JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Using a printed glycan microarray strategy, a conventional 96-well plate assay was miniaturized for analysis of influenza A virus hemagglutinin avidity and specificity for sialic acid containing receptors.

Özet

fonksiyonel reseptörler hücre içine giriş kazanmak için İnfluenza A virüsü (IAV) hemaglutininler hücre yüzeyinde sialik asitleri tanır. Yabani kuşları IAV için doğal rezervuar, ama IAV kümes hayvanları, domuz, at ve insanlara türler bariyerini geçebilir. Kuş virüsler insan virüsleri tercihen bir α2-6 bağlantı (insan-tipi reseptörler) ile sialik asit tanımak ise bir α2-3 bağlantı (avian tip reseptörler) tarafından sondan galaktoz bağlı sialik asit tanır. avyan virüs insan tipi reseptörlere uyum olup olmadığını izlemek için çeşitli yöntemler kullanılabilir. Sentetik sialosides farklı kütüphaneleri ile glikan mikroarray'ler giderek reseptör özgüllüğünü değerlendirmek için kullanılır. Bununla birlikte, bu teknik, birleşmelere ölçmek için kullanılır. avidite ölçümü tipik olarak geleneksel polipropilen 96 oyuklu plakalara adsorbe glıkanlara seri olarak seyreltilmiş hemaglutinin veya virüs bağlanmasının değerlendirilmesi ile elde edilir. a Bu deneyde, glikanlar2-3 ya α2-6 sialik asitler biyotine bağlı olan ve streptavidin plakaları, adsorbe ya da doğrudan plastik adsorbe poliakrilamid (PAA) kuple edilir edilmiştir. Biz önemli ölçüde doğrudan mikro kuyu cam slaytlar PAA-bağlantılı sialosides ve onların olmayan PAA-bağlantılı muadilleri yazdırarak bu testte küçültülmüş var. tek bir slayt üzerinde 48 dizileri ile bu set-up, 6 glıkan olmayan iki sialilatlı kontrolleri dahil olmak üzere 6 farklı glikanlar, sorguya, 8 dilüsyonlarda bağlayıcı proteinlerin aynı anda tahlilleri sağlar. Bu geleneksel plaka deneyinde 18x 96 oyuklu plakalara eşdeğerdir. glikan dizi formatında bileşikleri ve biyolojik tüketimini azaltır ve böylece büyük ölçüde verimliliği arttırır.

Giriş

Yabani kuşları IAV doğal rezervuarı vardır, ama IAV kümes hayvanları ve insanlar da dahil olmak üzere memelilerde, türün engelini geçmek edebilmektedir. İnsan virüsler α2-6 bağlantılı sialik asitleri (insan-tipi reseptörler) bağlamak oysa Kuş iAVS, α2-3 bağlantılı sialik asitleri (avian tip reseptörler) tanır. Etkin bir şekilde çoğaltılması ve avyan IAV insan tipi reseptör 1 bağlanma ihtiyacı insanlar arasında aktarabilmelidir için.

IAVS kendi hemagglutinin (HA) ve nöraminidaz (NA) zarf glikoproteinler antijenliğini karakterize seroloji dayalı ayrılır. UA, viral yaşam çevrimi ve yarılır sialik asit 2 diğer ucunda reseptör imha edici enzim ise HA, sialik asitleri bağlanır. H1N1, H2N2 ve H3N2 dahil olmak üzere tüm insan bulaşmasını virüsleri, bir kuş kökeni 3 var. İnsan geçitler birkaç kuş yıllardır son iki aşkın H5N1, H7N7, H7N9 ve ile meydana gelmiş olan en iyi bilinen; however, diğer alt tipler daha düzensiz insanları enfekte olan (H6N1, H7N1, • H7N2, H9N2, H10N7, H10N8) 4. Neyse ki, bu virüslerin hiçbiri tam olarak insan tipi α2-6 bağlı sialik asit reseptörleri 5-8 adapte olmuş gibi görünüyor. kuş ya da diğer zoonotik virüslerin Adaptasyon insan sağlığı üzerinde yıkıcı bir etkisi olabilir insan konaklarda çoğaltma ve iletim karşılamak için. Bu nedenle, bu virüsler ortaya çıkan grip virüslerinin dünya çapında gözetim yardımcı olacak insan tipi reseptörlere bağlanmasının gelişen nasıl ön bilgi.

