729692001	96-well plates for HRM (LightCycler
384-well plates	Roche	4729749001	384-well plates for HRM (LightCycler)
96-well plates	Bio-Rad	HSP-9665	96-well plates for HRM (LightScanner)
384-well plates	Bio-Rad	HSP-3865	384-well plates for HRM (LightScanner)
LightCycler 8-Tube Strips (clear)	Roche	6327672001	strip tubes for HRM (Light Cycler 96 and Light Cycler Nano)
LightCycler Capillaries (20 μl)	Roche	4929292001	capillaries for HRM
Optical plate seals	Roche	4729757001	other brands also work