Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.
Method Article
Using a printed glycan microarray strategy, a conventional 96-well plate assay was miniaturized for analysis of influenza A virus hemagglutinin avidity and specificity for sialic acid containing receptors.
fonksiyonel reseptörler hücre içine giriş kazanmak için İnfluenza A virüsü (IAV) hemaglutininler hücre yüzeyinde sialik asitleri tanır. Yabani kuşları IAV için doğal rezervuar, ama IAV kümes hayvanları, domuz, at ve insanlara türler bariyerini geçebilir. Kuş virüsler insan virüsleri tercihen bir α2-6 bağlantı (insan-tipi reseptörler) ile sialik asit tanımak ise bir α2-3 bağlantı (avian tip reseptörler) tarafından sondan galaktoz bağlı sialik asit tanır. avyan virüs insan tipi reseptörlere uyum olup olmadığını izlemek için çeşitli yöntemler kullanılabilir. Sentetik sialosides farklı kütüphaneleri ile glikan mikroarray'ler giderek reseptör özgüllüğünü değerlendirmek için kullanılır. Bununla birlikte, bu teknik, birleşmelere ölçmek için kullanılır. avidite ölçümü tipik olarak geleneksel polipropilen 96 oyuklu plakalara adsorbe glıkanlara seri olarak seyreltilmiş hemaglutinin veya virüs bağlanmasının değerlendirilmesi ile elde edilir. a Bu deneyde, glikanlar2-3 ya α2-6 sialik asitler biyotine bağlı olan ve streptavidin plakaları, adsorbe ya da doğrudan plastik adsorbe poliakrilamid (PAA) kuple edilir edilmiştir. Biz önemli ölçüde doğrudan mikro kuyu cam slaytlar PAA-bağlantılı sialosides ve onların olmayan PAA-bağlantılı muadilleri yazdırarak bu testte küçültülmüş var. tek bir slayt üzerinde 48 dizileri ile bu set-up, 6 glıkan olmayan iki sialilatlı kontrolleri dahil olmak üzere 6 farklı glikanlar, sorguya, 8 dilüsyonlarda bağlayıcı proteinlerin aynı anda tahlilleri sağlar. Bu geleneksel plaka deneyinde 18x 96 oyuklu plakalara eşdeğerdir. glikan dizi formatında bileşikleri ve biyolojik tüketimini azaltır ve böylece büyük ölçüde verimliliği arttırır.
Yabani kuşları IAV doğal rezervuarı vardır, ama IAV kümes hayvanları ve insanlar da dahil olmak üzere memelilerde, türün engelini geçmek edebilmektedir. İnsan virüsler α2-6 bağlantılı sialik asitleri (insan-tipi reseptörler) bağlamak oysa Kuş iAVS, α2-3 bağlantılı sialik asitleri (avian tip reseptörler) tanır. Etkin bir şekilde çoğaltılması ve avyan IAV insan tipi reseptör 1 bağlanma ihtiyacı insanlar arasında aktarabilmelidir için.
IAVS kendi hemagglutinin (HA) ve nöraminidaz (NA) zarf glikoproteinler antijenliğini karakterize seroloji dayalı ayrılır. UA, viral yaşam çevrimi ve yarılır sialik asit 2 diğer ucunda reseptör imha edici enzim ise HA, sialik asitleri bağlanır. H1N1, H2N2 ve H3N2 dahil olmak üzere tüm insan bulaşmasını virüsleri, bir kuş kökeni 3 var. İnsan geçitler birkaç kuş yıllardır son iki aşkın H5N1, H7N7, H7N9 ve ile meydana gelmiş olan en iyi bilinen; however, diğer alt tipler daha düzensiz insanları enfekte olan (H6N1, H7N1, • H7N2, H9N2, H10N7, H10N8) 4. Neyse ki, bu virüslerin hiçbiri tam olarak insan tipi α2-6 bağlı sialik asit reseptörleri 5-8 adapte olmuş gibi görünüyor. kuş ya da diğer zoonotik virüslerin Adaptasyon insan sağlığı üzerinde yıkıcı bir etkisi olabilir insan konaklarda çoğaltma ve iletim karşılamak için. Bu nedenle, bu virüsler ortaya çıkan grip virüslerinin dünya çapında gözetim yardımcı olacak insan tipi reseptörlere bağlanmasının gelişen nasıl ön bilgi.
Reseptör tercihi belirlenmesi ilk farklı türlerin eritrositler kullanılarak aydınlatılmıştır ve grip araştırmacılar 9-12 arasında bir tercih tahlil kalır oldu. avyan virüs α2-3 sialik asit ve sialik asit bağlantılı α2-6 insan virüsleri tanır gösterim orijinal enzimatik li her ihtiva edecek şekilde eritrositlerin hemaglutinasyonu kullanılarak bir deneyde dayalı13,14 nkages. okuma hemaglütinasyon, virologists için standart bir deney olsa da, altta yatan glıkan yapıları, sadece uç bağlantısı tanımlanmış değildir. Ayrıca, hücrelerin yeniden sialylate için kullanılan Sıyalıltransferazlar, sınırlı kullanılabilirlik, bu testte 15-18 kullanımını kısıtlamıştır. Daha sonra, reseptör bağlanma tercihleri belirleyen diğer yöntemler plaka bazlı tahlillerde 19,20 poli-akrilamid (PAA) ya da poli-glutamat (PGA) yapılarıyla bağlantılı sialilatlı glıkan yapıları kullanılarak eklenir. Çeşitli varyasyonlarının, sağlam, güvenilir ve çok hassas ELISA tipi deney 21-23 sonuçlanan, her biri mikrotitre plakaları için glikanlar veya virüs ya kaplanması mümkündür. Seçenek olarak ise, biotin bağlantılı glıkanlar PAA / PGA yerini alabilir ve streptavidin kaplı plakalar 2,24 konjuge edilebilir. bazı özel sera gerekli olabilir, ancak ELISA PAA bağlantılı standart ve çeşitli glıkanlar kolaylıkla are commercially ve olmayan piyasada mevcut (Fonksiyonel Glikomik için Konsorsiyumu (http://www.functionalglycomics.org)).
Glikan mikroarray teknolojileri çok farklı glukanlardır lekeli olarak, reseptör özgüllüğünü belirlemek için paha biçilmez bir araç olarak ortaya çıkmıştır, ve farklı yapıları geniş bir dizi bağlayıcı tek bir tahlil 25-29 içinde değerlendirilebilir. Bu yapılara IAV bağlanmasının IAV, tercihen 30-33 kabul glıkan yapılarının daha iyi anlaşılmasını sağlar. Glıkan mikroarray'ler bağlayıcı tahlili gerçekleştirmek için örnek hacminin küçük miktarlarda ihtiyaç ve sadece nokta (2 nl) başına glıkanın dakika miktarda kullanır. Ancak, bu diziler genelde glukanlardır reseptörlerinin özgüllüğünü değerlendirmek için sadece kullanılır. Birden fazla konsantrasyon aralıklarında birden virüsler veya hemagglutinin proteinlerin analizi nedeniyle gerekli slaytlar sayısına engelleyici olabilir. Ayrıca, bugüne kadar, hiçbir nispi avidite tahlil glikan ar kullanılarak geliştirilmiştirışını teknikleri.
kıyasla glıkan mikrodizi teknikleri ve ELISA bazlı deneylerde PAA-bağlantılı glıkanların duyarlılık elde düşük örnek gereksinimi birleştirmek için, benzer ya da daha iyi çözünürlük ile yüksek verimli analizi için izin verecek bir çok-çukurlu glıkan dizi geliştirmeye çalıştılar geleneksel ELISA bazlı bir deney için. Aynı zamanda, biz tüketilen biyolojik ve raportör kimyasalların miktarını en aza indirmek istedik. Nihai sonuç, özellikle IAV özgüllük izlemek için geliştirilmiş bir minyatür avidite miktar tayini testinde, ve diğer glıkan bağlayıcı proteinleri değerlendirmek için de geçerlidir. Teflon maske ile 48 mikro kuyulara ayrılmış bir cam slayt kullanarak 6 farklı glukanlardır kuyu başına 6 tekrarlı fark vardır. mikroarray platformu reseptörü aynı eğilimler çeşitli avantajlara sahip makro ELISA formatında görülen bağlayıcı tanıyor. Bu çok sayıda satır kaplama, karşı minimum numune kullanılarak (I) 6 tekrar bileşiğin baskı dahil IOyuk başına 100 ul kullanılarak na plakası; (II) çok farklı bileşikler kontrolleri de dahil olmak üzere tek bir kuyuda, aynı anda analiz; (III) bir kuluçkalama hacminde ve büyük bir azalma; (IV) floresan okuma kullanarak daha büyük bir dinamik aralık. Tek bir slayt 18x 96 oyuklu plakalara denk olduğu hesaplanabilir.
Aşağıdaki protokol imalatı ve analiz herhangi bir laboratuvar özelliğine sahip mikroarray'ler bu minyatür ELISA biçimi üretmek gerekir gördü.
NOT: Aksi belirtilmedikçe tüm aşamalar oda sıcaklığında gerçekleştirilir.
1. Dizi İnşaat
2. Analiz Glycan Bağlayıcı Proteinler
3. Tarama ve Veri Analizleri
NOT: glikan mikroarrayler mikrodizin tarayıcının üreticisine bağlı olarak, farklı ayarlarla taranabilir. Lazer gücü ve çözünürlüğü değiştirilerek, enstrüman dinamik aralık (Şekil 1C) içinde mümkün olduğunca çok sayıda sinyallerle bir görüntü üretebilir.
Baskı, Tarama ve Veri analizleri
Uygun baskı sağlamak için, slayt, her dizi delineates teflon maske içinde benekli ızgara, doğru hizalama için hayati önem taşımaktadır. nedeniyle teflon kaplama doğası gereği, yazdırma sırasında, lekeler MPX slaytlar üzerinde çıplak gözle görülemez. Dikkat poli-L-lizin kaplı slaytlar üzerinde ön lekelerin ortaya sonra ödenir. Doğrudan baskıdan sonra, her slayt nede...
IAV reseptör özgüllüğünü değerlendirmek kuş virüslerinin pandemik potansiyeli analizinde önemli bir adımdır. virüs, sialik asit tanıma bu hücreden bağlanarak ve salma gibi biyolojik özellikleri ile bağlantılıdır. kuş virüsleri bağlayıcı α2-6 ulaşmak ve türlerin bariyer pandemik hazırlık sağlayan geçmek için Bilgi amino asit mutasyonları gereklidir. Çeşitli deneyler reseptör özelliklerini belirlemek için kullanılır; Ancak, tüm tersi sadece ölçüm avidite ve özgünl?...
The authors have nothing to disclose
Bu çalışma Scripps Mikroarray Core Tesisleri'nde, ve Centers for Disease Control (JCP) bir sözleşme ile kısmen desteklenmiştir. RPdV Hollanda Bilimsel Araştırma Örgütü (NWO) bir Rubicon ve VENI hibe bir alıcı. NIGMS hibe GM62116 (JCP) tarafından finanse Konsorsiyumu Fonksiyonel Glikomik için (http://www.functionalglycomics.org/) Bu çalışmada kullanılan çeşitli glikan sağladı. Bu Scripps Araştırma Enstitüsü'nden yayın 29.113 olduğunu.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
NEXTERION® Slide H MPX-48 | Schott | 1091525 | Microwell slides |
ProScanArray Plus | PerkinElmer | discontinued | confocal microarray scanner |
Innoscan 1100AL Scanner/Mapix Software | Innopsys | - | confocal microarray scanner |
MicroGrid II | Digilab | - | microaray printer |
SNA | Vector Labs | B-1305 | Plant Lectin |
ECA | Vector Labs | B-1145 | Plant Lectin |
Anti-Strep Antibody | IBA | 2-1509-001 | Anitbody for HA binding |
Anti-Mouse Alexa-647 | Life | A-21235 | Anitbody for HA binding |
Tween-20 | Sigma | P2287 | detergent |
di-basic Sodium Phosphate | Sigma | 255793 | printing buffer component |
mono-basic Sodium phosphate | Sigma | 229903 | printing buffer component |
poly-l-lysine solution | Sigma | P8920 | pre-spotting slide component |
sodium hydroxide | Sigma | 221465 | pre-spotting slide component |
ethanol | Sigma | 493546 | pre-spotting slide component |
phosphate buffered saline | Corning | 46-013-CM | incubation/washing buffer |
SMP4B pins | Telechem | SMP4B | printing pin |
Compressed Nitrogen (Grade5) | Praxair | UN1066 | general dusting/drying tool |
Boric Acid | Sigma | B6768-500G | Slide blocking reagent |
ethanolamine | Sigma | E9508-500ML | Slide blocking reagent |
Atto 488 | AttoTec | AD 488-91 | Gridmarker on array |
PAA-LNLN | Consortium for Functional Glycomics | PA368 | Spotted glycans |
PAA-3SLNLN | Consortium for Functional Glycomics | PA362 | Spotted glycans |
PAA-6SLNLN | Consortium for Functional Glycomics | PA343 | Spotted glycans |
LNLN | Consortium for Functional Glycomics | Te98 | Spotted glycans |
3SLNLN | Consortium for Functional Glycomics | Te175 | Spotted glycans |
6SLNLN | Consortium for Functional Glycomics | Te176 | Spotted glycans |
384-well microtiter plate | Matrix TechCorp | 4361 | Printing plate |
VWR lab marker | VWR | 52877-150 | Slide Numbering |
Wheaton slide staining dish | Sigma | Z103969-1EA | Blocking and Drying |
Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi
Izin talebiThis article has been published
Video Coming Soon
JoVE Hakkında
Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır