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要約

Using a printed glycan microarray strategy, a conventional 96-well plate assay was miniaturized for analysis of influenza A virus hemagglutinin avidity and specificity for sialic acid containing receptors.

要約

機能的な受容体は、細胞への侵入を獲得するようにインフルエンザAウイルス（IAV）赤血球凝集素は、細胞表面上のシアル酸を認識する。野生の水鳥はIAVのための自然宿主であるが、IAVは、家禽、豚、馬やヒトへの種の壁を越えることができます。鳥ウイルスは、ヒトウイルスが優先α2-6結合（人間型受容体）とシアル酸を認識するのに対し、α2-3結合（鳥型受容体）によって最後から二番目のガラクトースに取り付けられたシアル酸を認識する。鳥類ウイルスはヒト型受容体に適合しているかどうかを監視するために、いくつかの方法を用いることができます。合成シアロシドの多様なライブラリーを有するグリカンマイクロアレイはますます受容体特異性を評価するために使用されます。しかし、この技術は、結合活性を測定するために使用されません。結合活性の測定は、典型的には、従来のポリプロピレンの96ウェルプレートに吸着されたグリカンの連続希釈ヘマグルチニンまたはウイルスの結合を評価することによって達成されます。 αとこのアッセイでは、グリカン2-3またはα2-6シアル酸は、ビオチンに結合し、ストレプトアビジンプレートに吸着させ、または直接プラスチックに吸着したポリアクリルアミド（PAA）に結合されています。我々は、有意に直接PAA結合シアロシドマイクロウェルガラススライド上での非PAA結合相手を印刷することによって、このアッセイを小型化しています。このセットアップは、単一のスライド上の48アレイと、二つの非シアル化されたコントロールを含む6種類のグリカンを、尋問、8希釈で6糖鎖結合タンパク質の同時アッセイを可能にします。これは、従来のプレートアッセイで18倍、96ウェルプレートに相当します。グリカンアレイ形式は、化合物および生物学的製剤の消費を減少し、大幅効率が向上します。

概要

ワイルド水鳥IAVのための自然宿主であるが、IAVは、ヒトを含む、家禽および哺乳動物に種関門を通過することができます。ヒトウイルスがα2-6結合したシアル酸（ヒト型受容体）に結合するのに対し、鳥IAVsは、α2-3結合したシアル酸（鳥型受容体）を認識します。効率的に複製および鳥類IAVは、ヒト型受容体1に結合する必要がある人間との間で送信できるようにするには。

IAVsは、その赤血球凝集素（HA）およびノイラミニダーゼ（NA）エンベロープ糖タンパク質の抗原性を特徴付ける血清学に基づいて分割されます。 NAはウイルスのライフサイクルと切断するシアル酸2の他端の受容体破壊酵素であるのに対し、HAは、シアル酸に結合します。 H1N1、H2N2およびH3N2を含むすべての人間の感染ウイルスは、鳥類の起源3を持っています。人間のクロスオーバーには、いくつかの鳥十年の最後の2にわたりH5N1、H7N7、およびH7N9で、発生しているが最もよく​​知られています。ハウ版は、他のサブタイプはより散発的に人間に感染した（H6N1、H7N1、H7N2、H9N2、H10N7、H10N8）4。幸いなことに、これらのウイルスのいずれも完全ヒト型α2-6結合シアル酸受容体5-8に適応できていなかったようです。ヒト宿主内で複製および伝送に対応するために、鳥や他の人獣共通感染ウイルスの適応は、人間の健康に壊滅的な影響を与える可能性があります。したがって、これらのウイルスは、ヒト型受容体に結合するために進化しているかの事前の知識は、新興インフルエンザウイルスの世界的な監視を支援します。

