Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.
Method Article
Using a printed glycan microarray strategy, a conventional 96-well plate assay was miniaturized for analysis of influenza A virus hemagglutinin avidity and specificity for sialic acid containing receptors.
Вирус гриппа А (ИФО) гемагглютинины признают сиаловых кислот на поверхности клетки, как функциональные рецепторы, чтобы получить вход в клетки. Дикие водоплавающие являются естественным резервуаром для IAV, но IAV может пересечь видовой барьер для птицы, свиней, лошадей и людей. Вирусы птичьего признают сиаловой кислоты, прикрепленную к предпоследней галактозы с помощью α2-3 связи (рецепторы птичьего типа), тогда как человеческие вирусы предпочтительно распознавать сиаловой кислоты с α2-6 подъёмник (рецепторы человеческого типа). Для того, чтобы контролировать, если вирус птичьего адаптируются к рецепторам типа человека, могут быть использованы несколько способов. Glycan микрочипы с различными библиотеками синтетических sialosides все чаще используются для оценки специфичности рецептора. Тем не менее, этот метод не используется для измерения avidities. Измерение авидности обычно достигается путем оценки связывания серийно разведенной гемагглютинина вируса или к гликанов, адсорбированных в обычных полипропиленовых 96-луночных планшетах. В этом анализе гликаны с альфа2-3 или α2-6 сиаловых кислот, в сочетании с биотином и адсорбируют на стрептавидин пластин, или соединены с полиакриламид (ПАА), которые непосредственно адсорбироваться на пластике. Мы значительно миниатюрным этот анализ непосредственно печатание ПАА-сшитый sialosides и их не ПАА-сшитый коллегами на микро-а стеклах. Этот комплект, с 48 массивов на одном слайде, позволяет одновременно анализы 6 Гликан связывающих белков в 8 разведений, опрашивая 6 различных гликанов, в том числе двух не сиалилированных контроля. Это эквивалентно 18x 96-луночные планшеты в традиционном анализе на планшетах. Гликан формат массива уменьшается потребление соединений и биологических препаратов и тем самым значительно повышает эффективность.
Дикие водоплавающие являются естественным резервуаром для IAV, но IAV способен пересечь видовой барьер для домашней птицы и млекопитающих, в том числе, человека. Птичий IAVS признают α2-3 связанных сиаловой кислоты (рецепторы птичьего типа), в то время как человеческие вирусы связывают α2-6 связанных сиаловой кислоты (рецепторы человеческого типа). Для того, чтобы иметь возможность эффективно копировать и передавать между людьми птичий IAV должно связываться с рецепторами человеческого типа 1.
IAVS разделены на основе серологических, характеризующей антигенность их гемагглютинина (HA) и нейраминидазы (NA) гликопротеинами оболочки. HA связывается с сиаловой кислоты, в то время как NA является фермент , разрушающий рецепторы на другом конце вирусного жизненного цикла и расщепляет сиаловой кислоты 2. Все люди , заражающие вирусы, включая H1N1, H2N2 и H3N2, имеют птичьего происхождения 3. На протяжении двух последних десятилетий несколько птиц с человеческими кроссоверов произошли, с вирусом H5N1, H7N7, H7N9 и является наиболее известным; Хаувер, другие подтипы инфицировано более спорадически (H6N1, H7N1, H7N2, H9N2, H10N7, H10N8) 4. К счастью, кажется , что ни один из этих вирусов не смогли полностью адаптироваться к человеческого типа α2-6-связанных рецепторов сиаловой кислоты 5-8. Адаптация птиц или других зоонозных вирусов для размещения репликации и передачи в человеческих хостов может оказать разрушительное воздействие на здоровье человека. Поэтому, прежде чем знание того, как эти вирусы эволюционируют связывать рецепторы человеческого типа поможет всемирное наблюдение за появления новых вирусов гриппа.
