生物学的液体培地中でスケーラブルな、メタリック高アスペクト比のナノコンポジットの生成

要約

ここでは、生物学的条件下で液体培地中で小説、高アスペクト比のバイオ複合材料を合成するためのプロトコルを提示します。バイオ複合材料は、それぞれ、直径および長さにマイクロメートルのナノメートルスケール。シスチンと組み合わせた銅ナノ粒子（CNPS）および硫酸銅は、合成のための重要なコンポーネントです。

要約

このプロトコルの目的は、高アスペクト比の構造を有する2つの新規なバイオ複合材料の合成を記載することです。バイオ複合は、銅ナノ粒子（CNPS）または金属成分に寄与する硫酸銅のいずれかで、銅およびシスチンで構成されています。合成は、生物学的条件（37℃）で液体で行い、自己組織化複合体は、24時間後に形成されます。一旦形成されると、これらの複合材料は、両方の液体培地中で、乾燥した形で非常に安定しています。複合材料の長さは、数ミクロンから、直径25 nmの範囲をマイクロするナノスケールから。エネルギー分散型X線分光法（EDX）を用いて電界放出走査電子顕微鏡は、それが、最終的なナノ複合材料中の硫黄の供給源としてシスチンを確認し、出発CNP材料から不在であった硫黄は、NP由来の線状構造中に存在することを実証しました。これらの線状ナノ·マイクロ複合材料の合成、STRの長さの多様な範囲の間ucturesは、合成容器内で形成されています。合成後の液体混合物の超音波処理は、超音波処理時間の増加とともに平均の長さを減少させることにより、構造物の平均の大きさを制御するのを助けることが示されました。形成された構造は、非常に安定であり、凝集しない、液相中で形成されているので、遠心分離はまた、形成された複合物を濃縮し、分離を補助するために使用することができます。

概要

Copper is a highly reactive metal that in the biological world is essential in some enzyme functions ^1,2, but in higher concentrations is potently toxic including in the nanoparticulate form ^3,4. Concern over copper toxicity has become more relevant as CNPs and other copper-based nanomaterials are utilized, due to the increased surface area/mass for nanostructures. Thus, even a small mass of copper, in nanoparticle form, could cause local toxicity due to its ability to penetrate the cell and be broken down into reactive forms. Some biological species can complex with and chelate metal ions, and even incorporate them into biological structures as has been described in marine mussels ⁵. In studying the potential toxic effects of nanomaterials ⁴, it was discovered that over time, and under biological conditions used for typical cell culturing (37 °C and 5% CO₂), stable copper biocomposites could be formed with a high-aspect ratio (linear) structure.

By a process of elimination, the initial discovery of these linear biocomposites, which occurred in complete cell culture media, was simplified to a defined protocol of essential elements needed for the biocomposites to self-assemble. Self-assembly of two types of highly linear biocomposites was discovered to be possible with two starting metal components: 1) CNPs and 2) copper sulfate, with the common biological component being cystine. Although more complex, so called “urchin” and “nanoflower” type copper-containing structures with nanoscale and microscale features have been previously reported, these were produced under non-biological conditions, such as temperatures of 100 °C or greater ^6-8. To our knowledge, synthesis of individual, linear copper-containing nanostructures that are scalable in liquid phase under biological conditions has not been previously described.

One of the starting materials utilized for synthesis of nanocomposites, namely CNPs, has been reported previously to be very toxic to cells ⁴. It has recently been reported that after the nanocomposites are formed, these structures are less toxic on a per mass basis than the starting NPs ⁹. Thus, the synthesis described here may be derived from a biological and biochemical reaction that has utility in stabilizing reactive copper species, both in the sense of transforming the NP form into larger structures and in producing composites less toxic to cells.

In contrast to many other nanomaterial forms which are known to aggregate or clump upon interaction with biological liquid media ^10,11, once formed, the highly linear composites described here avoid aggregation, possibly due to a redistribution of charge which has been previously reported ⁹. As detailed in the current work, this avoidance of aggregation is convenient for the purposes of working with the structures once formed for at least 3 reasons: 1) composite structures once formed may be concentrated using centrifugation and then easily dispersed again using vortex mixing; 2) formed structures can be decreased in average size by sonication for different periods of time; and 3) the formed linear structures may provide an additional tool for avoiding the recently described “coffee ring effect” ¹² and thus provide a dopant for creating more evenly distributed coatings of materials, especially those containing spherical particulates.

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プロトコル

実験1.計画

1. 合成に必要な銅ナノ複合材料の量を決定します。その上、少量フラスコ（25 cm ^2）で、または材料の調製において以下に示すように、より大きなフラスコの数を選択します。
2. この合成には、5％のCO ₂と少なくとも40％の湿度で37℃のインキュベーターを使用。このような培養器が利用可能であり、それは繰り返し合成（約24時間）の期間にわたって妨害されないことをことを確認してください。
   注意：インキュベーターの繰り返し開閉は確かにナノコンポジット構造の変化した合成をもたらし得る温度変動の原因となります。

材料の作製

1. 合成が開始する直前に溶媒に固体材料を添加することにより、実験開始前に、新鮮なすべての材料を準備します。長時間Bの液体中にシスチンと銅の出発物質の原液を維持EFORE実験が推奨されていませんし、変数の結果につながる可能性があります。一度ベンダーから開く、パラフィルムで容器の上部をラップすることによって、乾燥出発材料保ちます。
   注：以下のプロトコルは、シスチンの7μlの滅菌水の6643μL、およびCNPSの350μLを使用して25cm ^2の細胞培養フラスコ内の反応のための例として使用されています。
2. CNPSの少なくとも2ミリグラムを秤量することにより銅ナノ粒子の2 mg / mlの溶液を調製します。皮膚とのCNPSの可能性の接触を防ぐために、このステップの間に使い捨て手袋を着用してください。空の滅菌16ミリリットルのガラスバイアル中のナノ粒子を配置します。
   1. CNPSを含むバイアルに、2 mg / mlの溶液を作製し、合成を開始する前に、ナノ粒子の分散を提供するために、20秒間、溶液をボルテックスするために、適切な音量に滅菌脱イオン水を加える（少なくとも1ミリリットルの合計容量を推奨します）。これはボルテックスで混合阻害するとして水をバイアルの半分以上の方法を記入しないでください。 CNPSウィルlはすぐにバイアルの底に沈殿し、（黒に灰色）色が暗い表示されます。
   2. 合成の開始前にCNPSの最大分散を提供するために、室温で17分間、CNP液を超音波処理。定期的にCNPSは、超音波処理のために混合されていることを確認してください。成功した超音波処理後、CNPSを、少なくとも30分間、溶液中に懸濁したままで、溶液の色は暗くなります。
3. 合成のための72.9 mg / mlの溶液を作製するためにシスチンの十分な質量を秤量します。シスチンは水に直接溶解しないので、帯電防止計量容器に秤量シスチンを配置します。
   1. シスチンが完全に溶解するようにシスチンを含む計量容器に、滅菌、1MのNaOHの十分なボリュームを追加。たとえば、72.9 mg / mlの溶液を作製するために、1 M NaOHを100μlの完全シスチンの7.29ミリグラムを溶解します。
   2. 無菌状態を維持するために、無菌のフロー組織培養フード中でこのステップを実行します。
      注意：水酸化ナトリウム1でM濃度は苛性であるため、皮膚と濃NaOHとの接触を防ぐために、このステップの間に使い捨て手袋を着用します
4. 滅菌組織培養フードでの作業は、まず滅菌合成フラスコに滅菌水の6643μlのシスチンの7μlを添加し、フラスコのキャップで37℃のインキュベーター内で30分間インキュベートさせる効果的な提供するために、（ルーズ）通気混合。 CNPSは超音波処理工程の後に定住していますので、30秒間ボルテックスすることによって2 mg / mlのCNP液を再懸濁します。
   1. 合成を開始するために、25cm ^2の細胞培養フラスコに滅菌水、50部CNPS、及び949の部品を1部品シスチンを組み合わせる次の成分比を維持するために（滅菌技術を使用して）の合成フラスコに十分なCNPの溶液を加えます。例えば、7ミリリットル合成ボリュームの、シスチン原液の7μL、CNPS350μlの、滅菌水の6643μLを兼ね備えています。それはSECURであるように、フラスコのキャップを取り付けて締めE。
   2. 合成のためのすべてのコンポーネントを組み合わせた後、静かに4〜5回旋回することによりフラスコ中で混合します。 CO ₂インキュベーター中でフラスコを置き、および合成の間、フラスコのうちのガス交換が存在することになるように、キャップを緩めて、フラスコをベント。
5. 合成は約24時間インキュベーター内で実行することができます。合成の間、一つは、顕微鏡で眼によって、高度に線形複合体の形成を観察することができます。
   注意：構造の形成のプロセスは、構造の検出が最初に困難であるという意味で突然発生する可能性があり、その外観は、高密度化に迅速に移行します。形成は、したがって、24時間前に発生することがあります。構造が大きくなると、その密度が増大したらプロセスは、目で観察することができます。構造体の生成は、後の時点で、顕微鏡下で目視により経時的に観察することができるが、連続的に合成条件を中断し、温度が低下につながります合成結果。
6. しっかり合成フラスコをキャップし、冷蔵庫（4℃）で容器を保存することによって、バイオ複合材料の合成を終了します。一度生成構造は、少なくとも1年間はこの形で安定した状態を保ちます。利用コンポーネントを含む合成条件、合成の日付、および終了前に合成のインキュベーション時間でフラスコにラベルを付けます。