Reseptör tercihi belirlenmesi ilk farklı türlerin eritrositler kullanılarak aydınlatılmıştır ve grip araştırmacılar 9-12 arasında bir tercih tahlil kalır oldu. avyan virüs α2-3 sialik asit ve sialik asit bağlantılı α2-6 insan virüsleri tanır gösterim orijinal enzimatik li her ihtiva edecek şekilde eritrositlerin hemaglutinasyonu kullanılarak bir deneyde dayalı13,14 nkages. okuma hemaglütinasyon, virologists için standart bir deney olsa da, altta yatan glıkan yapıları, sadece uç bağlantısı tanımlanmış değildir. Ayrıca, hücrelerin yeniden sialylate için kullanılan Sıyalıltransferazlar, sınırlı kullanılabilirlik, bu testte 15-18 kullanımını kısıtlamıştır. Daha sonra, reseptör bağlanma tercihleri ​​belirleyen diğer yöntemler plaka bazlı tahlillerde 19,20 poli-akrilamid (PAA) ya da poli-glutamat (PGA) yapılarıyla bağlantılı sialilatlı glıkan yapıları kullanılarak eklenir. Çeşitli varyasyonlarının, sağlam, güvenilir ve çok hassas ELISA tipi deney 21-23 sonuçlanan, her biri mikrotitre plakaları için glikanlar veya virüs ya kaplanması mümkündür. Seçenek olarak ise, biotin bağlantılı glıkanlar PAA / PGA yerini alabilir ve streptavidin kaplı plakalar 2,24 konjuge edilebilir. bazı özel sera gerekli olabilir, ancak ELISA PAA bağlantılı standart ve çeşitli glıkanlar kolaylıkla are commercially ve olmayan piyasada mevcut (Fonksiyonel Glikomik için Konsorsiyumu (http://www.functionalglycomics.org)).

Glikan mikroarray teknolojileri çok farklı glukanlardır lekeli olarak, reseptör özgüllüğünü belirlemek için paha biçilmez bir araç olarak ortaya çıkmıştır, ve farklı yapıları geniş bir dizi bağlayıcı tek bir tahlil 25-29 içinde değerlendirilebilir. Bu yapılara IAV bağlanmasının IAV, tercihen 30-33 kabul glıkan yapılarının daha iyi anlaşılmasını sağlar. Glıkan mikroarray'ler bağlayıcı tahlili gerçekleştirmek için örnek hacminin küçük miktarlarda ihtiyaç ve sadece nokta (2 nl) başına glıkanın dakika miktarda kullanır. Ancak, bu diziler genelde glukanlardır reseptörlerinin özgüllüğünü değerlendirmek için sadece kullanılır. Birden fazla konsantrasyon aralıklarında birden virüsler veya hemagglutinin proteinlerin analizi nedeniyle gerekli slaytlar sayısına engelleyici olabilir. Ayrıca, bugüne kadar, hiçbir nispi avidite tahlil glikan ar kullanılarak geliştirilmiştirışını teknikleri.

kıyasla glıkan mikrodizi teknikleri ve ELISA bazlı deneylerde PAA-bağlantılı glıkanların duyarlılık elde düşük örnek gereksinimi birleştirmek için, benzer ya da daha iyi çözünürlük ile yüksek verimli analizi için izin verecek bir çok-çukurlu glıkan dizi geliştirmeye çalıştılar geleneksel ELISA bazlı bir deney için. Aynı zamanda, biz tüketilen biyolojik ve raportör kimyasalların miktarını en aza indirmek istedik. Nihai sonuç, özellikle IAV özgüllük izlemek için geliştirilmiş bir minyatür avidite miktar tayini testinde, ve diğer glıkan bağlayıcı proteinleri değerlendirmek için de geçerlidir. Teflon maske ile 48 mikro kuyulara ayrılmış bir cam slayt kullanarak 6 farklı glukanlardır kuyu başına 6 tekrarlı fark vardır. mikroarray platformu reseptörü aynı eğilimler çeşitli avantajlara sahip makro ELISA formatında görülen bağlayıcı tanıyor. Bu çok sayıda satır kaplama, karşı minimum numune kullanılarak (I) 6 tekrar bileşiğin baskı dahil IOyuk başına 100 ul kullanılarak na plakası; (II) çok farklı bileşikler kontrolleri de dahil olmak üzere tek bir kuyuda, aynı anda analiz; (III) bir kuluçkalama hacminde ve büyük bir azalma; (IV) floresan okuma kullanarak daha büyük bir dinamik aralık. Tek bir slayt 18x ​​96 oyuklu plakalara denk olduğu hesaplanabilir.