Определение предпочтений рецепторов впервые была выяснена с использованием эритроцитам различных видов и остается излюбленным среди исследователей анализ гриппа 9-12. Демонстрация того, что вирусы птичьего признают α2-3 сиаловой кислоты и человеческие вирусы α2-6 связанных сиаловой кислоты первоначально была основана на анализе с использованием гемагглютинации эритроцитов ферментативно сконструированных содержат каждый из Linkages 13,14. Хотя считывание гемагглютинации, стандартный тест для вирусологов, лежащие в основе гликановые структуры не определены, только концевую связь. Кроме того, ограниченная доступность из sialyltransferases, используемых для повторной sialylate клетки, ограничивают применение этого анализа 15-18. Впоследствии были введены другие методы определения предпочтений рецептора связывания с использованием сиалилированы гликанов структур , связанных с поли-акриламид (РАА) или поли-глутамата (ПГК) структур в анализах 19,20 плит на основе. Несколько вариантов возможны в покрытии либо гликанов или вирусы на микротитровальных пластин, каждая из которых приводит к получению устойчивой, надежной и очень чувствительного анализа ELISA , типа 21-23. В качестве альтернативы, биотин-связанные гликаны могут заменить PAA / АПГ и могут быть конъюгированы с покрытыми стрептавидином пластинами 2,24. Хотя некоторые специфические сыворотки могут потребоваться, ИФА являются стандартными и несколько гликанов связанных с РАА легко commerciallу и не коммерчески доступны (Консорциум по функциональной Glycomics (http://www.functionalglycomics.org)).
Glycan технологии микрочипов появились как неоценимый инструмент для определения специфичности рецептора, как и множество различных гликаны замечены, и связывание с широким спектром различных структур может быть оценена в пределах одного анализа 25-29. Связывание IAV к этим структурам обеспечивает лучшее понимание Гликан структур , которые IAV преимущественно распознает 30-33. Glycan микрочипы требуют небольших количеств объема образца для выполнения анализа связывания и использует только незначительное количество гликана на месте (2 NL). Тем не менее, эти массивы, как правило, используются только для оценки специфичности гликанам рецепторов. Анализ нескольких вирусов, или гемагглютинин белки, в нескольких диапазонах концентраций может быть непомерно высокой из-за количества требуемых слайдов. Кроме того, на сегодняшний день, никакого относительного анализа алчность не была разработана с использованием гликана арлучевые методы.
Чтобы объединить требование низкой пробы, обеспечиваемой гликанов методами микрочипов и чувствительности ПАА-связанных гликанов в анализах ELISA на основе, мы стремились разработать многоскважинных гликана массив, который позволил бы проводить анализ с высокой пропускной способностью с аналогичными или более высоким разрешением по сравнению к традиционному ИФА на основе анализа. Одновременно с этим мы хотели бы минимизировать количество биопрепаратов и репортер химических веществ, потребляемых. Конечным результатом является миниатюрной анализа алчность, специально разработанный для мониторинга Iav специфичности и в равной степени применимо для оценки других гликанов связывающих белков. Использование предметного стекла, разделенных на 48 микро-лунки с помощью маски тефлона, 6 различных гликаны замечены в 6 повторах на лунку. Платформа микрочипов дает те же самые тенденции в области связывания с рецептором видели в макроэкономическом формате ELISA с несколькими преимуществами. Они включают в себя (I) печать соединения в 6 повторах, с использованием минимального образца, по сравнению с покрытием из нескольких строк яна пластины, используя 100 мкл на лунку; (II), множество различных соединений анализировали одновременно в одной скважине, в том числе управления; (III) массивное уменьшение объема инкубации и; (IV) больший динамический диапазон с использованием флуоресцентного считывания. Один слайд может быть рассчитана как эквивалент 18x 96-луночные планшеты.
С помощью следующего протокола, любая лаборатория способна фабрикации и анализирующая пятнистый микрочипов должны быть в состоянии изготовить этот миниатюрный формат ELISA.
