小説<em&gt;例OVO</emニワトリ胚のシステムで心臓内血行動態を変えるために&gt;バンディングテクニック

要約

For the first time we present here a reproducible banding procedure to alter hemodynamics in the developing heart ex ovo. This is achieved by partially constricting the outflow tract (OFT).

要約

The new model presented here can be used to understand the influence of hemodynamics on specific cardiac developmental processes, at the cellular and molecular level. To alter intracardiac hemodynamics, fertilized chicken eggs are incubated in a humidified chamber to obtain embryos of the desired stage (HH17). Once this developmental stage is achieved, the embryo is maintained ex ovo and hemodynamics in the embryonic heart are altered by partially constricting the outflow tract (OFT) with a surgical suture at the junction of the OFT and ventricle (OVJ). Control embryos are also cultured ex ovo but are not subjected to the surgical intervention. Banded and control embryos are then incubated in a humidified incubator for the desired period of time, after which 2D ultrasound is employed to analyze the change in blood flow velocity at the OVJ as a result of OFT banding. Once embryos are maintained ex ovo, it is important to ensure adequate hydration in the incubation chamber so as to prevent drying and eventually embryo death. Using this new banded model, it is now possible to perform analyses of changes in the expression of key players involved in valve development and to understand the role of hemodynamics on cellular responses in vivo, which could not be achieved previously.

概要

Abnormally formed outflow valves are the most common type of congenital heart defects ¹. However, defective cardiac valve structure and function, even though present at birth, may become symptomatic only in adulthood. In fact, several adult valve diseases can be attributed to a congenital origin. Treatment of such patients often involves replacing defective valves, and, importantly, replaced aortic valves have been shown to have congenital anomalies ². Given the fact that critical processes involved in valve development begin early during embryogenesis, the importance of better understanding the mechanisms that regulate these events is highlighted.

The primitive heart tube, which is the first functioning organ in an embryo, exhibits two distinct layers - an endothelial endocardium surrounded by myocardium - separated by extracellular matrix (cardiac jelly) which is mostly produced and secreted by the myocardium ^3-5. As development continues, valve primordia (endocardial cushions) are formed, after rightward looping of the embryonic heart, by local expansion of the cardiac jelly at the atrioventricular (AV) canal and the outflow tract (OFT) ^4,6. This expansion is mediated by the highly regulated process of epithelial-mesenchymal transition (EMT), during which the cardiac jelly becomes populated by endocardially-derived mesenchymal cells ⁶. In addition to the mesenchymal population derived through EMT, neural crest cells are also involved in valvulogenesis of the OFT ³.

Hemodynamic stimuli, such as shear stress, are important epigenetic factors that regulate heart development in the embryo ^7,8. Using a 3D in vitro system, we have previously shown shear stress to be a factor influencing the expression and deposition of fibrous extracellular matrix (ECM) proteins in AV and OFT cushions ^9,10. Moreover, studies carried out by several researchers have demonstrated that altered blood flow leads to improper valves and septa formation ^11-16. Recently, using the novel banding procedure presented here, we have shown that changing hemodynamics in the embryonic chick heart affects the early processes involved in OFT valve formation ¹⁷.

The technique described here provides a novel model for altering hemodynamics in the developing chick heart by partially constricting the OFT ex ovo. This reproducible procedure is relatively quick and allows researchers to obtain a sufficient number of embryos/whole hearts/OFT tissue, etc. for downstream analyses including gene expression studies. Moreover, this new model can be used to study 'chronic' effects of altered hemodynamics on OFT valve development.

プロトコル

鳥類胚はIUCACの規制の下で脊椎動物とは見なされません。

1.手術のための胚を取得

1. 80インキュベート - ハミルトンとハンバーガー（HH）の段階で胚を得るために、約72時間、40℃で加湿（60％）、ロッカーインキュベーター内で90受精Bovan鶏卵（平滑末端まで）は17に基づいて、卵の正確な数を決定します胚¹⁷の電力解析と生存率。適切な空気の循環を可能にするために、インキュベーションのためプラスチック製の卵トレイを使用してください。
2. この所望の発達段階が達成されたらを100mM×26ミリメートルのペトリ皿に約20ミリリットル（重炭酸ナトリウム（1 G / L）を補充した）暖かい（37℃）タイロード緩衝液を注ぎます。
3. 70％エタノールで卵の殻を滅菌します。
4. 静かにメスハンドルにシェルをクラックし、慎重にタイロード緩衝液を含有する皿にその内容物を放出します。彼らは視覚的に（ii）の異常が現れた（ⅰ）場合、彼らは、胚を破棄します（iii）は、それらが不適切に卵黄上に配向され、および/または（iv）のいずれかの出血が発生した右発達段階ではありません。すぐに開発を損なわないように、40℃でのOVOの元に置かれた後、手術を受けていない任意の胚を保持します。
   注：ステージングがハミルトンとハンブルガー¹⁸に基づいて行われます。ニワトリ胚の異常は、肉眼でと解剖スコープの下で決定されます。胚が適切な折り畳みおよび曲げや血管系を持っていることを確認してください。

