Generation skalierbar, Metallic Hochseitenverhältnis Nanokomposite in einer biologischen Flüssigmedium

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um neue, hochSeitenVerhältnis Biokomposite unter biologischen Bedingungen und in flüssigen Medien zu synthetisieren. Die Biokomposite skalieren von Nanometern bis Mikrometern im Durchmesser und Länge auf. Kupfer-Nanopartikel (CNP) und Kupfersulfat in Kombination mit Cystin sind die Schlüsselkomponenten für die Synthese.

Zusammenfassung

Das Ziel des Protokolls ist es, die Synthese von zwei neuartigen Biokomposite mit hohem Aspektverhältnis Strukturen zu beschreiben. Die Biokomposite bestehen aus Kupfer und Cystin, entweder mit Kupfer-Nanopartikel (CNP) oder Kupfersulfat trägt die metallische Komponente. Synthese in flüssiger unter biologischen Bedingungen (37 ° C) und der selbstorganisierten Verbundstoffen nach 24 h durchgeführt. Einmal gebildet, sind diese Verbundwerkstoffe in beiden flüssigen Medien in einer getrockneten Form sehr stabil. Die Verbundwerkstoffe skalieren von der Nano- bis Bereich in der Länge Mikro- und von einigen Mikrometern bis 25 nm im Durchmesser. Feldemissionsrasterelektronenmikroskopie mit energiedispersiver Röntgenspektroskopie (EDX) gezeigt, daß Schwefel in der NP-abgeleitete lineare Strukturen vorhanden, während sie nicht an dem Ausgangsmaterial CNP, wodurch bestätigt Cystin als Quelle für Schwefel in den endgültigen Nanokomposite . Während der Synthese dieser linearen Nano- und Mikroverbundwerkstoffe, ein breites Spektrum von Längen von structures in dem Synthesebehälter ausgebildet ist. Ultraschallbehandlung der flüssigen Mischung nach der Synthese wurde gezeigt, dass bei der Kontrolle der durchschnittlichen Größe der Strukturen durch Verminderung der Durchschnittslänge mit der erhöhten Zeit der Ultraschallbehandlung zu helfen. Da die gebildeten Strukturen sind sehr stabil, nicht agglomerieren und sich in der flüssigen Phase gebildet wird, kann auch zur Zentrifugation in Konzentrierung und Trennung gebildeten Verbundstoffe zu unterstützen.

Einleitung

Copper is a highly reactive metal that in the biological world is essential in some enzyme functions ^1,2, but in higher concentrations is potently toxic including in the nanoparticulate form ^3,4. Concern over copper toxicity has become more relevant as CNPs and other copper-based nanomaterials are utilized, due to the increased surface area/mass for nanostructures. Thus, even a small mass of copper, in nanoparticle form, could cause local toxicity due to its ability to penetrate the cell and be broken down into reactive forms. Some biological species can complex with and chelate metal ions, and even incorporate them into biological structures as has been described in marine mussels ⁵. In studying the potential toxic effects of nanomaterials ⁴, it was discovered that over time, and under biological conditions used for typical cell culturing (37 °C and 5% CO₂), stable copper biocomposites could be formed with a high-aspect ratio (linear) structure.

By a process of elimination, the initial discovery of these linear biocomposites, which occurred in complete cell culture media, was simplified to a defined protocol of essential elements needed for the biocomposites to self-assemble. Self-assembly of two types of highly linear biocomposites was discovered to be possible with two starting metal components: 1) CNPs and 2) copper sulfate, with the common biological component being cystine. Although more complex, so called “urchin” and “nanoflower” type copper-containing structures with nanoscale and microscale features have been previously reported, these were produced under non-biological conditions, such as temperatures of 100 °C or greater ^6-8. To our knowledge, synthesis of individual, linear copper-containing nanostructures that are scalable in liquid phase under biological conditions has not been previously described.

One of the starting materials utilized for synthesis of nanocomposites, namely CNPs, has been reported previously to be very toxic to cells ⁴. It has recently been reported that after the nanocomposites are formed, these structures are less toxic on a per mass basis than the starting NPs ⁹. Thus, the synthesis described here may be derived from a biological and biochemical reaction that has utility in stabilizing reactive copper species, both in the sense of transforming the NP form into larger structures and in producing composites less toxic to cells.