Примечание: Все стадии проводят при комнатной температуре, если не указано иное.
1. Построение массива
2. Анализ Glycan связывающие белки
3. Сканирование и анализ данных
Примечание: Гликан микрочипы могут быть отсканированы в различных условиях, в зависимости от производителя микрочипов сканера. Варьируя мощность и разрешение лазера, прибор может произвести изображение с таким количеством сигналов , как это возможно в пределах его динамического диапазона (рис 1C).
Печать, сканирование и анализ данных
Для обеспечения правильной печати, жизненно важно иметь правильное выравнивание пятнистой сетки внутри маски тефлоном, который очерчивает каждый массив на слайде. Во время печати из-за характера ?...
Оценка специфичности рецептора Iav является важным шагом в анализе потенциал пандемии птичьего вирусов. Признание сиаловой кислоты с помощью вируса связан с несколькими биологическими свойствами, такими, как связывания и высвобождения из клетки. Знание того, какие аминокислотные мута...
The authors have nothing to disclose
Эта работа была поддержана частично Scripps Microarray Основной фонд, и контракт от Центров по контролю и профилактике заболеваний (JCP). RPdV является получателем гранта Rubicon и Veni от Нидерландской организации научных исследований (NWO). Консорциум по функциональной Glycomics (http://www.functionalglycomics.org/) финансируется за счет гранта NIGMS GM62116 (JCP) представила несколько гликаны, используемых в данном исследовании. Это публикация 29113 из Скриппса научно-исследовательского института.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
NEXTERION® Slide H MPX-48 | Schott | 1091525 | Microwell slides |
ProScanArray Plus | PerkinElmer | discontinued | confocal microarray scanner |
Innoscan 1100AL Scanner/Mapix Software | Innopsys | - | confocal microarray scanner |
MicroGrid II | Digilab | - | microaray printer |
SNA | Vector Labs | B-1305 | Plant Lectin |
ECA | Vector Labs | B-1145 | Plant Lectin |
Anti-Strep Antibody | IBA | 2-1509-001 | Anitbody for HA binding |
Anti-Mouse Alexa-647 | Life | A-21235 | Anitbody for HA binding |
Tween-20 | Sigma | P2287 | detergent |
di-basic Sodium Phosphate | Sigma | 255793 | printing buffer component |
mono-basic Sodium phosphate | Sigma | 229903 | printing buffer component |
poly-l-lysine solution | Sigma | P8920 | pre-spotting slide component |
sodium hydroxide | Sigma | 221465 | pre-spotting slide component |
ethanol | Sigma | 493546 | pre-spotting slide component |
phosphate buffered saline | Corning | 46-013-CM | incubation/washing buffer |
SMP4B pins | Telechem | SMP4B | printing pin |
Compressed Nitrogen (Grade5) | Praxair | UN1066 | general dusting/drying tool |
Boric Acid | Sigma | B6768-500G | Slide blocking reagent |
ethanolamine | Sigma | E9508-500ML | Slide blocking reagent |
Atto 488 | AttoTec | AD 488-91 | Gridmarker on array |
PAA-LNLN | Consortium for Functional Glycomics | PA368 | Spotted glycans |
PAA-3SLNLN | Consortium for Functional Glycomics | PA362 | Spotted glycans |
PAA-6SLNLN | Consortium for Functional Glycomics | PA343 | Spotted glycans |
LNLN | Consortium for Functional Glycomics | Te98 | Spotted glycans |
3SLNLN | Consortium for Functional Glycomics | Te175 | Spotted glycans |
6SLNLN | Consortium for Functional Glycomics | Te176 | Spotted glycans |
384-well microtiter plate | Matrix TechCorp | 4361 | Printing plate |
VWR lab marker | VWR | 52877-150 | Slide Numbering |
Wheaton slide staining dish | Sigma | Z103969-1EA | Blocking and Drying |
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеThis article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены