JoVE Logo
Auteurs
Contactez-nous

S'identifier

Un abonnement à JoVE est nécessaire pour voir ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre essai gratuit.

Dans cet article

  • Résumé
  • Résumé
  • Introduction
  • Protocole
  • Résultats
  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Using a printed glycan microarray strategy, a conventional 96-well plate assay was miniaturized for analysis of influenza A virus hemagglutinin avidity and specificity for sialic acid containing receptors.

Résumé

Le virus grippal A (IAV) hémagglutinines reconnaissent les acides sialique sur la surface de la cellule en tant que récepteurs fonctionnels pour pénétrer dans les cellules. Les oiseaux aquatiques sauvages sont le réservoir naturel pour IAV, mais IAV peut traverser la barrière des espèces pour la volaille, les porcs, les chevaux et les humains. Les virus aviaires reconnaissent l'acide sialique attaché à un avant-dernier galactose par une liaison α2-3 (récepteurs de type aviaire), alors que les virus humains reconnaissent de préférence l'acide sialique avec une liaison α2-6 (récepteurs de type humain). Pour contrôler si les virus aviaires s'adaptent aux récepteurs de type humain, plusieurs méthodes peuvent être utilisées. microarrays Glycan avec diverses bibliothèques de sialosides synthétiques sont de plus en plus utilisés pour évaluer la spécificité du récepteur. Cependant, cette technique n'a pas été utilisée pour mesurer avidités. Mesure de l'avidité est généralement obtenue en évaluant la liaison de l'hémagglutinine ou un virus dilué en série à glycanes adsorbés polypropylène plaques à 96 puits classiques. Dans cet essai, avec α glycanes2-3 ou α2-6 acides sialiques sont couplés à la biotine et adsorbés sur des plaques de streptavidine ou sont couplées à polyacrylamide (PAA), qui adsorbe directement à la matière plastique. Nous avons considérablement miniaturisé cet essai en imprimant directement sialosides PAA liés et leurs homologues non PAA lié sur des lames de verre micro-puits. Ce set-up, avec 48 tableaux sur une seule diapositive, permet des dosages simultanés de 6 glycane protéines de liaison à 8 dilutions, interrogeant 6 glycanes différents, y compris deux témoins non sialylés. Ceci est équivalent à 18x plaques à 96 puits dans le dosage de plaque classique. Le format de tableau glycane diminue la consommation de composés et des produits biologiques et améliore l'efficacité ainsi grandement.

Introduction

Les oiseaux aquatiques sauvages sont le réservoir naturel pour IAV, mais IAV est capable de traverser la barrière des espèces pour la volaille et les mammifères, y compris les humains. IAV aviaire reconnaissent α2-3 acides sialiques liés (récepteurs de type aviaire), alors que les virus humains se lient α2-6 acides sialiques liés (récepteurs de type humain). Pour être en mesure de se répliquer efficacement et transmettre entre les humains un IAV aviaire a besoin de se lier à de type humain récepteurs 1.

IAVs sont divisés sur la base de tests sérologiques qui caractérise l'antigénicité de l'hémagglutinine (HA) et la neuraminidase (NA), les glycoprotéines d'enveloppe. HA se lie aux acides sialiques, tandis que NA est l'enzyme détruisant le récepteur à l'autre extrémité du cycle de vie viral et clive l' acide sialique 2. Tous les virus infectant l' homme, y compris la grippe H1N1, H2N2 et H3N2, ont une origine aviaire 3. Au cours des deux décennies plusieurs aviaire aux croisements humains dernière ont eu lieu, avec le virus H5N1, H7N7 et H7N9 étant le plus connu; however, d' autres sous - types ont infecté des humains de façon plus sporadique (H6N1, H7N1, H7N2, H9N2, H10N7, H10N8) 4. Heureusement, il semble qu'aucun de ces virus ont été en mesure d'adapter pleinement à l' acide sialique de type humain récepteurs α2-6 liés 5-8. Adaptation des virus zoonotiques aviaire ou d'autres pour accueillir la réplication et la transmission dans des hôtes humains pourraient avoir un effet dévastateur sur la santé humaine. Par conséquent, la connaissance préalable de la façon dont ces virus évoluent pour lier les récepteurs de type humain contribuera à la surveillance mondiale des virus émergents de la grippe.

Détermination de la préférence des récepteurs a été élucidée en utilisant érythrocytes d'espèces différentes et reste un essai privilégié entre les chercheurs de la grippe 9-12. La démonstration que les virus aviaires reconnaissent l'acide sialique α2-3 et virus humains α2-6 liés acide sialique a été basée sur un essai utilisant hémagglutination des érythrocytes enzymatiquement conçus pour contenir chacun des linkages 13,14. Bien que la lecture est hémagglutination, un essai standard pour virologues, les structures glycanniques sous-jacentes ne sont pas définies, seule la liaison terminal. En outre, la disponibilité limitée des sialyltransférases, utilisés pour re-sialyler les cellules, ont limité l'utilisation de ce test 15-18. Par la suite, d' autres méthodes permettant de déterminer les préférences de liaison au récepteur ont été introduites en utilisant des structures de glycanes sialylés liés à la poly-acrylamide (PAA) ou poly-glutamate (PGA) dans des analyses basées sur des structures en forme de plaque 19,20. Plusieurs variantes sont possibles dans le revêtement soit glycanes ou des virus dans des plaques de microtitrage, dont chacune résulte en un dosage de type ELISA robuste, fiable et très sensible 21-23. En variante, les glycanes liés à la biotine peuvent remplacer PAA / PGA et peuvent être conjugués à des plaques revêtues de streptavidine 2,24. Bien que certains sérums spécifiques peuvent être nécessaires, ELISA sont glycanes standard et plusieurs liés à l'AAP sont facilement commercially et non-disponibles dans le commerce (Consortium for Functional Glycomics (http://www.functionalglycomics.org)).

Technologies de microréseaux Glycan ont émergé comme un outil précieux pour déterminer la spécificité du récepteur, comme plusieurs glycanes différents sont repérés, et se lier à un large éventail de différentes structures peuvent être évaluées dans un seul essai 25-29. La liaison de l' IAV à ces structures fournit une meilleure compréhension des structures glycanniques que IAV reconnaît préférentiellement 30-33. microarrays Glycan nécessitent de petites quantités de volume d'échantillon pour effectuer une analyse de liaison et utilise uniquement des quantités infimes de glycane par point (2 nl). Cependant, ces réseaux sont généralement utilisés seulement pour évaluer la spécificité des glycanes récepteurs. L'analyse de plusieurs virus ou des protéines d'hémagglutinine, à différents intervalles de concentration peut être prohibitif en raison du nombre des lames nécessaires. En outre, à ce jour, aucun test relatif avidement a été développé en utilisant ar glycanedes techniques de rayons.

Pour combiner l'exigence de l'échantillon à faible offerte par les techniques de microréseaux glycanes et la sensibilité des glycanes de l'AAP liés dans des essais basés sur ELISA, nous avons cherché à développer une gamme glycanes multi-puits qui permettrait d'analyse à haut débit avec une résolution similaire ou mieux par rapport le dosage traditionnel à base d'ELISA. En même temps, nous voulions minimiser la quantité de produits biologiques et les produits chimiques rapporteurs consommés. Le résultat final est un test de avidement miniaturisé, spécialement développé pour la surveillance de la spécificité IAV et est également applicable pour évaluer d'autres protéines de liaison glycanes. L'utilisation d'une lame de verre séparé en 48 micro-puits par un masque de Teflon, 6 glycanes différents sont repérés en 6 répétitions par puits. La plate-forme de puces à ADN offrent les mêmes tendances dans la liaison au récepteur vu dans le format macro ELISA avec plusieurs avantages. Celles-ci comprennent (i) l'impression du composé en 6 réplicats, en utilisant un minimum de l'échantillon, par rapport au revêtement de plusieurs lignes iplaque na, en utilisant 100 pi par puits; (II) plusieurs composés différents analysés simultanément dans un seul puits, y compris les contrôles; (III) une diminution massive du volume d'incubation et; (IV) une plage dynamique plus large en utilisant un affichage fluorescent. Une seule diapositive peut être calculée comme équivalente à 18x plaques à 96 puits.

Avec le protocole suivant, tout laboratoire capable de fabriquer et d'analyse des microréseaux repérés devraient être capables de fabriquer ce format ELISA miniaturisé.

Protocole

Remarque: Toutes les étapes sont effectuées à température ambiante, sauf indication contraire.

1. Tableau de construction

  1. Glycan Préparation et installation de la plaque
    1. Préparer un stock de tampon d'impression. Faites d'abord 500 ml d'une solution 150 mM stock de phosphate de sodium dibasique. Assurez-vous également 50 ml d'une solution 150 mM stock de monobasique solution de phosphate de sodium. Dans un ballon, en utilisant une barre d'agitation magnétique et d'un pH-mètre, titrer lentement la solution dibasique de phosphate de sodium monobasique avec la solution jusqu'à ce qu'un pH de 8,5 soit atteint. Ajouter du Tween-20 à 0,005%.
    2. Préparer les échantillons glycanes. Diluer PAA glycanes conjugués, (diLacNAc (Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ-PAA), 3SLNLN (Neu5Acα2-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ-AAP) et 6SLNLN (Neu5Acα2-6Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ-PAA (figure 1A )) doivent être dilués à 100 ug / ml dans un tampon d'impression à partir step1.1.1. glycanes monovalents,diLacNAc (Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ- (CH 2) 3 NH 2, 3SLNLN (Neu5Acα2-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ - (CH 2) 3 NH 2) et 6SLNLN (Neu5Acα2-6Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1- 4GlcNAcβ - (CH 2) 3 NH 2)) à 100 pM dans du tampon d'impression à l' étape 1.1.1. Enfin, préparer les colorants à fonction amine, à utiliser comme marqueurs de la grille / feux d'atterrissage. Dye taches de marquage sont imprimés à 1 uM.
      NOTE: Atto488-NHS colorant est utilisé dans nos impressions. Cependant, tout colorant à fonction amine, pouvant être lu par le scanner de diapositives est approprié à cet effet.
    3. Transfert de 10 ul de chaque échantillon de glycane à des plaques de microtitrage à 384 puits, utilisé pour le robot d'impression. Magasin glycanes inutilisés dans une solution tampon d'impression à -20 ° C dans des tubes scellés. Tansfer 10 ul du marqueur de colorant sur la plaque d'impression.
  2. Impression
    NOTE: Toutes les steps qui concernent le toucher ou déplacer les diapositives doivent être effectuées avec des gants.
    1. Placez Arrayer épingles dans la tête d'impression en fonction de la configuration correcte de la mise en page. Pour cette mise en page en utilisant une broche pour imprimer tous les échantillons et les tableaux. Imprimer les glycanes en blocs de six, en sautant une caractéristique (une caractéristique est définie comme point unique d'un certain composé), de chaque côté, de telle sorte que les taches du même échantillon ne sont pas imprimés exactement à côté de l'autre.
      NOTE: L'utilisateur final doit décider de la configuration.
    2. Retirer les lames des sacs, des boîtes ouvertes, et éliminer toutes les particules de poussière ou de petits morceaux de plastique qui pourraient être sur leurs surfaces en soufflant de l'azote gazeux ultra-pur sur chaque diapositive. Placez le nombre désiré de diapositives, côté enduite vers le haut, sur la scène arrayer.
    3. Programmer le arrayer, utilisez les paramètres de 27 points par visite à la plaque source, en utilisant 3 "pré-taches" sur des lames revêtues de poly-L-lysine, pour éliminer l'excès de liquide à la pointe des aiguilles d'impression
      1. Allumez MPU (unité d'alimentation principale) et l'unité de contrôle du climat. Ouvrez le logiciel d'analyse Carreleurs sur ordinateur.
      2. Sélectionnez la mise en page à l'impression. Sélectionnez Options → Outil Pin à utiliser pour l'impression de la matrice 1 x 1 outil d'impression - 1 seule broche. Sélectionnez l'onglet Cible → Outil Tableau Définition → Motif d'impression et d'ajouter de la hauteur (spot à spot à distance), le nombre de lignes et de colonnes pour accueillir les échantillons à imprimer, et le motif d'impression des échantillons (pour ce tableau 8 x 8 impression motif est utilisé à 340 pas de um pour 7 échantillons au total).
      3. Sélectionnez Target → Mise en page des diapositives et programmer la distance de bloc à bloc pour permettre l'impression de chaque tableau répliquée dans le 48 puits (4 x 12) modèle de diapositive. Sélectionnez Source et ajoutez le nombre de micros source (1 pour chaque échantillon lors de l'utilisation 1 broches) (pour cette impression 7 micros source sera utilisée pour accueillir 6 puits d'échantillon et 1 marqueur de colorant ainsi).