In contrast to many other nanomaterial forms which are known to aggregate or clump upon interaction with biological liquid media ^10,11, once formed, the highly linear composites described here avoid aggregation, possibly due to a redistribution of charge which has been previously reported ⁹. As detailed in the current work, this avoidance of aggregation is convenient for the purposes of working with the structures once formed for at least 3 reasons: 1) composite structures once formed may be concentrated using centrifugation and then easily dispersed again using vortex mixing; 2) formed structures can be decreased in average size by sonication for different periods of time; and 3) the formed linear structures may provide an additional tool for avoiding the recently described “coffee ring effect” ¹² and thus provide a dopant for creating more evenly distributed coatings of materials, especially those containing spherical particulates.

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Protokoll

1. Planung der Experimente

1. Bestimmen Sie das Volumen von Kupfer-Nanocomposites zur Synthese benötigt. Auf dieser Basis wählt eine Anzahl kleinvolumigen Flaschen (25 cm ²⁾ oder größer Kolben, wie unten bei der Herstellung der Materialien angegeben.
2. Für diese Synthese, mit einem 37 ° C-Inkubator mit 5% CO ₂ und mindestens 40% Luftfeuchtigkeit. Sicherzustellen, dass diese ein Inkubator ist und dass sie nicht so oft über den Zeitraum der Synthese (ca. 24 h) gestört werden.
   ACHTUNG: wiederholtem Öffnen und Schließen des Inkubators wird sicherlich dazu führen Temperaturschwankungen, die zu einer veränderten Synthese der Nanokomposit-Strukturen führen kann.

2. Herstellung von Materialien

1. Bereiten alle Materialien frisch vor dem Beginn eines Versuchs, durch Zugabe von festem Material, Lösungsmittel direkt vor der Synthese beginnen soll. Keeping Stammlösungen von Cystin und Kupferausgangsstoffe in Flüssigkeit für lange Zeiten bevor das Experiment wird nicht empfohlen und kann zu unterschiedlichen Ergebnissen führen. Sobald Sie vom Anbieter geöffnet halten Ausgangsstoffe trocken durch Umwickeln der Oberseite des Behälters mit Parafilm.
   Anmerkung: Das folgende Protokoll ist als ein Beispiel für eine Reaktion in einer 25 ^cm2 Zellkulturflasche unter Verwendung von 7 & mgr; l Cystin, 6,643 & mgr; l steriles Wasser, und 350 ul CNPs verwendet.
2. Vorbereitung einer 2 mg / ml Lösung von Kupfer-Nanopartikeln durch Einwiegen mindestens 2 mg CNPs. Einweghandschuhe tragen bei diesem Schritt, um mögliche Kontakt des CNPs mit der Haut zu vermeiden. Legen Sie die Nanopartikel in einer leeren sterilen 16 ml Glasfläschchen.
   1. In die Durchstechflasche mit CNPs, fügen steril VE-Wasser in dem entsprechenden Volumen, um eine 2 mg / ml-Lösung zu machen und Vortex die Lösung für 20 Sekunden, um die Dispersion der Nanopartikel vor der Synthese beginnt bereitzustellen (mindestens 1 ml Gesamtvolumen wird empfohlen). Stellen Sie das Fläschchen mehr als die Hälfte Weg zu füllen nicht mit Wasser, da dies hemmt Mischen durch Vortexen. CNPs will schnell auf den Boden der Ampulle absetzen und wird dunkel in der Farbe (grau bis schwarz) angezeigt.
