Генерация масштабируемой, металлик высоких-Aspect Ratio нанокомпозитов в биологическом жидкой среде

Резюме

Здесь мы приводим протокол к синтезу новых, высоких соотношение сторон биокомпозитов в биологических условиях и в жидких средах. В биокомпозиты шкале от нанометров до микрометров в диаметре и длиной, соответственно. Наночастицы меди (ЧАЭС) и сульфата меди в сочетании с цистина являются ключевыми компонентами для синтеза.

Аннотация

Цель этого протокола заключается в описании синтез двух новых биокомпозитов с высокой соотношением сторон структур. В биокомпозиты состоят из меди и цистина, либо с наночастицами меди (ЧАЭС) или медного купороса, способствующего металлический компонент. Синтез проводят в жидкости в биологических условиях (37 ° C) и самоорганизующихся композитов форме после 24 часов. После образования эти композиты обладают высокой стабильностью в обоих жидких сред и в сухом виде. Композиты масштабироваться от нано- до микро- диапазон в длину, и от нескольких микрон до 25 нм в диаметре. Выбросов поле сканирующей электронной микроскопии с энергетической дисперсии рентгеновской спектроскопии (EDX) показал, что сера присутствует в НП-производных линейных структур, в то время как она отсутствовала из исходного материала CNP, таким образом подтверждая цистина в качестве источника серы в конечных нанокомпозитов , Во время синтеза этих линейных нано- и микро-композитов, разнообразных длин улuctures формируется в синтез судна. Ультразвуком жидкую смесь после синтеза был продемонстрирован, чтобы помочь в контроле средний размер структур путем уменьшения средней длины с увеличением времени обработки ультразвуком. Поскольку образованные структуры обладают высокой стабильностью, не агломерации, и образуются в жидкой фазе, центрифугирование также может быть использован для помощи в концентрации и сегрегации, образованные композитов.

Введение

Copper is a highly reactive metal that in the biological world is essential in some enzyme functions ^1,2, but in higher concentrations is potently toxic including in the nanoparticulate form ^3,4. Concern over copper toxicity has become more relevant as CNPs and other copper-based nanomaterials are utilized, due to the increased surface area/mass for nanostructures. Thus, even a small mass of copper, in nanoparticle form, could cause local toxicity due to its ability to penetrate the cell and be broken down into reactive forms. Some biological species can complex with and chelate metal ions, and even incorporate them into biological structures as has been described in marine mussels ⁵. In studying the potential toxic effects of nanomaterials ⁴, it was discovered that over time, and under biological conditions used for typical cell culturing (37 °C and 5% CO₂), stable copper biocomposites could be formed with a high-aspect ratio (linear) structure.

By a process of elimination, the initial discovery of these linear biocomposites, which occurred in complete cell culture media, was simplified to a defined protocol of essential elements needed for the biocomposites to self-assemble. Self-assembly of two types of highly linear biocomposites was discovered to be possible with two starting metal components: 1) CNPs and 2) copper sulfate, with the common biological component being cystine. Although more complex, so called “urchin” and “nanoflower” type copper-containing structures with nanoscale and microscale features have been previously reported, these were produced under non-biological conditions, such as temperatures of 100 °C or greater ^6-8. To our knowledge, synthesis of individual, linear copper-containing nanostructures that are scalable in liquid phase under biological conditions has not been previously described.

One of the starting materials utilized for synthesis of nanocomposites, namely CNPs, has been reported previously to be very toxic to cells ⁴. It has recently been reported that after the nanocomposites are formed, these structures are less toxic on a per mass basis than the starting NPs ⁹. Thus, the synthesis described here may be derived from a biological and biochemical reaction that has utility in stabilizing reactive copper species, both in the sense of transforming the NP form into larger structures and in producing composites less toxic to cells.

In contrast to many other nanomaterial forms which are known to aggregate or clump upon interaction with biological liquid media ^10,11, once formed, the highly linear composites described here avoid aggregation, possibly due to a redistribution of charge which has been previously reported ⁹. As detailed in the current work, this avoidance of aggregation is convenient for the purposes of working with the structures once formed for at least 3 reasons: 1) composite structures once formed may be concentrated using centrifugation and then easily dispersed again using vortex mixing; 2) formed structures can be decreased in average size by sonication for different periods of time; and 3) the formed linear structures may provide an additional tool for avoiding the recently described “coffee ring effect” ¹² and thus provide a dopant for creating more evenly distributed coatings of materials, especially those containing spherical particulates.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. Планирование экспериментов

1. Определить объем медных нанокомпозитов, необходимых для синтеза. На этой основе, выбрать количество мелких флаконах объемом 25 см ^(2), или больших колбах, как указано ниже, в подготовке материалов.
2. Для этого синтеза, использовать 37 ° C инкубатор с 5% СО ₂ и по меньшей мере 40% влажности. Убедитесь, что такое инкубатор доступен и что она не будет повторно нарушена в течение периода синтеза (примерно 24 ч).
   ВНИМАНИЕ: Повторное открытие и закрытие инкубатора, безусловно, вызывают колебания температуры, которые могут привести к изменению синтеза нанокомпозитных структур.

2. Подготовка материалов

1. Подготовьте все материалы свежие до начала эксперимента, путем добавления твердых материалов к действию растворителей перед синтез чтобы начать. Ведение исходных растворов цистина и медь исходных материалов в жидкости в течение долгого времени бEfore эксперимент не рекомендуется и может привести к переменным успехом. После вскрытия от поставщика, продолжают исходных материалов сухих обертыванием верхней части контейнера с парафильмом.
   Примечание: следующий протокол используется в качестве примера для реакции в 25 см колбы культуры ² клеток с использованием 7 мкл цистина, 6643 мкл стерильной воды, и 350 мкл ЧАЭС.
2. Приготовьте 2 мг / мл раствора наночастиц меди путем взвешивания, по меньшей мере 2 мг CNPS. Одноразовые перчатки во время этого шага, чтобы предотвратить возможный контакт с ЧАЭС с кожей. Поместите наночастиц в пустой стерильной 16 мл стеклянный флакон.
   1. Во флакон, содержащий CNPS, добавить стерильной деионизированной воды в соответствующем объеме, чтобы сделать 2 мг / мл раствора, и вихрь решение в течение 20 сек, чтобы обеспечить дисперсию наночастиц перед началом синтеза (по крайней мере, 1 мл общего объема рекомендуется). Не заполняйте флакон более половины пути с водой, так как это будет препятствовать смешивания встряхиванием. ЧАЭС Вильл быстро оседают на дне флакона и темным цветом (серый до черного).
   2. Разрушать ультразвуком решение для CNP 17 мин при комнатной температуре, чтобы обеспечить максимальную дисперсию ЧАЭС до начала синтеза. Периодически проверяйте, чтобы убедиться, что ЧАЭС смешиваете в связи с ультразвуком. После успешного ультразвуком, ЧАЭС остаются взвешенными в растворе в течение по крайней мере 30 мин и решение будет темного цвета.
3. Взвесить достаточную массу цистина, чтобы сделать 72,9 мг Раствор / мл для синтеза. Так цистина непосредственно не растворим в воде, поместить взвешенное цистина в антистатический весом судна.
   1. Для взвешивания сосуд, содержащий цистин, добавить достаточный объем стерильной, 1 М NaOH, так что цистин полностью растворяется. Например, растворите 7,29 мг цистин полностью в 100 мкл 1 М NaOH, чтобы 72.9 мг / мл раствора.
   2. Для поддержания стерильных условий, осуществлять этот шаг в стерильной поток тканевой культуры капот.
      ВНИМАНИЕ: NaOHна 1 М концентрации каустической, так что носить одноразовые перчатки во время этого шага, чтобы предотвратить контакт концентрированного NaOH с кожей
4. Работа в стерильной капот культуры ткани, добавить 7 мкл цистина с 6643 мкл стерильной воды в стерильной колбе сначала синтеза, и пусть инкубировать в течение 30 мин в термостате при 37 ° С с крышкой флакона вентилируемые (свободные), чтобы обеспечить эффективное смешивание. Ресуспендируют 2 мг / мл раствора CNP встряхиванием в течение 30 сек, так CNPS будет решен после стадии обработки ультразвуком.
   1. Добавьте достаточное решение CNP в синтез колбу (с использованием стерильных), чтобы сохранить следующие соотношения компонентов: 1 объединить части цистин, 50 частей ЧАЭС и 949 части стерильной воды в 25 см ² колбу клеток культуры, чтобы начать синтез. Например, для синтеза объема 7 мл, сочетают 7 мкл исходного раствора цистина, 350 мкл CNPS и 6643 мкл стерильной воды. Установите крышку на колбу и затянуть так, чтобы она SECURе.
   2. После объединения всех компонентов для синтеза, осторожно перемешать в колбе, вращая 4-5 раз. Поместите колбу в CO _2, инкубаторе и вентиляционные колбу, ослабив крышку так, что будет газообмен и из колбы в процессе синтеза.
5. Разрешить синтеза работать в инкубаторе в течение приблизительно 24 часов. Во время синтеза, можно наблюдать, с микроскопией и на глаз, формирование высокой линейных композитов.
   Примечание: процесс формирования структур может произойти внезапно в том смысле, что структуры первоначально трудно обнаружить, а затем появление быстро переходит к увеличению плотности. Поэтому формирование может происходить до 24 часов. Процесс также может наблюдаться на глаз сразу структуры становятся больше и их плотность увеличивается. В то время как поколение структур можно наблюдать в течение долгого времени под микроскопом и на глаз в более поздние моменты времени, постоянно прерывая условий синтеза и температуры приведет к беднымРезультаты синтеза.
6. Завершить синтез биокомпозитов от плотно укупорки синтез колбу и хранения судна в холодильнике (4 ° С). Структуры, порожденные однажды, остаются стабильными в этом виде, по крайней мере год. Этикетка колбу с условиями синтеза, в том числе компонентов, используемых, дата синтеза и времени инкубации синтеза до расторжения.

3. Синтез Использование медного купороса

1. Провести синтез самосборки заменой ЧАЭС с медной сульфатной соли. Использование метода стерилизации, растворяются по меньшей мере, 2 мг меди сульфата в достаточном объеме стерильной деионизированной воды, чтобы сделать 2 мг / мл раствора. Кристаллы сульфата меди легко переходят в раствор при этой концентрации, но вихрь флакон, если это необходимо, и проверить на глаз, чтобы гарантировать, что все кристаллы растворяют.
2. После подготовки сульфата меди, осуществить синтез, как описано выше, но с заменой CNPS с сульфатом меди.
   Примечание: Самоорганизующиеся нанокомпозитов с использованием сульфата меди в качестве исходного материала, оказались гораздо более последовательным в окончательной форме, чем для структур, синтезированных из CNPS.
3. Завершить синтез сульфата меди биокомпозитов за CNP композитов (шаг 2.6) и хранить их долгосрочные при 4 ° С.

4. Характеристика и обращение биокомпозитов после синтеза

1. Охарактеризовать биокомпозитов полученные от ЧАЭС и от медного купороса белым световой микроскопии ⁹ и с помощью электронной микроскопии ^9.
   1. Для определения характеристик и проверки биокомпозитов после синтеза белым световой микроскопии, использовать инвертированный микроскоп, как композитов будет располагаться на нижней поверхности колбы в течение нескольких минут укладки колбу плоской, а затем могут быть введены в фокусе. Используйте параметр светлого поля на микроскопе, чтобы максимизировать контраст между биокомпозитов и жидкой среде. Композиты, полученные из ЧАЭС и КСза купороса и появляются ясно непрозрачными в цвете, но не вступившие в реакцию агрегаты CNP появится очень темный цвет.
      1. Используйте цифровой камерой, подключенной к микроскопу для захвата изображений из композитов. Будет наблюдаться диапазон длин для отдельных структур.
   2. Для характеристики и осмотра биокомпозитов после синтеза и после хранения при 4 ° С, позволяют колбы прийти к комнатной температуре в течение не менее 15 мин, как колбы образуют конденсат изначально при удалении от холодильника, который будет затруднять эффективное фокусировки при проведении томографии микроскопии. После выдерживания уравновешивание до комнатной температуры, протереть верхнюю и нижнюю поверхности колбы с чистым бумажным полотенцем, чтобы максимизировать качество изображения микроскопии.
   3. При работе или изображений композитов, которые были сохранены в долгосрочной перспективе, вихревые колбы в течение 30 сек отделить скопления композитов, которые образуют в то время как в холодильнике. После встряхивания, осмотрите структуры с перевернутой микрофономroscope чтобы гарантировать, что агрегаты диссоциируют, и повторить вортексе по мере необходимости.
   4. Используйте перевернутую белый световой микроскопии, чтобы оценить эффективность синтеза для данного эксперимента с использованием ЧАЭС. Например, документ на наличие или отсутствие непрореагировавшего CNPS в синтезе колбах, используемых для CNP-производных биокомпозитов из колбы с различными параметрами, такими как время синтеза.
      Примечание: Индивидуальные ЧАЭС слишком малы, чтобы наблюдать с помощью оптического микроскопа, но не вступивший в реакцию CNP агрегатов появится в круглом виде и темных объектов, в отличие от синтезированных успешно CNP-композитов, которые будут иметь высокую соотношение, линейную форму, и будет иметь ряд различных длин. Избегайте проведения синтеза слишком долго из период времени до окончания, так как это приведет к сильно разветвленных "ежа" структур типа, которые трудно диспергировать в отдельных структурах, образованных раз.
   5. Используйте перевернутую белый световой микроскопии для оценки эффективностисинтеза для данного эксперимента с использованием сульфата меди. Так, сульфат меди идет полностью в раствор, используя этот протокол, решение будет казаться менее темные, чем решение от синтеза с использованием ЧАЭС. Документ размер и степень медного купороса композитов путем сравнения колбы с разными условиями синтеза, такие как время синтеза до расторжения.
      Примечание: Успешно синтезированные композиционные покажет спектр различных длин. Избегайте проведения синтеза слишком долго из период времени до окончания, так как это приведет к сильно разветвленных агрегатов из композиционных материалов, некоторые из которых будут "ежа, как" по своей структуре, и которые трудно диспергировать в отдельных структурах, образованных раз ,
2. Сосредоточить биокомпозитов пост-синтез, центрифуг решения композитов в центрифужную пробирку. Добавить 6 мл либо CNP-производных структур или сульфат меди, полученных структур в 15 мл центрифужную пробирку. Центрифуга в течение 10 минпри 500 х г при комнатной температуре с образованием гранул. Для небольших объемов, добавьте 500 мкл структур в растворе 0,6 мл размера трубы. Центрифуга на 2000 мкг при комнатной температуре в течение по крайней мере 10 минут для получения гранул.
   1. После центрифугирования в течение достаточного времени (по крайней мере, 10 мин) для microfuges, сохранить наблюдаемый осадок на дне пробирки, где структуры концентрируют путем тщательного удаления надосадочной жидкости над осадком. Биокомпозита структуры, полученные из сульфата меди появляются синего цвета и структуры, полученных от ЧАЭС темнее (серый до черного).
   2. Добавить еще композитов для этой трубки и повторите процесс в той же трубе, чтобы сконцентрироваться структуры, если это необходимо. Для разгона концентрированных гранул, добавление нужного объема раствора к трубке, и вихрь в течение 10-30 сек.
3. Соникатные структуры после формирования, чтобы переместить средний размер популяции (длины) структур к меньшим значениям. Место структур в стерильной деионизированной воды и разрушать ультразвуком в течение по крайней леАСТ 10 мин. Используя этот процесс, в течение долгого времени, структуры становятся фрагментированным и меньше средней длины (рисунок 6 текста). Изменения документов в композитных размеров с различными временами ультразвуком с использованием перевернутый белый световой микроскоп и цифровую камеру.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

На рисунке 1 показана блок-схема Схема стадий синтеза с образованием линейных биокомпозитов, описанные в данной работе. CNPS или сульфат меди в качестве исходных материалов в сочетании с стерильной водой, чтобы образовать 2 мг / мл раствора в этот раствор смешивают и обрабатывают...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

При оценке потенциальных токсических эффектов наноматериалов, включая ЧАЭС, было отмечено, что в течение длительного срока, ЧАЭС были преобразованы из первоначально более дисперсной распределения частиц в большей, агрегированной форме (рисунок 2). В некоторых случаях, эти выс...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mini Vortexer	VWR (https://us.vwr.com)	58816-121
CO2 Incubator Model # 2425-2	VWR (https://us.vwr.com)	Contact vendor	Current model calalog # 98000-360
Eppendorf Centrifuge (Refrigerated Microcentrifuge)	Labnet (http://labnetinternational.com/)	C2500-R	Model Prism R
Cell Culture Centrifuge Model Z323K	Labnet (http://labnetinternational.com/)	Contact vendor	Current model Z206A catalog # C0206-A
Sonicator (Ultrasonic Cleaner)	Branson Ultrasonics Corporation (http://www.bransonic.com/)	1510R-MTH
Balance	Sartorius (http://dataweigh.com)		Model CP225D similar model CPA225D
Olympus IX51 Inverted Light Microscope	Olympus (http://olympusamerica.com	Contact vendor
Olympus DP71 microscope digital camera	Olympus (http://olympusamerica.com	Contact vendor
external power supply unit - white light for Olympus microscope	Olympus (http://olympusamerica.com	TH4-100
10X, 20X, and 40X microscope objectives	Olympus (http://olympusamerica.com	Contact vendor
Scanning Electron Microscope	Hitachi (http://hitachi-hitec.com/global/em/sem/sem_index.html)	model S-4800
Transmission Electron Microscope	Zeiss (http://zeiss.com/microscopy/en_de/products.html)	model Libra 120
Table Top Work Station Unidirectional Flow Clean Bench	Envirco (http://envirco-hvac.com)	model PNG62675	Used for sterile cell culture technique