2. OFTバンディング

1. 単一11/0ナイロン縫合糸から個々の長さ1cmのスレッドをピンセットで抜くと緩い結び目を形成します。 UVは、すべての予備成形されたノットを殺菌します。
2. 解剖顕微鏡下では、視覚的に心臓が通常の速度（〜120拍/分）で暴行されていることを確認してください。ない場合は、胚を廃棄します。
3. トランスファーピペットを用いて、胚の表面に暖かい（37℃）タイロード緩衝液の6ミリリットル - ちょうど手術の前に、5を適用します。
4. OFTの下に予め形成した結び目の1自由端を渡し、OFT /心室接合（OVJ）（または、所望の位置）で縫合糸を配置し、それによってOFT心臓を取り囲む膜を含む収縮結び目に自由端を渡します。
5. トランスファーピペットを用いて温かい6mlの（37℃）タイロードバッファー - 手術後、5を卵黄の表面を濡らします。
6. 縞模様の胚として元のOVO管理胚を維持します。しかし、外科的処置にそれらを与えないでください。
7. 加湿（60％）インキュベーター中で40℃で、所望の時間のために、胚をインキュベートします。
8. 所望の時点に達すると、直線状のはさみを使用して卵黄から胚を切り出します。細かい鉗子で心臓を解剖し、そのような変更された血行動態¹⁷に起因する心臓の形態の変化など、いくつかの下流の研究のために使用します。

3.バンディングの介入は、血行動態の変化を引き起こすことを確認

注：バンディングの介入によって引き起こされる部分的なくびれはOVJでの血流速度の増加につながります。この血行動態パラメータは、都合よく、実験の所望の時点で行われる2次元超音波画像を用いて評価されます。

1. 単一の胚を一度に撮像することができるので、40℃のインキュベーター中で超音波イメージングのために指定された他のすべての胚を維持します。
2. 40℃に設定した加熱パッド上に結像される胚を含むペトリ皿を置きます。
3. 暖かい（37℃）タイロード緩衝液で、つばまで、皿を埋めます。インタクトな卵黄を保持するようにゆっくりと皿に緩衝液を注ぎます。しかし、卵黄の完全性は、このステップの間に侵害された場合、胚を廃棄します。
4. オリエント胚の中心軸は、調節可能なスタンドから吊り下げられている超音波プローブに直交するように、胚。
5. 超音波装置のオペラとティンは、Bモードでは、画面上の鼓動する心臓の2D画像を取得し、OFT、心室とOVJが明瞭に見えるようなステージ（加熱パッド）を移動します。
6. 所望のパルス繰り返し周波数（ 例えば 、20kHzの）で、パルス波（PW）モードに切り替えて、正確にOVJで速度データを取得します。拍動する心臓のBモード画像は、スクリーン上で得られます。
   1. OFT、心室とOVJを見るためにステージを移動します。超音波装置のソフトウェアを使用して、正確にOVJにおける速度測定値を得ます。

注：胚の心拍数は、撮像中に減少した場合、このようにして得られた速度データは、分析のために使用すべきではありません。速度測定のために使用されるすべての胚は、好ましくは、超音波イメージングの後に、他の実験に使用することはできません。

結果

図1に示すOFTバンディングのために必要な推奨機器です。蓋をし ​​た胚を破壊しないように、卵は十分な深さであるべき胚の元を含むペトリ皿（ 図1A）。深いペトリ皿（ 図1C）は、タイロード緩衝液の適切な量は、卵黄の上に注ぐことができるようにするために超音波イメージングのために使用されるべきです。 ...

ディスカッション

この技術は、比較的迅速かつ実行するのは簡単です、しかし、特定のキーポイントは、正確な下流の結果を得るよう際に留意する必要があります。胚は、適切な再水和を提供するために、タイロードバッファが含まれているペトリ皿の中のOVOの元を維持すべきです。タイロード緩衝液と卵黄、手術後を水和するために、インキュベーション室が十分に水和されていることを確認するこ?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fertilized Bovan chicken eggs	Clemson University, Clemson, SC
11 / 0 Nylon suture	Ashaway	S30001	UV sterilize knots before surgery
100 x 26 mm petri dish	VWR	25387-030
Transfer pipettes	Thermo Scientific	232-20S
Scalpel handle #3	Fine Science Tools	91003-12
Straight scissor	Roboz	RS-6702
Dumont #5 fine forceps	Fine Science Tools	11254-20
Tyrodes buffer	Sigma-Aldrich	2145-10L	Filter sterlize before use
Sodium bicarbonate	Fisher Scientific	S233-500
Vevo 770 Ultrasound Imaging system	VisualSonics, Inc.	VS-11392
708 Ultrasound transducer	VisualSonics, Inc.	VS-11171