        NOTE: Le dialogue source doit devenir vert pour montrer que le nombredes visites de source correspondent aux échantillons à imprimer dans le modèle d'impression.
      4. Sélectionnez Target → Adapter Plate et Glisser la mise en page et d'ajuster le nombre de diapositives (5 diapositives sont imprimées à la fois pour cette impression avec 1 pré-détachage slide).
      5. Relâchez le plateau en cliquant sur le bouton T1 pour activer le plateau et ajouter le nombre souhaité de diapositives sur le plateau, en accordant une attention particulière aux endroits de la glissière pré-spotting (BLEU) et les diapositives «réelles».
      6. Placez les lames de verre lisses sur tous les ports de vide restant à bloquer le vide et cliquez sur OK pour activer le vide. Vérifiez que toutes les diapositives sont maintenus en place et cliquez sur OK pour revenir le plateau à la position de la maison.
      7. Chargez la plaque d'impression dans le support de plaque et assurer le rack est correctement réglé en place. Cliquez sur GO et permettre le processus d'impression de procéder.
    4. Imprimer les 24 places restantes dans les répétitions de 6 points par matrice (4 tableaux / visite de la source).
    5. Charger les plaques à 384 puitsdans l'imprimante et lancer l'impression. Maintenir l'humidité relative, pendant l'impression, tout au long de l'impression entre 55 et 65%. L'imprimante arrête après l'impression 5 diapositives.
      NOTE: Bien que le microréseau dans cet essai a été imprimé en 8 x 8 modèle spécifique, différents robots d'impression de microréseau nécessiteront une programmation spécifique de l'équipement pour réaliser la mise en page souhaitée. Il appartient à l'utilisateur final afin de déterminer le modèle le plus approprié étant donné les caractéristiques de leurs équipements.
  3. Humidification / Immobilisation
    NOTE: Une fois que les diapositives ont terminé l'impression, ils subissent une étape d'immobilisation temporaire, appelée aussi humidifier. Humidification post-impression permet d'homogénéiser l'échantillon de fixation par re-mouillant les taches et en assurant un blocage complet.
    1. Placer les lames dans une chambre d'humidité à 100% immédiatement après l'impression pendant une période de 30 min. Construire la chambre en plaçant des serviettes en papier très humides plat dans le fond d'un grand plat en verre, en plaçant les diapositivessur une sorte de rack, comme un porte-tube à essai, imprimer vers le haut, et d'étanchéité avec une pellicule de plastique pour piéger l'humidité.
    2. Nombre glisse avec un alcool / solvant résistant à la plume de marquage et de stocker dans une boîte de dessiccation. Dessécher durant la nuit.
  4. Numérotation, blocage, et stockage
    1. Préparer le tampon de blocage - éthanolamine 50 mM dans 50 mM de tampon borate. Tout d' abord, dissoudre l' acide borique, en ddH 2 O, à une concentration finale de 50 mM dans un flacon contenant un barreau d'agitation magnétique. Remuer vigoureusement la solution sur une plaque d'agitation jusqu'à ce que tout solide soit dissous. Tout en remuant constamment, ajouter la quantité appropriée d'éthanolamine à partir d'une solution 16,54 M d'actions pour atteindre la concentration désirée 50 mM. Ajouter de l'hydroxyde de sodium concentré pour ajuster à un pH final de 9,2.
    2. Immerger les lames imprimées dans la solution de tampon de blocage pendant 1 h.
    3. Après 1 h, rincer les lames dans ddH 2 O pour éliminer toute trace de tampon de blocage en excès.Eliminer le tampon de blocage dans un conteneur à déchets approprié.
    4. Transférer les lames aux porteurs de coloration du verre et essorer. tableaux secs en les plaçant dans une centrifugeuse équipée de supports de plaques battantes, à une vitesse de 10 g pendant 5 min.
    5. Une fois les lames sont sèches, elles peuvent être incubées immédiatement ou stockées. Les conditions de stockage sont de -20 ° C dans un sac en plastique scellé.

2. Analyse des protéines de liaison Glycan

  1. Préparer une chambre humidifiée dans laquelle les tableaux à hybrider conviendra. Une chambre simple, se compose d'un plat en pyrex, en couches sur le fond avec des serviettes en papier humide et un support, sur lequel les diapositives reposeront.
  2. Utilisez lectines biotinylées SNA (Sambuca nigra agglutinine) et la CEA (Erythrina de agglutinine cristagalli) à 10 pg / ml + 2 pg / ml de streptavidine-555 colorant, dans un tampon de sondage (PBS + 0,01% de Tween-20). Pour HA (A / Vietnam / 1203-1204 H5N1 et A / KY / 07 H1N1, dans cet exemple), l'utilisationune concentration initiale de 20 ug / ml de pré-complexé, 34 comme décrit précédemment. En bref, faire un HA: Souris-α-Strep: mélange chèvre-α-Mouse-Alexa647 dans un tampon de blocage (PBS + BSA à 3% + 0,01% de Tween-20), à un rapport de 4: 1 molaire: 2.
    REMARQUE: La matrice est sondé avec des lectines de vérifier que les glycanes sont immobilisés et détectables (figure 1B).
  3. Transférer la solution de glycane de liaison de protéine-anticorps mélange de 20 pl sur une plaque à 384 puits et laisser incuber sur de la glace pendant 30 minutes. Dilué en série des échantillons lectine et HA 1: 1, dans leur tampon approprié, 8 fois, en mélangeant 10 ul d'échantillon avec 10 pi de tampon.
  4. Pipette 8 pi de l'échantillon sur la surface micro-puits et incuber dans la chambre d'humidification étanche (100% HR) pendant 90 min.
  5. Laver les lames une par une en tenant les bords et les plongeant quatre fois dans un mélange de PBS et de Tween à 0,05%, puis quatre fois dans du PBS, et finalement quatre fois dans H 2 O déminéralisée En utilisantle même protocole de séchage décrit à l'étape de blocage, les matrices de spin sec dans une centrifugeuse pendant 5 mn à 10 x g.

3. Numérisation et Analyses de données

NOTE: Les microarrays glycanes peuvent être numérisés à différents paramètres, selon le fabricant du scanner de puces à ADN. En faisant varier la puissance et la résolution laser, l'instrument peut produire une image avec autant de signaux que possible dans sa gamme dynamique (figure 1C).

  1. Utilisez un scanner de diapositives fluorescent et analyser les tableaux immédiatement après incubation avec les protéines de liaison glycanes. Prenez soin d'assurer la glissière est correctement insérée dans l'appareil de balayage.
    1. un logiciel de balayage ouvert. Cliquez sur Démarrer pour ouvrir le programme. Connectez-vous à scanner: Scanner → Connect ou le bouton vert dans le menu du panneau de navigation du scanner.
    2. porte ouverte autoloader du scanner. Placer les lames dans les fentes dans autochargeur ordre spécifique. Fermer la porte de l'autochargeur. Click "lire loader" dans le panneau Outils de navigation pour détecter automatiquement les diapositives dans le scanner.
    3. Paramètre scan Set: paramètres Scanner → numérisation appropriés à l'expérience (par exemple , 635 puissance laser élevée, le gain de détection de 50%). diapositives de numérisation: Scanner → numérisation. Sélectionnez le chemin en créant un dossier pour enregistrer les images numérisées et nom scans individuels. Pour ce faire, avant la numérisation réelle. Répéter pour chaque diapositive. Cliquez sur OK pour lancer la numérisation.
  2. Utilisez le logiciel du scanner pour mettre en place l'instrument et de numériser les diapositives. Réglez le scanner pour numériser itérativement à la puissance laser faible (5 mW) avec l'augmentation de réglages de gain de 25%, 50% et 75%.
    REMARQUE: Les paramètres peuvent être testés et optimisés, mais gardez à l'esprit que chaque balayage peut éventuellement réduire la sortie de fluorescence des colorants en raison de photoblanchiment.
    1. acquisition de données ouvertes et des logiciels d'analyse tels que les logiciels Mapix. Cliquez sur Démarrer pour ouvrir le programme. Ouvrir l'image scan: Fichier → im ouvertâge. fichier GAL Ouvrir: Analyser → grille ouverte et sélectionnez le fichier de liste d'adresses globale appropriée.
    2. Entrer en mode blocs: le mode image → blocs pour déplacer la grille. Utilisez les marqueurs de la grille pour définir la grille à l'emplacement approprié sur la diapositive. Ajuster les blocs individuels que nécessaire pour correspondre au tableau imprimé.
    3. Entrer en mode de spots: Image → Mode de spots pour régler l'emplacement et la taille des taches individuelles au sein du bloc. Une fois que tous les blocs et les taches sont ajustées et en place, mesure des intensités du signal Analyser par des calculs photométriques →. Enregistrez le fichier de sortie.
  3. Une fois que les diapositives ont terminé la numérisation, les images sont analysées pour les signaux de liaison avec le programme de traitement d' image installée (Figure 1D - G). Pour l'analyse d'image, charger un fichier GAL (Array List) sur l'image TIFF numérisée.
    REMARQUE: Le fichier GAL contient à la fois le modèle et les identités de chaque emplacement spot layout place. fichiers GAL pour les tableaux sont created par le logiciel de l'imprimante en utilisant un fichier texte délimité par des tabulations qui contient l'identité des échantillons et leur emplacement dans la plaque source 384 puits.
  4. Utilisez les lumières marqueur / d'atterrissage de la grille imprimée sur les microarrays pour placer correctement la grille de GAL. peuvent avoir besoin de points individuels à déplacer individuellement, mais un tableau bien imprimé généralement permettre à des blocs dans la grille à placer avec facilité. Après le placement de la grille, de recueillir des intensités spot par le logiciel et enregistré en tant que fichier texte délimité par des tabulations (.txt).
    1. Utilisation du programme tableur, ouvrez le fichier de sortie du scanner. Ouvrez le fichier macro approprié dans l'emplacement du dossier. Cliquez sur Afficher → Macro → RunMacro.
      NOTE: La pré-écrite copie les données brutes de sortie, supprimer des lignes et des colonnes inutiles, trier les données par exemple, calculer les valeurs moyennes de fond de signaux moins moyennes et tracer les valeurs résultantes pour une feuille de tableur contenant les graphiques pour chaque des six samples tester sur le tableau.

Résultats

Impression, numérisation et analyses de données

Pour imprimer correctement, il est essentiel d'avoir un alignement correct de la grille repérée dans le masque de téflon, qui délimite chaque tableau sur la diapositive. Pendant l'impression, en raison de la nature du revêtement de téflon, les taches ne sont pas visibles à l'oeil nu sur les glissières MPX. L'attention est portée ensuite à l'apparit...

Discussion

Évaluer IAV la spécificité du récepteur est une étape importante dans l'analyse de potentiel pandémique de virus aviaires. la reconnaissance de l'acide sialique par le virus est lié à plusieurs propriétés biologiques telles que la liaison et la libération à partir de la cellule. La connaissance des mutations qui en acides aminés sont nécessaires pour les virus aviaires pour atteindre α2-6 de liaison et traversent la barrière des espèces permet la préparation aux pandémies. Plusieurs essais son...

Déclarations de divulgation

The authors have nothing to disclose

Remerciements

Ce travail a été soutenu en partie par le Fonds Scripps Microarray Core et un contrat par les Centers for Disease Control (PCE). RPDV est un bénéficiaire d'une subvention Rubicon et VENI de l'Organisation néerlandaise pour la recherche scientifique (NWO). Le Consortium pour Glycomics fonctionnels (http://www.functionalglycomics.org/) financé par NIGMS subvention GM62116 (JCP) a fourni plusieurs glycanes utilisés dans cette étude. Ceci est la publication 29113 de The Scripps Research Institute.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
NEXTERION® Slide H MPX-48 Schott1091525Microwell slides
ProScanArray Plus PerkinElmerdiscontinuedconfocal microarray scanner
Innoscan 1100AL Scanner/Mapix SoftwareInnopsys-confocal microarray scanner
MicroGrid II Digilab-microaray printer
SNAVector LabsB-1305 Plant Lectin
ECAVector LabsB-1145 Plant Lectin
Anti-Strep AntibodyIBA2-1509-001 Anitbody for HA binding
Anti-Mouse Alexa-647LifeA-21235Anitbody for HA binding
Tween-20SigmaP2287 detergent
di-basic Sodium PhosphateSigma255793printing buffer component
mono-basic Sodium phosphateSigma229903 printing buffer component
poly-l-lysine solutionSigmaP8920 pre-spotting slide component
sodium hydroxideSigma221465pre-spotting slide component
ethanolSigma493546pre-spotting slide component
phosphate buffered salineCorning46-013-CMincubation/washing buffer
SMP4B pinsTelechemSMP4Bprinting pin
Compressed Nitrogen (Grade5)PraxairUN1066general dusting/drying tool
Boric AcidSigmaB6768-500GSlide blocking reagent
ethanolamineSigmaE9508-500MLSlide blocking reagent
Atto 488AttoTecAD 488-91Gridmarker on array
PAA-LNLNConsortium for Functional GlycomicsPA368Spotted glycans
PAA-3SLNLNConsortium for Functional GlycomicsPA362Spotted glycans
PAA-6SLNLNConsortium for Functional GlycomicsPA343Spotted glycans
LNLNConsortium for Functional GlycomicsTe98Spotted glycans
3SLNLNConsortium for Functional GlycomicsTe175Spotted glycans
6SLNLNConsortium for Functional GlycomicsTe176Spotted glycans
384-well microtiter plateMatrix TechCorp4361Printing plate
VWR lab markerVWR52877-150Slide Numbering
Wheaton slide staining dishSigmaZ103969-1EABlocking and Drying

Références

  1. Tumpey, T. M., et al. A two-amino acid change in the hemagglutinin of the 1918 influenza virus abolishes transmission. Science. 315 (5812), 655-659 (2007).
  2. Xu, R., et al. Functional balance of the hemagglutinin and neuraminidase activities accompanies the emergence of the 2009 H1N1 influenza pandemic. J Virol. 86 (17), 9221-9232 (2012).
  3. Bouvier, N. M., Palese, P. The biology of influenza viruses. Vaccine. 26, D49-D53 (2008).
  4. Freidl, G. S., et al. Influenza at the animal-human interface: a review of the literature for virological evidence of human infection with swine or avian influenza viruses other than A(H5N1). Euro Surveill. 19 (18), (2014).
  5. Xu, R., et al. Preferential recognition of avian-like receptors in human influenza A H7N9 viruses. Science. 342 (6163), 1230-1235 (2013).
  6. Paulson, J. C., de Vries, R. P. H5N1 receptor specificity as a factor in pandemic risk. Virus Res. 178 (1), 99-113 (2013).
  7. Tzarum, N., et al. Structure and receptor binding of the hemagglutinin from a human H6N1 influenza virus. Cell Host Microbe. 17 (3), 369-376 (2015).
  8. Zhang, H., et al. A Human-Infecting H10N8 Influenza Virus Retains a Strong Preference for Avian-type Receptors. Cell Host Microbe. 17 (3), 377-384 (2015).
  9. Carroll, S. M., Higa, H. H., Paulson, J. C. Different cell-surface receptor determinants of antigenically similar influenza virus hemagglutinins. J Biol Chem. 256 (16), 8357-8363 (1981).
  10. Gambaryan, A. S., et al. Specification of receptor-binding phenotypes of influenza virus isolates from different hosts using synthetic sialylglycopolymers: non-egg-adapted human H1 and H3 influenza A and influenza B viruses share a common high binding affinity for 6'-sialyl(N-acetyllactosamine). Virology. 232 (2), 345-350 (1997).
  11. Rogers, G. N., D'Souza, B. L. Receptor binding properties of human and animal H1 influenza virus isolates. Virology. 173 (1), 317-322 (1989).
  12. Rogers, G. N., et al. Single amino acid substitutions in influenza haemagglutinin change receptor binding specificity. Nature. 304 (5921), 76-78 (1983).
  13. Paulson, J. C., Rogers, G. N. Resialylated erythrocytes for assessment of the specificity of sialyloligosaccharide binding proteins. Methods Enzymol. 138, 162-168 (1987).
  14. Paulson, J. C., Sadler, J. E., Hill, R. L. Restoration of specific myxovirus receptors to asialoerythrocytes by incorporation of sialic acid with pure sialyltransferases. J Biol Chem. 254 (6), 2120-2124 (1979).
  15. Chutinimitkul, S., et al. In vitro assessment of attachment pattern and replication efficiency of H5N1 influenza A viruses with altered receptor specificity. J Virol. 84 (13), 6825-6833 (2010).
  16. Glaser, L., et al. A single amino acid substitution in 1918 influenza virus hemagglutinin changes receptor binding specificity. J Virol. 79 (17), 11533-11536 (2005).
  17. Herfst, S., et al. Airborne transmission of influenza A/H5N1 virus between ferrets. Science. 336 (6088), 1534-1541 (2012).
  18. Nobusawa, E., Ishihara, H., Morishita, T., Sato, K., Nakajima, K. Change in receptor-binding specificity of recent human influenza A viruses (H3N2): a single amino acid change in hemagglutinin altered its recognition of sialyloligosaccharides. Virology. 278 (2), 587-596 (2000).
  19. Gambaryan, A. S., Matrosovich, M. N. A solid-phase enzyme-linked assay for influenza virus receptor-binding activity. J Virol Methods. 39 (1-2), 111-123 (1992).
  20. Totani, K., et al. Chemoenzymatic synthesis and application of glycopolymers containing multivalent sialyloligosaccharides with a poly(L-glutamic acid) backbone for inhibition of infection by influenza viruses. Glycobiology. 13 (5), 315-326 (2003).
  21. Gambaryan, A., et al. Receptor specificity of influenza viruses from birds and mammals: new data on involvement of the inner fragments of the carbohydrate chain. Virology. 334 (2), 276-283 (2005).
  22. Ito, T., et al. Receptor specificity of influenza A viruses correlates with the agglutination of erythrocytes from different animal species. Virology. 227 (2), 493-499 (1997).
  23. Watanabe, Y., et al. Acquisition of human-type receptor binding specificity by new H5N1 influenza virus sublineages during their emergence in birds in Egypt. PLoS Pathog. 7 (5), e1002068 (2011).
  24. Chandrasekaran, A., et al. Glycan topology determines human adaptation of avian H5N1 virus hemagglutinin. Nat Biotechnol. 26 (1), 107-113 (2008).
  25. Blixt, O., et al. Printed covalent glycan array for ligand profiling of diverse glycan binding proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (49), 17033-17038 (2004).
  26. Childs, R. A., et al. Receptor-binding specificity of pandemic influenza A (H1N1) 2009 virus determined by carbohydrate microarray. Nat Biotechnol. 27 (9), 797-799 (2009).
  27. Nycholat, C. M., et al. Recognition of Sialylated Poly-N-acetyllactosamine Chains on N- and O-Linked Glycans by Human and Avian Influenza A Virus Hemagglutinins. Angew Chem Int Ed Engl. , (2012).
  28. Rillahan, C. D., Paulson, J. C. Glycan microarrays for decoding the glycome. Annu Rev Biochem. 80, 797-823 (2011).
  29. Song, X., et al. A sialylated glycan microarray reveals novel interactions of modified sialic acids with proteins and viruses. J Biol Chem. 286 (36), 31610-31622 (2011).
  30. Gulati, S., et al. Human H3N2 Influenza Viruses Isolated from 1968 To 2012 Show Varying Preference for Receptor Substructures with No Apparent Consequences for Disease or Spread. PLoS One. 8 (6), (2013).
  31. Stevens, J., Blixt, O., Paulson, J. C., Wilson, I. A. Glycan microarray technologies: tools to survey host specificity of influenza viruses. Nat Rev Microbiol. 4 (11), 857-864 (2006).
  32. de Vries, R. P., et al. Evolution of the hemagglutinin protein of the new pandemic H1N1 influenza virus: maintaining optimal receptor binding by compensatory substitutions. J Virol. 87 (24), 13868-13877 (2013).
  33. Yang, H., et al. Structure and receptor binding preferences of recombinant human A(H3N2) virus hemagglutinins. Virology. 477, 18-31 (2015).
  34. de Vries, R. P., et al. The influenza A virus hemagglutinin glycosylation state affects receptor-binding specificity. Virology. 403 (1), 17-25 (2010).

Réimpressions et Autorisations

Demande d’autorisation pour utiliser le texte ou les figures de cet article JoVE

Demande d’autorisation

Explorer plus d’articles

Immunologienum ro 111Glycan arrayl acide sialiquele poly acrylamide PAAla grippel h magglutininelectinegalactoseLacNAc

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Confidentialité

Conditions d'utilisation

Politiques

Contactez-nous

RECOMMANDER À LA BIBLIOTHÈQUE

NEWSLETTERS JoVE

Recherche

Enseignement

Auteurs

Bibliothécaires

À PROPOS DE JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Tous droits réservés.