Aşağıdaki protokol imalatı ve analiz herhangi bir laboratuvar özelliğine sahip mikroarray'ler bu minyatür ELISA biçimi üretmek gerekir gördü.

Protokol

NOT: Aksi belirtilmedikçe tüm aşamalar oda sıcaklığında gerçekleştirilir.

1. Dizi İnşaat

  1. Glycan Hazırlama ve Plaka Kur
    1. baskı tampon stok hazırlayın. Ana dibazik sodyum fosfat, 150 mM stok çözeltisi, 500 ml yapmak. Ayrıca monobazik sodyum fosfat solüsyonu, 150 mM'lik bir stok çözeltiden 50 ml yapmak. Bir şişe içinde, 8.5 olan bir pH elde edilene kadar yavaş yavaş monobazik çözeltisi ile iki bazlı sodyum fosfat çözeltisi titre, karıştırma çubuğu ve pH metre manyetik kullanılmıştır. % 0.005 Tween-20 ekleyin.
    2. glıkan örnekleri hazırlayın. Paa konjüge glikanlar, (diLacNAc (Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ-PAA), 3SLNLN (Neu5Acα2-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ-PAA) ve 6SLNLN (Neu5Acα2-6Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ-PAA (Şekil 1A seyreltilir )) 100 ug seyreltilmiş edilecek / step1.1.1. Tek değerli glıkanlardan tampon baskı mi,diLacNAc (Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ- (CH2) 3, NH2, 3SLNLN (Neu5Acα2-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ - (CH2) 3 NH2) ve 6SLNLN (Neu5Acα2-6Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1- 4GlcNAcβ - adım 1.1.1 baskı tamponu içinde 100 | iM kadar (CH2) 3, NH2)). Son olarak, ızgara belirteçleri / iniş ışıkları olarak kullanmak için, amin işlevselleştirilmiş boyaları hazırlar. Boya işaretleyici noktalar 1 uM'de yazdırılır.
      NOT: Atto488-NHS boya bizim baskı kullanılmaktadır. Ancak, sürgülü tarayıcı tarafından okunabilen herhangi bir amin işlevselleştirilmiş boya bu amaç için uygundur.
    3. Transfer baskı robot için kullanılan 384-çukurlu mikrotiter plakalarına her glıkan örnek 10 ul. sızdırmaz tüplerde -20 ° C'de baskı tampon çözeltisi içinde Kullanılmayan glıkanlar. Tansfer baskı plakasına boya marker 10 ul.
  2. Baskı
    NOT: Tüm steps endişe dokunmadan veya eldiven ile yapılmalıdır slaytlar hareket olduğunu.
    1. düzeni doğru yapılandırmasına göre baskı kafasına arrayer işaretçilerine yerleştirin. Bu düzen için tüm örnekler ve diziler yazdırmak için bir iğne kullanın. Aynı örnek noktaları birbirlerinin yanında tam olarak basılı olmayan şekilde, her bir tarafında, bir özelliğe atlama (özelliği, belirli bir bileşiğin, tek bir nokta olarak tanımlanır), altı blok glikanlar Baskı.
      NOT: Son kullanıcı yapılandırmasını karar vermelidir.
    2. çanta, açık kutuları slaytları çıkarın ve her slayt ultra-yüksek saflıkta Azot gazı üfleme yüzeylerinde olabilecek toz parçacıkları veya plastik küçük parçalar çıkartın. arrayer sahnede, yukarı slaytlar istenilen sayıda, kaplamalı tarafı yerleştirin.
    3. Program arrayer, baskı pimleri ucunda aşırı sıvı kaldırmak için, poli-L-lizin kaplı slaytlar üzerine "ön noktalar" 3 kullanarak, kaynak plakasına ziyaret başına 27 noktalar parametreleri kullanmak
      1. MPU (Ana Güç Ünitesi) ve İklim Kontrol Birimi açın. bilgisayarda Açık Fayans Analizi yazılımı.
      2. Yazdırmak için seçin düzen. 1 tek pin - Seçenek → Pin Aracı dizisi 1 x 1 Yazıcı aracı yazdırmak için kullanılacak seçin. Hedef sekmesi → Aracı Dizi Tanımı → Baskı Desen seçin ve (nokta-to-spot mesafesi), satırlar ve örnekleri karşılamak için sütun sayısı basılacak sahayı ekleyin ve bu dizinin bir 8 için numune baskı kalıbı ( x 8 baskı desen 7 toplam numuneler için 340 mikron sahada) kullanılır.