硫酸銅を使用した3合成

1. 硫酸銅塩とCNPSを置換することによって自己組織化合成を行います。無菌技術を使用して、2 mg / mlの溶液を作製するために滅菌脱イオン水の十分な量で硫酸銅の少なくとも2ミリグラムを溶かします。硫酸銅の結晶が容易にこの濃度で溶液中に行くが、必要に応じて、バイアルをボルテックスし、全ての結晶が溶解されることを保証するために目で点検します。
2. 前述のように硫酸銅を調製した後、合成を行うが、硫酸銅とCNPSを置き換えます。
   注：出発物質として硫酸銅を用いて自己組織化ナノコンポジットはCNPSから合成した構造に比べて、最終的な形状が、はるかに一貫性のあることが見出されました。
3. CNPコンポジット（ステップ2.6）の場合と同様に硫酸銅のバイオ複合材料の合成を終了し、4℃でそれらを長期的に保存します。

4.特性とバイオ複合合成後の取り扱いについて

1. CNPSから白色光顕微鏡⁹による硫酸銅からおよび電子顕微鏡⁹によって誘導されたバイオ複合材料を特徴づけます。
   1. 複合体は、フラスコが平坦敷設の数分以内に、フラスコの底面に沈降するように特性評価およびバイオ複合白色光顕微鏡による合成後の検査のために、倒立顕微鏡を使用し、次にフォーカスさせることができます。バイオ複合材料と液体媒体との間のコントラストを最大にするために顕微鏡で明視野設定を使用します。 CNPSと警官から派生複合硫酸ごとに両方の色が不透明に明確に表示されますが、未反応のCNPの凝集体は、色が非常に暗い表示されます。
      1. 複合材料の画像をキャプチャするために、顕微鏡に接続されたデジタルカメラを使用してください。個々の構造のための長さの範囲が観察されるであろう。
   2. 特性評価およびバイオ複合材料、合成後の検査のために、4℃で保存した後、フラスコを顕微鏡イメージングを行いながらフォーカス効果的な不明瞭ます冷蔵庫から取り出し、ときに最初に結露を形成するようにフラスコを少なくとも15分間、室温に来ることができます。 RTに平衡化させた後、顕微鏡の結像品質を最大にするために清潔なペーパータオルでフラスコの頂部および底部表面を拭きます。
   3. 長期的に格納されている複合材料またはイメージング作業する場合、冷蔵庫にある間に形成複合材料の塊を解離するために30秒間、フラスコをボルテックス。ボルテックスした後、反転マイクを有する構造を検査roscope凝集体が解離していることを確認し、必要に応じてボルテックスを繰り返します。
   4. CNPSを使用して、指定された実験のために、合成の有効性を評価するために、反転白色光顕微鏡を使用してください。例えば、合成時のような異なるパラメータを有するフラスコからのCNP由来のバイオ複合材料に使用される合成フラスコ中の未反応CNPSの有無を記録します。
      注：個々のCNPSを光学顕微鏡で観察するには小さすぎるが、未反応のCNPは、高アスペクト比、線形形式になります。合成に成功CNPコンポジットとは対照的に、ラウンド形状と​​暗いオブジェクトとして表示されます集約し、異なる長さの範囲を持っています。これは一旦形成された個々の構造に分散することが困難である高度に分岐した「ウニ」型構造、になりますように、終了までの時間の長すぎるために合成を行うことは避けてください。
   5. 有効性を評価するために反転し、白色光顕微鏡を使用して硫酸銅を使用して、指定された実験の合成。硫酸銅は、このプロトコルを使用して溶液中に完全に移行しているため、溶液はCNPSを使用して、合成のソリューションよりも少ない暗い表示されます。そのような終了の前に、合成時と異なる合成条件でフラスコを比較することにより、硫酸銅複合体の大きさと範囲を文書。
      注：正常に合成された複合材料は、異なる長さの範囲が表示されます。これは複合材料の高度に分岐した集合体になりますように、終了までの時間の長すぎるために合成を行う避け、「ウニ状」構造でなり、そのうちのいくつかと、一旦形成された個々の構造の中に分散させることは困難です。
2. バイオ複合材料を遠心管中の複合体の合成後、遠心分離ソリューションを集中させます。 15mlの遠心管にCNP由来の構造や硫酸銅由来の構造のいずれかの6ミリリットルを追加します。 10分間遠心室温で500×gでペレットを形成します。小さいボリュームの場合、0.6ミリリットルサイズのチューブに溶液中の構造物の500μlを添加します。少なくとも10分間、室温で2000×gで遠心分離し、ペレットを形成します。
   1. 十分な時間のために（microfugesのために少なくとも10分間）遠心分離した後、構造は慎重にペレット上記上澄み液を除去することにより濃縮して、チューブの底に観察可能なペレットを保存します。硫酸銅から派生バイオ構造は、（黒にグレー）暗いCNPSから派生した色および構造で青色に見えます。
   2. この管に、より複合材料を追加し、必要に応じて、構造物を濃縮するために、同じチューブ内で処理を繰り返します。濃縮されたペレットを分散させるために、10〜30秒のための所望のチューブに溶液の容量、および渦を追加します。
3. 超音波処理の構造はかつて​​より低い値に構造体の平均集団サイズ（長さ）を移動し、形成されました。ルでのための滅菌脱イオン水や超音波処理中の場所の構造AST 10分。このプロセスを使用して、時間をかけて、構造は（テキストの図6を参照）断片化し、平均長さが小さくなります。反転白色光顕微鏡とデジタルカメラを使用して、さまざまな超音波処理時間を有する複合サイズのドキュメントの変更。

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結果

図1は、この研究に記載の線状バイオ複合材料を形成するために、合成工程のフローチャート図を示しています。出発物質としてCNPSまたは硫酸銅を2 mg / mlの溶液を形成するために滅菌水と組み合わせて、この溶液を混合し、さらに混合物を提供するために超音波処理し、この銅溶液を合成するための以下の割合で混合される：949重量部、滅菌水：50部銅混合物：1部シスチン原液?...

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ディスカッション

CNPSを含むナノ材料の潜在的な毒性効果を評価するが、それは長期的に、CNPSが大きく、凝集形態に最初により分散微粒子分布（ 図2）から変換されたことが観察されました。いくつかの場合において、生物学的条件下で、細胞培養皿に製造されたこれらの高度に凝集形成は、「ウニ」を含む前述の銅を連想させる中央集合から非常に線状突起が形成された^6。これは、ここ...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mini Vortexer	VWR (https://us.vwr.com)	58816-121
CO2 Incubator Model # 2425-2	VWR (https://us.vwr.com)	Contact vendor	Current model calalog # 98000-360
Eppendorf Centrifuge (Refrigerated Microcentrifuge)	Labnet (http://labnetinternational.com/)	C2500-R	Model Prism R
Cell Culture Centrifuge Model Z323K	Labnet (http://labnetinternational.com/)	Contact vendor	Current model Z206A catalog # C0206-A
Sonicator (Ultrasonic Cleaner)	Branson Ultrasonics Corporation (http://www.bransonic.com/)	1510R-MTH
Balance	Sartorius (http://dataweigh.com)		Model CP225D similar model CPA225D
Olympus IX51 Inverted Light Microscope	Olympus (http://olympusamerica.com	Contact vendor
Olympus DP71 microscope digital camera	Olympus (http://olympusamerica.com	Contact vendor
external power supply unit - white light for Olympus microscope	Olympus (http://olympusamerica.com	TH4-100
10X, 20X, and 40X microscope objectives	Olympus (http://olympusamerica.com	Contact vendor
Scanning Electron Microscope	Hitachi (http://hitachi-hitec.com/global/em/sem/sem_index.html)	model S-4800
Transmission Electron Microscope	Zeiss (http://zeiss.com/microscopy/en_de/products.html)	model Libra 120
Table Top Work Station Unidirectional Flow Clean Bench	Envirco (http://envirco-hvac.com)	model PNG62675	Used for sterile cell culture technique