受容体の好みの決意は、最初の異なる種の赤血球を用いて解明し、インフルエンザの研究9-12の間で好まれるアッセイのまましました。鳥ウイルスがα2-3シアル酸およびシアル酸をリンクα2-6ヒトウイルスを認識デモはもともと酵素的に李のそれぞれを含むように操作赤血球の血球凝集反応を用いたアッセイに基づいていましたnkages 13,14。読み出しが赤血球凝集、ウイルス学者のための標準的なアッセイではあるが、根本的なグリカン構造は、端末のみリンケージを定義されていません。さらに、細胞を再シアリル化するために使用するシアリルトランスフェラーゼの限られた可用性は、このアッセイ15-18の使用が制限されています。その後、受容体結合の好みを決定する他の方法は、プレートベースのアッセイ19,20にポリアクリルアミド（PAA）またはポリ-グルタミン酸（PGA）の構造に連結されたシアル化グリカン構造を使用して導入しました。いくつかのバリエーションが、堅牢信頼性が非常に敏感なELISA型アッセイ21-23もたらすその各々は、マイクロタイタープレートにグリカンまたはウイルスのいずれかをコーティング可能です。また、ビオチン結合型グリカンは、PAA / PGAを置き換えることができますし、ストレプトアビジンでコーティングしたプレート2,24に結合させることができます。いくつかの特定の血清を必要とすることができるが、ELISAはPAAにリンクされている標準およびいくつかのグリカンは、容易にされているcommerciallyおよび非商業的に入手可能な（機能グライコミクスのためのコンソーシアム（http://www.functionalglycomics.org））。

グリカンマイクロアレイ技術は、複数の異なるグリカンがスポットされているように、受容体特異性を決定するための貴重なツールとして浮上しており、異なる構造の広範な配列への結合は、単一のアッセイ25-29内に評価することができます。これらの構造体へのIAVの結合は、IAVが優先30-33を認識グリカン構造のより良い理解を提供します。糖鎖マイクロアレイは、結合アッセイを実行するためのサンプルボリュームの少量を必要とし、唯一のスポット当たりグリカンの微量（2 NL）を使用しています。しかしながら、これらのアレイは、典型的には、グリカン受容体の特異性を評価するためにのみ使用されます。複数の濃度範囲で、複数のウイルス、または赤血球凝集素タンパク質の分析は、必要スライドの数を禁止することができます。また、現在までに、相対的な結合活性アッセイは、グリカンのarを使用して開発されていません線技術。

グリカンマイクロアレイ技術およびELISAベースのアッセイにおけるPAA結合型グリカンの感度によりもたらされる低いサンプル要件を結合するために、我々は、比較して同等以上の分解能で高スループット分析を可能にするマルチウェルグリカンアレイを開発しようとしました従来のELISAベースのアッセイに。同時に、我々は消費生物学的製剤およびレポーター化学物質の量を最小限にしたかったです。最終的な結果は、特にIAV特異性を監視するために開発さ小型化結合活性アッセイであり、他のグリカン結合タンパク質を評価するためにも同様に適用可能です。テフロンマスクで48マイクロウェルに分離ガラススライドを使用して、6つの異なるグリカンは、ウェル当たり6連でスポットします。マイクロアレイプラットフォームは、いくつかの利点を持つマクロELISA形式で見られる受容体結合に同じ傾向が得られます。これらは、いくつかの行Iのコーティングに対して、最小限のサンプルを使用して、6反復中の化合物（I）の印刷を含みますプレート、ウェルあたり100μlのを使用してナ。コントロールを含む単一のウェルに同時に分析（II）複数の異なる化合物; （III）インキュベーション体積との大幅な減少。 （IV）、蛍光読み取りを使用して、より大きなダイナミックレンジ。単一のスライドを18倍、96ウェルプレートに相当するように計算することができます。

以下のプロトコルでは、製造および分析することが可能な任意の研究室は、マイクロアレイは、この小型化されたELISA形式を製造することができる必要がありますスポッティング。

プロトコル

注：特に指定のない限り、すべての工程は室温で実施されます。

1.アレイの構築

  1. グリカン調製とプレートのセットアップ
    1. 印刷バッファの株式を準備します。まず、第二リン酸ナトリウムの150mMのストック溶液の500ミリリットルを作ります。また、リン酸二水素ナトリウム溶液150 mMストック溶液50mlを加えます。 8.5のpHに到達するまでフラスコに、磁気攪拌棒及びpHメーターを使用して、ゆっくりと一塩基性溶液と第二リン酸ナトリウム溶液を滴定します。 0.005％へのTween-20を追加します。
    2. グリカンのサンプルを準備します。希薄PAA共役グリカン、（diLacNAc（Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ-PAA）、3SLNLN（Neu5Acα2-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ-PAA）と6SLNLN（Neu5Acα2-6Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ-PAA（ 図1A ））step1.1.1から印刷バッファには100μg/ mlに希釈される。一価グリカンdiLacNAc（Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ-（CH 2）3 NH 2、3SLNLN（Neu5Acα2-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ - （CH 2）3 NH 2）と6SLNLN（Neu5Acα2-6Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1- 4GlcNAcβ -ステップ1.1.1から印字バッファ内の100μMに（CH 2）3 NH 2））。最後に、グリッドマーカー/着陸灯として使用するために、アミン官能化染料を準備します。色素マーカースポットが1μMで印刷されています。
      注：Atto488-NHS色素は、我々の印刷に使用されます。しかし、スライドスキャナーによって読み取り可能な任意のアミン官能化色素は、この目的のために適切です。
    3. 印刷ロボットに使用される384ウェルマイクロタイタープレートへの転送各グリカンサンプルを10μl。密封されたチューブ中、-20℃での印刷緩衝溶液に保管未使用グリカン。 Tansfer印刷版への色素マーカー10μlの。
  2. 印刷
    注：すべてのSTEpsの懸念が触れたり、手袋を使用して行う必要があり、スライドを動かすこと。
    1. レイアウトの正しい構成に応じてプリントヘッドにアレイヤーピンを配置します。このレイアウトのすべてのサンプルと配列を印刷するには1ピンを使用します。同じサンプルのスポットは互いに横に正確に印刷されないように、それぞれの側に、一つの特徴をスキップ（機能は、特定の化合物の単一のスポットとして定義されている）、6のブロックでグリカンを印刷します。
      注：エンドユーザーが設定を決定する必要があります。
    2. 袋からスライドを削除し、オープンボックス、および各スライドに超高純度窒素ガスを吹き付けてその表面にあるかもしれない任意のダスト粒子やプラスチックの小片を削除します。アレイヤーステージ上に、側面をコーティングしたスライドの所望の数を、置きます。
    3. プログラムはアレイヤーは、印刷ピンの先端に過剰な液体を除去するために、ポリ-L-リジンコートスライド上に「事前スポット」3を使用して、ソースプレートに訪問当たり27スポットのパラメータを使用します
      1. MPU（主電源ユニット）と気候コントロールユニットの電源をオンにします。コンピュータ上のタイル解析ソフトウェアを開きます。
      2. プリントにレイアウトを選択します。 1単一のピン - アレイ1×1の印刷ツールの印刷に使用されるように、[オプション]→[ピンツールを選択します。ターゲットタブ→ツールアレイ定義→印刷パターンを選択して、ピッチ（スポット間距離）を追加し、行と列の数、印刷するサンプルを収容するために、サンプルの印刷パターン（この配列のために8 ×8の印刷パターンは、合計7の試料について340ミクロ​​ンのピッチ）で使用されます。
      3. ターゲット→スライドのレイアウトを選択し、48ウェル（4×12）のスライドテンプレートに各反復配列の印刷を可能にするために、ブロック間の距離をプログラムします。ソースを選択し、（6サンプルウェルと1色素マーカー十分に対応するために使用されます。このプリント7ソース・ピックアップのために）（1ピンを使用した場合、各試料について1）ソースピックアップの番号を追加します。
        注：ソースの対話はその数を示すためにGREENを有効にしてくださいソース訪問の印刷パターンで印刷されるサンプルが一致します。
      4. ターゲット→アダプタプレートを選択し、レイアウトをスライドさせ、スライド数を調整（5スライドは1プレスポッティングスライドでこの印刷のために一度に印刷されています）。
      5. プレスポッティングスライド（BLUE）の場所と "本当の"スライドに細心の注意を払って、トレイを活性化し、トレイにスライドの所望の数を追加するには、T1]ボタンをクリックして、トレイを解放します。
      6. 真空を遮断し、真空を有効にするには、[OK]をクリックし、残りのすべての真空ポートで、プレーンガラススライドを置きます。すべてのスライドが所定の位置に保持されていることを確認し、ホームポジションにトレイを戻すには、[OK]をクリックします。
      7. プレートホルダーに印刷版をロードし、ラックを所定の位置に正しく設定されていることを確認。 GOをクリックして、印刷処理を続行することができます。
    4. アレイあたり6スポットの反復で残りの24スポット（4列/ソース訪問）を印刷します。
    5. 384ウェルプレートをロードしますプリンタに印刷を開始します。 55と65％の間で印刷を通じて、印刷中に、相対湿度を維持。プリンタは5スライドを印刷した後に停止します。
      注：このアッセイにおいて、マイクロアレイは、特定の8×8パターンで印刷されているが、異なるマイクロアレイ印刷ロボットが目的のレイアウトを実現するために装置固有のプログラミングが必要になります。それは彼らの機器の仕様与えられた最も適切なパターンを決定するために、エンドユーザーに任されています。
  3. 加湿/固定化
    注：スライドの印刷が終了したら、彼らは一時的な固定化ステップとも呼ばれる加湿を受けます。印刷後を加湿するスポットを再湿潤剤および完全な遮断を確実にすることによって、サンプルの添付ファイルを均質化するのに役立ちます。
    1. すぐに30分の期間、印刷後100％の湿度チャンバ内のスライドを置きます。スライドを配置し、大きなガラス皿の底に平らに非常に湿った紙タオルを置くことによって、チャンバを構築このようないくつかの試験管ラックなどのラックのソート、印刷面を上にし、水分中のトラップにラップで密封する上で。
    2. 番号は、乾燥ボックス内のアルコール/溶媒耐性マーキングペンとストアと摺動します。一晩乾燥させます。
  4. 番号、ブロッキング、およびストレージ
    1. 50mMのホウ酸緩衝液中の50mMエタノールアミン - ブロッキングバッファーを準備します。まず、磁気撹拌棒を含むフラスコ中の50mMの最終濃度まで、のddH 2 Oに、ホウ酸を溶かします。すべての固体が溶解するまで撹拌プレート上の溶液を激しく撹拌します。絶えず撹拌しながら、希望の50 mMの濃度に到達するために16.54 Mストック溶液からエタノールアミンの適切な量を追加します。 9.2の最終pHに調整するための濃水酸化ナトリウムを追加します。
    2. 1時間ブロッキング緩衝液中に印刷されたスライドを浸します。
    3. 1時間後、ブロッキング緩衝液の余分な痕跡を除去するためのddH 2 Oでスライドをすすぎます。適切な廃棄物容器内のブロッキング緩衝液を廃棄してください。
    4. ガラス染色ホルダーとスピン乾燥にスライドを転送します。 5分間、10×gでの速度で、スイングプレートホルダーを装備した遠心機でそれらを配置することによりドライ配列。
    5. スライドが乾燥したら、それらは直ちに培養又は保存することができます。保管条件は、密封されたビニール袋で-20℃です。

2.グリカン結合タンパク質の分析

  1. ハイブリダイズする配列が収まるする加湿チャンバーを準備します。シンプルなチャンバースライドを休まれる時に湿らせたペーパータオルとラックと底部に積層パイレックス皿、で構成されています。
  2. ビオチン化レクチンを使用するSNA（ サンブカ黒質凝集素）とバッファをプロービング中10μgのストレプトアビジン555染料/ mlの+を2μg/ mlのECA（ エリスリナ属cristagalli凝集素）、（PBS + 0.01％のTween-20）。 HA（A /ベトナム/ 1203/04 H5N1およびA / KY / 07 H1N1、この例では）、使用のために以前に34を説明したように、事前複合化ミリリットルを20μg/の濃度を開始します。マウス-α-連鎖球菌：簡単に言えば、HAするブロッキング緩衝液中でヤギα - マウスAlexa647混合物（PBS + 3％BSA + 0.01％のTween-20）、4で：2：1のモル比。
    注：アレイは、グリカンが固定化され、（ 図1B）、検出されていることを確認するためにレクチンを用いてプローブされています。
  3. 384ウェルプレートに20μLのグリカン結合タンパク質 - 抗体混合液を移し、30分間氷上でインキュベートします。緩衝液10μlに10μlのサンプルを混合することによって、それらの適切なバッファ、8回で、1：シリアルレクチンおよびHAサンプル1を希釈。
  4. マイクロウェル表面へのサンプルのピペット8μlを、90分間、密封された加湿（100％RH）チャンバー内でインキュベートします。
  5. その後、PBSで4回エッジを保持し、PBS及び0.05％のTweenの混合物でそれらを4回浸漬することにより、一度にスライド1を洗浄し、脱イオンHで最終的に4回2 O.使い方ブロッキング工程で説明したのと同じ乾燥プロトコルは、10×gで5分間遠心機で乾燥したアレイをスピン。

3.スキャニングとデータ解析

注：グリカンマイクロアレイは、マイクロアレイスキャナーの製造元に応じて、異なる設定でスキャンすることができます。レーザパワーと分解能を変化させることにより、器具は、そのダイナミックレンジ（ 図1C）内の可能な限り多くの信号を用いて画像を生成することができます。

  1. 蛍光スライドスキャナを使用して、すぐに糖鎖結合性タンパク質とのインキュベーション後にアレイをスキャンします。スライドが正しく走査​​装置に挿入されていることを確認するように注意してください。
    1. オープンスキャンソフトウェア。プログラムを開くには、開始]をクリックします。スキャナのナビゲーションパネルメニューのスキャナ→接続または緑のボタン：スキャナに接続します。
    2. スキャナのオープンオートローダのドア。特定の順序でオートローダのスロットにスライドを置きます。オートローダのドアを閉じます。 Cl嫌なスキャナーでスライドを自動検出するツールのナビゲーションパネルの「ローダーを読んで」。
    3. スキャンパラメータを設定します。実験（ 例えば 635レーザーパワー高、検出ゲイン50％）への適切なスキャナ→スキャンパラメータ。スキャンスライド：スキャナ→スキャン。スキャン画像と名前個々のスキャンを保存するフォルダを作成することによって、パスを選択します。前実際のスキャンにこれを行います。各個別のスライドについて、この手順を繰り返します。スキャンを開始するには、[OK]をクリックします。
  2. 楽器を設定し、スライドをスキャンするスキャナソフトウェアを使用してください。設定スキャナは反復25％、50％及び75％の利得設定を増加させるとともに、低レーザーパワー（5ミリワット）でスキャンします。
    注：設定がテストされ、最適化されたが、各スキャンは、おそらく、光退色による色素の蛍光出力を低下させることができることを心に留めておくことができます。
    1. このようなMAPIXソフトウェアなどのオープンデータ収集および解析ソフトウェア。プログラムを開くには、開始]をクリックします。オープンスキャン画像：IMをオープン→ファイル年齢。オープンGALファイル：→オープングリッドを分析し、適切なGALファイルを選択します。
    2. グリッドを移動するイメージ→ブロックモード：ブロックモードに入ります。スライド上の適切な場所にグリッドを設定するグリッド・マーカーを使用します。印刷された配列を一致させるために、必要に応じて個々のブロックを調整します。
    3. ブロック内の個々のスポットの位置とサイズを調整するイメージ→スポットモード：スポットモードを入力します。一旦、全てのブロックとのスポットを調整し、所定の位置に、→測光計算を分析することにより、信号強度を測定しています。出力ファイルを保存します。
  3. スライドをスキャンが終了したら、画像が（ - G 図 1D）インストールされた画像処理プログラムとの間で信号を結合するために分析されます。画像分析のために、スキャンしたTIFF画像の上GAL（アレイリスト）ファイルをロードします。
    注：GALファイルには、各スポットの位置のスポットレイアウトパターンとアイデンティティの両方が含まれています。アレイ用のGALファイルは、CRです384ウェルソースプレート内のサンプルとその場所のアイデンティティを含むタブ区切りのテキストフ​​ァイルを使用して、プリンタソフトウェアによってeated。
  4. 適切GALグリッドを配置するために、マイクロアレイ上に印刷されたグリッドマーカー/着陸灯を使用してください。個々のスポットは、個別に移動する必要があるかもしれないが、よく印刷された配列は、一般的に、グリッド内のブロックを容易に配置することができるようになります。グリッド配置の後、ソフトウェアでスポット強度を収集し、タブ区切りのテキストフ​​ァイル（.txt）として保存。
    1. スプレッドシートプログラムを使用して、スキャナからの出力ファイルを開きます。フォルダの場所から適切なマクロファイルを開きます。 [表示]→[マクロ→RunMacroをクリックします。
      注：事前に書かれた、生の出力データをコピーして、不要な行や列を削除し、サンプルでデータをソート、信号の平均値マイナスバックグラウンド値を計算し、それぞれのグラフを含むスプレッドシートワークシートにで得られた値をプロットします6 SAMPのレは、アレイ上でテストされています。

結果

印刷、スキャン＆データ分析します

適切な印刷を確保するためには、スライド上の各アレイの輪郭を描くテフロンマスク内の斑点グリッドの正確なアライメントを持っていることが重要です。テフロンコーティングの性質に、印刷中に、スポットがMPXスライド上の肉眼で見ることができません。注目は、ポリ-L-リジンコー...

ディスカッション

IAV受容体の特異性を評価することは、鳥ウイルスのパンデミックの可能性を分析する上で重要なステップです。ウイルスによるシアル酸の認識は、そのような細胞からへの結合および放出などのいくつかの生物学的性質に連結されています。鳥ウイルスが結合α2-6達成し、種の壁は、パンデミック対策を可能に交差するの知識は、アミノ酸の変異が必要です。いくつかのアッセイは、受容体?...

開示事項

The authors have nothing to disclose

謝辞

この作品は、スクリップスマイクロアレイ基盤施設、及び疾病対策センター（JCP）からの契約によって部分的にサポートされていました。 RPdVは、科学研究費オランダ機構（NWO）からルビコンとVENI助成金の受取人です。 NIGMS助成金GM62116（JCP）によって資金を供給機能グライコミクスのためのコンソーシアム（http://www.functionalglycomics.org/）は、この研究で使用されるいくつかのグリカンを提供します。これは、スクリップス研究所から出版29113です。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
NEXTERION® Slide H MPX-48 Schott1091525Microwell slides
ProScanArray Plus PerkinElmerdiscontinuedconfocal microarray scanner
Innoscan 1100AL Scanner/Mapix SoftwareInnopsys-confocal microarray scanner
MicroGrid II Digilab-microaray printer
SNAVector LabsB-1305 Plant Lectin
ECAVector LabsB-1145 Plant Lectin
Anti-Strep AntibodyIBA2-1509-001 Anitbody for HA binding
Anti-Mouse Alexa-647LifeA-21235Anitbody for HA binding
Tween-20SigmaP2287 detergent
di-basic Sodium PhosphateSigma255793printing buffer component
mono-basic Sodium phosphateSigma229903 printing buffer component
poly-l-lysine solutionSigmaP8920 pre-spotting slide component
sodium hydroxideSigma221465pre-spotting slide component
ethanolSigma493546pre-spotting slide component
phosphate buffered salineCorning46-013-CMincubation/washing buffer
SMP4B pinsTelechemSMP4Bprinting pin
Compressed Nitrogen (Grade5)PraxairUN1066general dusting/drying tool
Boric AcidSigmaB6768-500GSlide blocking reagent
ethanolamineSigmaE9508-500MLSlide blocking reagent
Atto 488AttoTecAD 488-91Gridmarker on array
PAA-LNLNConsortium for Functional GlycomicsPA368Spotted glycans
PAA-3SLNLNConsortium for Functional GlycomicsPA362Spotted glycans
PAA-6SLNLNConsortium for Functional GlycomicsPA343Spotted glycans
LNLNConsortium for Functional GlycomicsTe98Spotted glycans
3SLNLNConsortium for Functional GlycomicsTe175Spotted glycans
6SLNLNConsortium for Functional GlycomicsTe176Spotted glycans
384-well microtiter plateMatrix TechCorp4361Printing plate
VWR lab markerVWR52877-150Slide Numbering
Wheaton slide staining dishSigmaZ103969-1EABlocking and Drying

参考文献

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