      3. Hedef → Slayt Düzeni seçin ve 48-kuyu (4 x 12) slayt şablonuna her kopyalayan dizinin baskı izin bloğu-blok mesafeyi programlamak. Kaynak seçin ve (6 numune kuyuları ve 1 boya işaretleyici iyi karşılamak için kullanılacak olan bu baskı 7 kaynak alıcılar için) (1 pimi kullanırken her bir örnek için 1) kaynak alıcılar sayısını ekleyin.
        NOT: YEŞİL açmalısınız kaynak diyalog numarası olduğunu göstermek içinKaynak ziyaretleri baskı kalıbı içinde basılacak örnekleri eşleşir.
      4. Hedef → Adaptör Plakası seçin ve Düzen slayt hazırlama ve sayısını ayarlamak (5 slaytlar 1 ön tespit slayt bu baskı için bir kerede yazdırılır).
      5. Ön lekelenme slayt (MAVİ) ve "gerçek" slaytlar yerleri yakından ilgilenerek, tepsiyi etkinleştirmek ve tepsiye slaytlar istenilen sayıda eklemek için T1 butonuna tıklayarak tepsiyi serbest bırakın.
      6. vakum engellemek ve vakum etkinleştirmek için Tamam'a tıklayın kalan tüm vakum portlarında düz cam slaytlar yerleştirin. Tüm slaytlar yerinde tutulur emin olun ve ana konumuna tepsiyi geri dönmek için Tamam'a tıklayın.
      7. plaka tutucu içine baskı plakasını yükleyin ve raf yerine doğru ayarlanmış olduğundan emin olun. GO tıklayın ve baskı süreci devam etmesine izin.
    4. dizi başına 6 noktalar çoğaltır kalan 24 noktalar (4 diziler / kaynak ziyareti) yazdırın.
    5. 384 gözlü levhalar yükve yazıcının içine yazdırmaya başlamak. 55 ve% 65 arasında baskı boyunca, baskı sırasında, bağıl nemi muhafaza edin. Yazıcı 5 slaytlar yazdırdıktan sonra durur.
      NOT: Bu tahlilde mikroarray belirli bir 8 x 8 desen baskılı edilirken, farklı mikroarray baskı robotları istenen düzeni sağlamak için ekipman özel programlama gerektirir. Bu onların ekipmanların özellikleri verilen en uygun desen belirlemek için son kullanıcıya kadar.
  3. Nemlendirme / Sabitleme
    NOT: slaytlar baskı bitirdikten sonra, geçici bir immobilizasyon adımı olarak da adlandırılan nemlendirme uğrarlar. sonrası baskı nemlendirme yeniden ıslatma noktalar ve tam engelleme sağlayarak örnek eki homojenize yardımcı olur.
    1. Hemen 30 dakikalık bir süre için baskı sonra% 100 nem odasında slaytlar koyun. slaytlar, büyük bir cam çanak alt düz çok ıslak kağıt havlu koyarak koyarak odasına ConstructBazı tür bir test tüpü raf, baskı tarafı yukarı olarak raf, tür ve nem tuzak plastik wrap ile sızdırmazlık üzerinde.
    2. Number kuruma kutusunda bir alkol / solvent dirençli işaretleme kalemi ve mağaza ile slaytlar. Gecede birbirinden ayrılacak.
  4. Numaralandırma, Engelleme ve Depolama
    1. 50 mM borat tamponu 50 mM etanolamin - engelleme tampon hazırlayın. İlk olarak, bir manyetik karıştırma çubuğu içeren bir şişe içinde 50 mM nihai konsantrasyona kadar, GKD 2 O, borik asit çözülür. tüm katı çözünene kadar bir karıştırma plakası üzerinde kuvvetli bir şekilde solüsyonu ilave edin. Sürekli karıştırılırken, arzu edilen 50 mM konsantrasyon elde etmek üzere, bir 16.54 M stok çözeltisinden etanolamin uygun miktarda. 9.2'lik bir son pH ayarlamak için konsantre sodyum hidroksit ekleyin.
    2. 1 saat engelleme tampon çözeltisi içinde basılmış slaytlar daldırın.
    3. 1 saat sonra, tampon engelleme herhangi bir aşırı izlerini kaldırmak için GKD 2 O slaytlar durulayın.Uygun bir atık konteynerine engelleme tampon imha edin.
    4. Cam boyama sahiplerine slaytlar aktarın ve kuru dönerler. 5 dakika için 10 x g hızında, sallanma plaka tutucular ile donatılmış bir santrifüje yerleştirerek Kuru diziler.
    5. slaytlar kuru sonra, hemen kuluçkaya veya saklanabilir. Depolama koşulları kapalı bir plastik torba içinde -20 ° C 'dir.

2. Analiz Glycan Bağlayıcı Proteinler

  1. diziler uyacak hibridize edilecek olan nemlendirilmiş bir odada hazırlayın. Basit bir bölme nemlendirilmiş kağıt havlu ve slaytlar dinlenme olacak bunun üzerine bir raf ile alt katmanlı bir Pyrex çanak oluşur.
  2. Biyotinile lektinler kullanarak, SNA (Sambuka nigra aglutinin) ve tampon tarama 10 ug Streptavidin-555 boya / ml + 2 ug / ml ECA (Erythrina cristagalli aglutinin), (PBS +% 0.01 Tween-20). HA (bu örnekte A / Vietnam / 1203-1204 H5N1 A / KY / 07 H1N1), kullanım içinDaha önce tarif edildiği gibi 34, 20 ug bir başlangıç ​​konsantrasyonu mi, önceden kompleks /. Fare-α-Strep: Kısaca, bir HA hale blokaj tamponunda Keçi α-fare-Alexa647 karışımı (PBS +% 3 BSA +% 0.01 Tween-20), bir, 4: 2: 1 mol oranında.
    NOT: Dizi lektinler ile incelendi glukanlardır hareketsiz ve algılanabilir (Şekil 1B) olduğunu tespit etmek için.
  3. 384 plaka 20 ul glıkan bağlayıcı protein-antikor karışımı çözeltisini ve 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edilir. tampon 10 ul örnek 10 ul karıştırılarak, bunların uygun bir tampon, 8 kez, 1: seri olarak lektin ve HA örnekleri 1 seyreltin.
  4. Pipet 8 mikro-çukurlu yüzeye örnek ul ve 90 dakika için sızdırmaz nemlendirme (% 100 bağıl nem) odasında inkübe edilir.
  5. Deiyonize H2O kenarları tutarak ve bir PBS karışımı ve% 0.05 Tween içinde dört kez onları daldırılarak seferinde slaytlar bir yıkama, PBS içinde daha sonra dört kez, ve son olarak da dört defa kullanmaengelleme adımında tarif edilen aynı kurutma protokolünü 10 x g'de 5 dakika boyunca santrifüje diziler kuru dönerler.

3. Tarama ve Veri Analizleri

NOT: glikan mikroarrayler mikrodizin tarayıcının üreticisine bağlı olarak, farklı ayarlarla taranabilir. Lazer gücü ve çözünürlüğü değiştirilerek, enstrüman dinamik aralık (Şekil 1C) içinde mümkün olduğunca çok sayıda sinyallerle bir görüntü üretebilir.

  1. Bir floresan slayt tarayıcı kullanın ve hemen glikan bağlama proteinleri ile inkübasyondan sonra diziler tarayın. slayt doğru tarama cihazına yerleştirilir sağlamak için özen gösterin.
    1. Açık tarama yazılımı. programı açmak için Başlat düğmesini tıklatın. Tarayıcı navigasyon paneli menüsünde Tarayıcı → Bağlan ya da yeşil renkli: tarayıcıya bağlayın.
    2. Tarayıcının açık robotu kapı. belirli bir düzen içinde robotun yuvalara slaytlar yerleştirin. Kapat autoloader kapı. Clauto Araçlar navigasyon panelindeki Tran "okuma yükleyici" tarayıcı slaytlar algılar.
    3. Set tarama parametresi: deney (örneğin 635 lazer gücü yüksek, algılama kazanç% 50) uygun Tarayıcı → Tarama parametreleri. Tarama slaytlar: Tarayıcı → taraması. Tarama görüntüleri ve adı bireysel taramaları kaydetmek için bir klasör oluşturarak yolu seçin. Gerçek tarama için bu önceden yapın. her slayt için tekrarlayın. Taramayı başlatmak için Tamam'a tıklayın.
  2. slaytları enstrüman kurmak ve taramak için tarayıcı yazılımını kullanın. Set tarayıcı iteratif% 25,% 50 ve% 75 kazanç ayarlarını artan düşük lazer gücü (5 mW) tarama için.
    NOT: Ayarlar test ve optimize edilmiş, ancak her tarama muhtemelen photobleaching nedeniyle boyaların floresan çıkışını düşürebilirsiniz akılda tutmak olabilir.
    1. Açık veri toplama ve mapix yazılımı gibi analiz yazılımı. programı açmak için Başlat düğmesini tıklatın. Açık tarama görüntü: Açık im → Dosyayaş. Açık GAL dosyası: → açık ızgara analiz ve uygun GAL dosyayı seçin.
    2. bloklar moduna girin: Görüntü → bloklar moduna ızgara taşımak için. slaytta uygun konuma ızgara ayarlamak için ızgara işaretleri kullanabilirsiniz. basılı dizi maç için gerekli bireysel blok ayarlayın.
    3. noktalar moduna girin: Image noktalar modu → yerini ve blok içinde tek tek noktalar boyutunu ayarlamak için. Bir kez tüm bloklar ve lekeler ayarlanır ve yerinde, ölçü sinyal yoğunlukları ile → fotometrik hesaplamaları analiz edin. Çıktı dosyası olarak kaydedin.
  3. Slaytlar tarama bitirdikten sonra, görüntüler (- G Şekil 1D) yüklü görüntü işleme programı ile sinyallerin bağlanması için analiz edilir. görüntü analizi için, taranmış TIFF resmin üzerine bir GAL (Dizi Listesi) dosyası yükleyin.
    Not: GAL dosya nokta düzeni desen ve her nokta konumu kimliklerini hem de içerir. diziler için GAL dosyaları crNumunelerin kimliklerini ve 384-kaynak plaka kendi konumunu içeren bir sekme ile sınırlandırılmış metin dosyasını kullanarak yazıcı yazılımı tarafından eated.
  4. Düzgün GAL ızgara yerleştirmek için mikrodizinlerinde basılı ızgara işaretleyici / iniş ışıkları kullanın. Bireysel noktalar tek tek hareket gerekebilir, ama iyi basılmış dizi genellikle ızgara içinde bloklar kolaylıkla yerleştirilmesini sağlayacaktır. ızgara yerleştirilmesini takiben, yazılım tarafından nokta yoğunlukları toplamak ve bir sekme ile sınırlandırılmış metin dosyası (.txt) olarak kaydedilir.
    1. elektronik tablo programı kullanarak, tarayıcıdan çıktı dosyasını açın. klasör konumuna uygun makro dosyasını açın. Görünüm → Makro → MakroÇalıştır tıklayın.
      NOT: önceden yazılmış, ham çıktı verileri kopyalamak gereksiz satır ve sütunları kaldırmak, numune verileri sıralamak, ortalama sinyaldir eksi arka plan değerlerini hesaplamak ve her biri için grafikleri içeren bir yayılma sayfalık çalışma sayfasına bileşke değerler arsa olacaktır altı samples dizinin üzerinde test.

Sonuçlar

Baskı, Tarama ve Veri analizleri

Uygun baskı sağlamak için, slayt, her dizi delineates teflon maske içinde benekli ızgara, doğru hizalama için hayati önem taşımaktadır. nedeniyle teflon kaplama doğası gereği, yazdırma sırasında, lekeler MPX slaytlar üzerinde çıplak gözle görülemez. Dikkat poli-L-lizin kaplı slaytlar üzerinde ön lekelerin ortaya sonra ödenir. Doğrudan baskıdan sonra, her slayt nede...

Tartışmalar

IAV reseptör özgüllüğünü değerlendirmek kuş virüslerinin pandemik potansiyeli analizinde önemli bir adımdır. virüs, sialik asit tanıma bu hücreden bağlanarak ve salma gibi biyolojik özellikleri ile bağlantılıdır. kuş virüsleri bağlayıcı α2-6 ulaşmak ve türlerin bariyer pandemik hazırlık sağlayan geçmek için Bilgi amino asit mutasyonları gereklidir. Çeşitli deneyler reseptör özelliklerini belirlemek için kullanılır; Ancak, tüm tersi sadece ölçüm avidite ve özgünl?...