   2. Beschallen die CNP-Lösung für 17 Minuten bei Raumtemperatur, um eine maximale Dispersion CNPs vor Beginn der Synthese bereitzustellen. In regelmäßigen Abständen überprüfen, um sicherzustellen, dass CNPs aufgrund Mischen einer Beschallung. Nach einer erfolgreichen Beschallung bleiben CNPs in Lösung für mindestens 30 min suspendiert, und die Lösung ist dunkel in der Farbe sein.
3. Abwiegen ausreichende Masse von Cystin, um eine 72,9 mg / ml Lösung für die Synthese zu machen. Seit Cystin ist nicht in Wasser löslich ist direkt, legen Sie die gewogen Cystin in einer antistatischen Wägegefäß.
   1. In den Wiegebehälter, Cystin, setze ausreichend Volumen sterilen, 1 M NaOH, so daß der Cystin vollständig auflöst. Beispielsweise lösen sich 7,29 mg Cystin vollständig in 100 ul 1 M NaOH, um eine 72,9 mg / ml Lösung herzustellen.
   2. Um sterile Bedingungen aufrechtzuerhalten, führen Sie diesen Schritt in einem sterilen Flussgewebekultur Kapuze.
      ACHTUNG: NaOHbei 1 M Konzentration ist ätzend, bei diesem Schritt, um den Kontakt von konzentrierter NaOH mit der Haut zu verhindern, so Einmalhandschuhe tragen
4. Die Arbeit in einem sterilen Gewebekultur Kapuze, hinzufügen, 7 & mgr; l von Cystin mit 6643 ul sterilem Wasser auf die sterile Synthese Kolben erste und ließ Inkubation 30 Min im Brutschrank bei 37 ° C mit dem Kolben entlüftet Kappe (lose), um eine wirksame Mischen. Resuspendieren 2 mg / ml Lösung CNP durch Vortexen für 30 Sekunden, da CNPs wird nach der Beschallungsschritt angesiedelt haben.
   1. Ausreichend CNP-Lösung auf die Synthese Kolben (unter Verwendung einer sterilen Technik), um die folgenden Komponentenverhältnisse beizubehalten: 1 Teile kombinieren Cystin, 50 Teile CNPs, und 949 Teilen sterilem Wasser in einem 25 cm ² Zellkulturflasche, die Synthese zu starten. Zum Beispiel für eine 7 ml Volumen Synthese kombinieren 7 ul von Cystin-Stammlösung, 350 ul CNPs und 6.643 & mgr; l sterilem Wasser. Setzen Sie die Kappe auf der Flasche und ziehen, so dass es secure.
   2. Nach dem Kombinieren aller Komponenten für die Synthese, vorsichtig mischen in dem Kolben durch Verwirbelung 4-5 mal. Zeigen Kolben im CO ₂ Inkubator und der Kolben durch Lösen der Entlüftungskappe, so dass es den Gasaustausch in und aus dem Kolben während der Synthese sein.
5. Erlauben Synthese in den Inkubator für ungefähr 24 Stunden laufen. Während der Synthese kann man beobachten, wobei die Mikroskopie und durch das Auge, die Bildung von hochlinearen Composites.
   Hinweis: Der Prozess der Bildung der Strukturen kann sich plötzlich in dem Sinne, dass die Strukturen anfänglich schwer zu erkennen geschieht, dann schreitet Aussehen schnell zu einer zunehmender Dichte. Bildung kann daher vor 24 Stunden auftreten. Das Verfahren kann auch mit dem Auge beobachtet werden, wenn Strukturen größer und ihre Dichte zunimmt. Während die Erzeugung der Strukturen kann im Laufe der Zeit unter dem Mikroskop und mit dem Auge zu späteren Zeitpunkten beobachtet werden, kontinuierlich Unterbrechung der Synthesebedingungen und der Temperatur kann zu einer schlechten führenSynthese führt.
6. Beenden Synthese Biokomposite durch dichtes Verschließen des Synthesekolben und Speichern der Behälter in einem Kühlschrank (4 ° C). Strukturen, einmal erzeugt, bleiben stabil in dieser Form für mindestens ein Jahr. Etikett der Kolben mit Synthesebedingungen, einschließlich verwendeten Komponenten, Datum der Synthese sowie der Inkubationszeit der Synthese vor Beendigung.

3. Synthese Mit Kupfersulfat

1. Führen Sie die Selbstorganisation Synthese durch Ersetzen CNPs mit Kupfersulfatsalz. Verwendung einer sterilen Technik lösen sich bei mindestens 2 mg an Kupfersulfat in einem ausreichenden Volumen von sterilem entionisiertem Wasser auf eine 2 mg / ml Lösung herzustellen. Die Kupfersulfat-Kristalle leicht in Lösung gehen bei dieser Konzentration, aber vortexen das Fläschchen, wenn nötig, und prüfen Sie nach Augenmaß, um sicherzustellen, dass alle Kristalle gelöst sind.
2. Nach der Herstellung der Kupfersulfat, durchzuführen Synthese, wie zuvor beschrieben, aber unter Ersatz CNPs mit dem Kupfersulfat.
   Hinweis: Selbstorganisierte Nanocomposites mit Kupfersulfat als Ausgangsmaterial erwiesen sich als viel konsequenter in endgültige Form als für Strukturen aus CNPs synthetisiert.
3. Beenden Sie die Synthese von Kupfersulfat Biokomposite wie für CNP-Composites (Schritt 2.6) und speichern sie langfristig bei 4 ° C.

4. Charakterisierung und Handhabung Biocomposites Post-Synthese

1. Charakterisieren Biokomposite von CNPs und von Kupfersulfat mit weißen Lichtmikroskopie ⁹ und durch Elektronenmikroskopie ⁹ abgeleitet.
   1. Zur Charakterisierung und Prüfung von Biokomposite nach der Synthese von weißen Lichtmikroskopie, verwenden Sie ein inverses Mikroskop als Verbundwerkstoffe werden an der Bodenfläche des Kolbens innerhalb weniger Minuten der Verlegung der Kolben flach niederzulassen, und kann dann in den Mittelpunkt gerückt werden. Verwenden Sie das Hellfeld-Einstellung auf dem Mikroskop, um den Kontrast zwischen Biokomposite und dem flüssigen Medium zu maximieren. Composites aus CNPs und cop abgeleitetpro Sulfat beide scheinen klare bis opake in Farbe, aber nicht umgesetzten CNP Aggregate wird sehr dunkel in der Farbe angezeigt.
      1. Verwenden Sie eine Digitalkamera mit dem Mikroskop verbunden, um Bilder der Verbundwerkstoffe zu erfassen. Ein Bereich von Längen für die einzelnen Strukturen beobachtet werden.
   2. Zur Charakterisierung und Prüfung von Biokomposite nach der Synthese und nach Lagerung bei 4 ° C, ermöglichen Kolben auf Raumtemperatur für mindestens 15 Minuten kommen, wie Kolben wird Kondensation zunächst nach der Entnahme aus Kühlschrank, der verschleiern wirksam Schwerpunkt bei der Durchführung Mikroskopie zu bilden. Nachdem man Gleichgewichtseinstellung auf RT, wischen Sie die obere und untere Fläche des Kolbens mit einem sauberen Papiertuch, um die Mikroskopie Bildqualität zu maximieren.
   3. Bei der Arbeit mit oder bildgebenden Verbundwerkstoffe, die langfristig gespeichert haben, Wirbel der Kolben für 30 Sekunden, um Klumpen von Verbundwerkstoffen, die während der in den Kühlschrank zu bilden distanzieren. Nach Vortex untersuchen die Strukturen mit einem umgekehrten micROSCOPE um sicherzustellen, dass Aggregate dissoziiert und wiederholen Vortexen wie nötig.
   4. Verwenden invertierten Weißlichtmikroskopie, um die Wirksamkeit der Synthese für eine gegebene Experiment mit CNPs beurteilen. Beispielsweise belegen die Anwesenheit oder Abwesenheit von nicht umgesetztem Synthese CNPs in Kolben für CNP-abgeleiteten Biokomposite von Fläschchen mit verschiedenen Parametern wie Zeitpunkt der Synthese verwendet.
      Hinweis: Einzelne CNPs sind zu klein, um mit einem Lichtmikroskop beobachten, aber nicht umgesetzten CNP-Aggregate werden als Rundform und dunkle Objekte angezeigt werden, im Gegensatz zu den erfolgreich synthetisiert CNP-Verbundwerkstoffe, die eine High-Seitenverhältnis, lineare Form haben wird, und haben eine Reihe von verschiedenen Längen. Vermeiden Durchführung Synthese zu lange einer Zeit vor der Beendigung, da dies in stark verzweigten "urchin" artigen Strukturen, die schwer in die einmal gebildeten einzelnen Strukturen zu verteilen sind führen.
   5. Verwenden invertiert weißen Lichtmikroskopie, um die Wirksamkeit zu beurteilender Synthese für ein gegebenes Experiment unter Verwendung von Kupfersulfat. Da Kupfersulfat geht vollständig in Lösung unter Verwendung dieses Protokolls wird die Lösung weniger dunkel als die Lösung aus der Synthese mit Hilfe CNPs angezeigt. Dokumentieren Sie die Größe und das Ausmaß der Kupfersulfat-Verbundwerkstoffen durch den Vergleich Fläschchen mit verschiedenen Synthesebedingungen wie Zeit der Synthese vor der Beendigung.
      Hinweis: Erfolgreich synthetisierten Verbundwerkstoffe wird eine Reihe von unterschiedlichen Längen zu zeigen. Vermeiden Durchführung Synthese zu lange einer Zeit vor der Beendigung, da dies in stark verzweigten Aggregaten von Verbundwerkstoffen, von denen einige "Seeigel-like" in Struktur ergeben, und die schwierig zu einmal gebildet einzelnen Strukturen zu verteilen sind .
2. Konzentrations Biokomposite nach der Synthese, zentrifugieren Lösungen von Verbundwerkstoffen in einem Zentrifugenröhrchen. 6 ml entweder CNP-abgeleiteten Strukturen oder Kupfersulfat-abgeleiteten Strukturen in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen. Zentrifuge für 10 minbei 500 · g bei RT unter Bildung eines Pellets. Für kleinere Volumina, fügen Sie 500 ul von Strukturen in Lösung zu 0,6 ml großen Tuben. Zentrifugation bei 2.000 × g bei Raumtemperatur für mindestens 10 min, um ein Pellet zu bilden.
   1. Nach Zentrifugieren für eine ausreichende Zeit (mindestens 10 min für microfuges), speichern die beobachtbare Pellet am Boden des Röhrchens, wo die Strukturen durch sorgfältiges Entfernen der überstehenden Flüssigkeit über dem Pellet konzentriert. Von Kupfersulfat abgeleitet Biocomposite Strukturen erscheinen in der Farbe blau und Strukturen aus CNPs abgeleitet sind dunkler (grau bis schwarz).
   2. Noch ein Verbundstoffe an dieser Stange und den Vorgang im gleichen Röhrchen, um Strukturen zu konzentrieren, falls gewünscht. Zu der konzentrierten Pellets zu zerstreuen, fügen Sie das gewünschte Volumen der Lösung in das Röhrchen und Vortex für 10-30 sec.
3. Beschallen Strukturen einmal gebildet, um die durchschnittliche Populationsgröße (Länge) der Strukturen zu bewegen, um Werte zu senken. Platz Strukturen in sterilem deionisiertem Wasser und Ultraschall behandeln zu least 10 min. Unter Verwendung dieses Verfahrens mit der Zeit geworden Strukturen fragmentiert und kleiner im mittleren Länge (siehe 6 des Textes). Dokumentänderungen in Verbund Größen mit unterschiedlichen Beschallungszeiten unter Verwendung eines invertierten Weißlicht-Mikroskop und Digitalkamera.

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Ergebnisse

1 zeigt ein Flussdiagramm schema der Syntheseschritte, die in dieser Arbeit beschriebenen linearen Biokomposite bilden. CNPs oder Kupfersulfat als Ausgangsmaterialien werden mit sterilem Wasser kombiniert, um eine 2 mg / ml-Lösung zu bilden, ist diese Lösung vermischt und beschallt, um eine gleichmäßige Mischung zu erhalten, und das Kupferlösung wird dann in dem folgenden Verhältnis zur Synthese vermischt: 949 Teile sterile Wasser: 50 Teile Kupfer-Mischung: 1 Teil Cystin-Stammlösung. Die tatsäch...

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Diskussion

Beim Auswerten potentiellen toxischen Wirkung von Nanomaterialien einschließlich CNPs, wurde beobachtet, daß über die langfristige, CNPs wurden aus einem anfänglich mehrere dispergierte Partikelverteilung auf eine größere, aggregierten Form (Figur 2) umgewandelt. In einigen Fällen sind diese hochaggregierten Formationen, die in der Zellkulturschale unter biologischen Bedingungen hergestellt wurden, gebildet hochlinearen Projektionen vom zentralen Aggregat, erinnert an die zuvor beschriebenen Kupf...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mini Vortexer	VWR (https://us.vwr.com)	58816-121
CO2 Incubator Model # 2425-2	VWR (https://us.vwr.com)	Contact vendor	Current model calalog # 98000-360
Eppendorf Centrifuge (Refrigerated Microcentrifuge)	Labnet (http://labnetinternational.com/)	C2500-R	Model Prism R
Cell Culture Centrifuge Model Z323K	Labnet (http://labnetinternational.com/)	Contact vendor	Current model Z206A catalog # C0206-A
Sonicator (Ultrasonic Cleaner)	Branson Ultrasonics Corporation (http://www.bransonic.com/)	1510R-MTH
Balance	Sartorius (http://dataweigh.com)		Model CP225D similar model CPA225D
Olympus IX51 Inverted Light Microscope	Olympus (http://olympusamerica.com	Contact vendor
Olympus DP71 microscope digital camera	Olympus (http://olympusamerica.com	Contact vendor
external power supply unit - white light for Olympus microscope	Olympus (http://olympusamerica.com	TH4-100
10X, 20X, and 40X microscope objectives	Olympus (http://olympusamerica.com	Contact vendor
Scanning Electron Microscope	Hitachi (http://hitachi-hitec.com/global/em/sem/sem_index.html)	model S-4800
Transmission Electron Microscope	Zeiss (http://zeiss.com/microscopy/en_de/products.html)	model Libra 120
Table Top Work Station Unidirectional Flow Clean Bench	Envirco (http://envirco-hvac.com)	model PNG62675	Used for sterile cell culture technique