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose

Teşekkürler

Bu çalışma Scripps Mikroarray Core Tesisleri'nde, ve Centers for Disease Control (JCP) bir sözleşme ile kısmen desteklenmiştir. RPdV Hollanda Bilimsel Araştırma Örgütü (NWO) bir Rubicon ve VENI hibe bir alıcı. NIGMS hibe GM62116 (JCP) tarafından finanse Konsorsiyumu Fonksiyonel Glikomik için (http://www.functionalglycomics.org/) Bu çalışmada kullanılan çeşitli glikan sağladı. Bu Scripps Araştırma Enstitüsü'nden yayın 29.113 olduğunu.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
NEXTERION® Slide H MPX-48 Schott1091525Microwell slides
ProScanArray Plus PerkinElmerdiscontinuedconfocal microarray scanner
Innoscan 1100AL Scanner/Mapix SoftwareInnopsys-confocal microarray scanner
MicroGrid II Digilab-microaray printer
SNAVector LabsB-1305 Plant Lectin
ECAVector LabsB-1145 Plant Lectin
Anti-Strep AntibodyIBA2-1509-001 Anitbody for HA binding
Anti-Mouse Alexa-647LifeA-21235Anitbody for HA binding
Tween-20SigmaP2287 detergent
di-basic Sodium PhosphateSigma255793printing buffer component
mono-basic Sodium phosphateSigma229903 printing buffer component
poly-l-lysine solutionSigmaP8920 pre-spotting slide component
sodium hydroxideSigma221465pre-spotting slide component
ethanolSigma493546pre-spotting slide component
phosphate buffered salineCorning46-013-CMincubation/washing buffer
SMP4B pinsTelechemSMP4Bprinting pin
Compressed Nitrogen (Grade5)PraxairUN1066general dusting/drying tool
Boric AcidSigmaB6768-500GSlide blocking reagent
ethanolamineSigmaE9508-500MLSlide blocking reagent
Atto 488AttoTecAD 488-91Gridmarker on array
PAA-LNLNConsortium for Functional GlycomicsPA368Spotted glycans
PAA-3SLNLNConsortium for Functional GlycomicsPA362Spotted glycans
PAA-6SLNLNConsortium for Functional GlycomicsPA343Spotted glycans
LNLNConsortium for Functional GlycomicsTe98Spotted glycans
3SLNLNConsortium for Functional GlycomicsTe175Spotted glycans
6SLNLNConsortium for Functional GlycomicsTe176Spotted glycans
384-well microtiter plateMatrix TechCorp4361Printing plate
VWR lab markerVWR52877-150Slide Numbering
Wheaton slide staining dishSigmaZ103969-1EABlocking and Drying

Referanslar

  1. Tumpey, T. M., et al. A two-amino acid change in the hemagglutinin of the 1918 influenza virus abolishes transmission. Science. 315 (5812), 655-659 (2007).
  2. Xu, R., et al. Functional balance of the hemagglutinin and neuraminidase activities accompanies the emergence of the 2009 H1N1 influenza pandemic. J Virol. 86 (17), 9221-9232 (2012).
  3. Bouvier, N. M., Palese, P. The biology of influenza viruses. Vaccine. 26, D49-D53 (2008).
  4. Freidl, G. S., et al. Influenza at the animal-human interface: a review of the literature for virological evidence of human infection with swine or avian influenza viruses other than A(H5N1). Euro Surveill. 19 (18), (2014).
  5. Xu, R., et al. Preferential recognition of avian-like receptors in human influenza A H7N9 viruses. Science. 342 (6163), 1230-1235 (2013).
  6. Paulson, J. C., de Vries, R. P. H5N1 receptor specificity as a factor in pandemic risk. Virus Res. 178 (1), 99-113 (2013).
  7. Tzarum, N., et al. Structure and receptor binding of the hemagglutinin from a human H6N1 influenza virus. Cell Host Microbe. 17 (3), 369-376 (2015).
  8. Zhang, H., et al. A Human-Infecting H10N8 Influenza Virus Retains a Strong Preference for Avian-type Receptors. Cell Host Microbe. 17 (3), 377-384 (2015).
  9. Carroll, S. M., Higa, H. H., Paulson, J. C. Different cell-surface receptor determinants of antigenically similar influenza virus hemagglutinins. J Biol Chem. 256 (16), 8357-8363 (1981).
  10. Gambaryan, A. S., et al. Specification of receptor-binding phenotypes of influenza virus isolates from different hosts using synthetic sialylglycopolymers: non-egg-adapted human H1 and H3 influenza A and influenza B viruses share a common high binding affinity for 6'-sialyl(N-acetyllactosamine). Virology. 232 (2), 345-350 (1997).
  11. Rogers, G. N., D'Souza, B. L. Receptor binding properties of human and animal H1 influenza virus isolates. Virology. 173 (1), 317-322 (1989).
  12. Rogers, G. N., et al. Single amino acid substitutions in influenza haemagglutinin change receptor binding specificity. Nature. 304 (5921), 76-78 (1983).
  13. Paulson, J. C., Rogers, G. N. Resialylated erythrocytes for assessment of the specificity of sialyloligosaccharide binding proteins. Methods Enzymol. 138, 162-168 (1987).
  14. Paulson, J. C., Sadler, J. E., Hill, R. L. Restoration of specific myxovirus receptors to asialoerythrocytes by incorporation of sialic acid with pure sialyltransferases. J Biol Chem. 254 (6), 2120-2124 (1979).
  15. Chutinimitkul, S., et al. In vitro assessment of attachment pattern and replication efficiency of H5N1 influenza A viruses with altered receptor specificity. J Virol. 84 (13), 6825-6833 (2010).
  16. Glaser, L., et al. A single amino acid substitution in 1918 influenza virus hemagglutinin changes receptor binding specificity. J Virol. 79 (17), 11533-11536 (2005).
  17. Herfst, S., et al. Airborne transmission of influenza A/H5N1 virus between ferrets. Science. 336 (6088), 1534-1541 (2012).
  18. Nobusawa, E., Ishihara, H., Morishita, T., Sato, K., Nakajima, K. Change in receptor-binding specificity of recent human influenza A viruses (H3N2): a single amino acid change in hemagglutinin altered its recognition of sialyloligosaccharides. Virology. 278 (2), 587-596 (2000).
  19. Gambaryan, A. S., Matrosovich, M. N. A solid-phase enzyme-linked assay for influenza virus receptor-binding activity. J Virol Methods. 39 (1-2), 111-123 (1992).
  20. Totani, K., et al. Chemoenzymatic synthesis and application of glycopolymers containing multivalent sialyloligosaccharides with a poly(L-glutamic acid) backbone for inhibition of infection by influenza viruses. Glycobiology. 13 (5), 315-326 (2003).
  21. Gambaryan, A., et al. Receptor specificity of influenza viruses from birds and mammals: new data on involvement of the inner fragments of the carbohydrate chain. Virology. 334 (2), 276-283 (2005).
  22. Ito, T., et al. Receptor specificity of influenza A viruses correlates with the agglutination of erythrocytes from different animal species. Virology. 227 (2), 493-499 (1997).
  23. Watanabe, Y., et al. Acquisition of human-type receptor binding specificity by new H5N1 influenza virus sublineages during their emergence in birds in Egypt. PLoS Pathog. 7 (5), e1002068 (2011).
  24. Chandrasekaran, A., et al. Glycan topology determines human adaptation of avian H5N1 virus hemagglutinin. Nat Biotechnol. 26 (1), 107-113 (2008).
  25. Blixt, O., et al. Printed covalent glycan array for ligand profiling of diverse glycan binding proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (49), 17033-17038 (2004).
  26. Childs, R. A., et al. Receptor-binding specificity of pandemic influenza A (H1N1) 2009 virus determined by carbohydrate microarray. Nat Biotechnol. 27 (9), 797-799 (2009).
  27. Nycholat, C. M., et al. Recognition of Sialylated Poly-N-acetyllactosamine Chains on N- and O-Linked Glycans by Human and Avian Influenza A Virus Hemagglutinins. Angew Chem Int Ed Engl. , (2012).
  28. Rillahan, C. D., Paulson, J. C. Glycan microarrays for decoding the glycome. Annu Rev Biochem. 80, 797-823 (2011).
  29. Song, X., et al. A sialylated glycan microarray reveals novel interactions of modified sialic acids with proteins and viruses. J Biol Chem. 286 (36), 31610-31622 (2011).
  30. Gulati, S., et al. Human H3N2 Influenza Viruses Isolated from 1968 To 2012 Show Varying Preference for Receptor Substructures with No Apparent Consequences for Disease or Spread. PLoS One. 8 (6), (2013).
  31. Stevens, J., Blixt, O., Paulson, J. C., Wilson, I. A. Glycan microarray technologies: tools to survey host specificity of influenza viruses. Nat Rev Microbiol. 4 (11), 857-864 (2006).
  32. de Vries, R. P., et al. Evolution of the hemagglutinin protein of the new pandemic H1N1 influenza virus: maintaining optimal receptor binding by compensatory substitutions. J Virol. 87 (24), 13868-13877 (2013).
  33. Yang, H., et al. Structure and receptor binding preferences of recombinant human A(H3N2) virus hemagglutinins. Virology. 477, 18-31 (2015).
  34. de Vries, R. P., et al. The influenza A virus hemagglutinin glycosylation state affects receptor-binding specificity. Virology. 403 (1), 17-25 (2010).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

ImmunologySay 111Glikan dizisialik asitpoli akrilamid PAAgriphemaglutininlektingalaktozLacNAc

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır