소설<em&gt; 예 비켜</em&gt; 밴딩 기법 닭 배아 시스템에서 심장 내 혈류를 변경할

요약

For the first time we present here a reproducible banding procedure to alter hemodynamics in the developing heart ex ovo. This is achieved by partially constricting the outflow tract (OFT).

초록

The new model presented here can be used to understand the influence of hemodynamics on specific cardiac developmental processes, at the cellular and molecular level. To alter intracardiac hemodynamics, fertilized chicken eggs are incubated in a humidified chamber to obtain embryos of the desired stage (HH17). Once this developmental stage is achieved, the embryo is maintained ex ovo and hemodynamics in the embryonic heart are altered by partially constricting the outflow tract (OFT) with a surgical suture at the junction of the OFT and ventricle (OVJ). Control embryos are also cultured ex ovo but are not subjected to the surgical intervention. Banded and control embryos are then incubated in a humidified incubator for the desired period of time, after which 2D ultrasound is employed to analyze the change in blood flow velocity at the OVJ as a result of OFT banding. Once embryos are maintained ex ovo, it is important to ensure adequate hydration in the incubation chamber so as to prevent drying and eventually embryo death. Using this new banded model, it is now possible to perform analyses of changes in the expression of key players involved in valve development and to understand the role of hemodynamics on cellular responses in vivo, which could not be achieved previously.

서문

Abnormally formed outflow valves are the most common type of congenital heart defects ¹. However, defective cardiac valve structure and function, even though present at birth, may become symptomatic only in adulthood. In fact, several adult valve diseases can be attributed to a congenital origin. Treatment of such patients often involves replacing defective valves, and, importantly, replaced aortic valves have been shown to have congenital anomalies ². Given the fact that critical processes involved in valve development begin early during embryogenesis, the importance of better understanding the mechanisms that regulate these events is highlighted.

The primitive heart tube, which is the first functioning organ in an embryo, exhibits two distinct layers - an endothelial endocardium surrounded by myocardium - separated by extracellular matrix (cardiac jelly) which is mostly produced and secreted by the myocardium ^3-5. As development continues, valve primordia (endocardial cushions) are formed, after rightward looping of the embryonic heart, by local expansion of the cardiac jelly at the atrioventricular (AV) canal and the outflow tract (OFT) ^4,6. This expansion is mediated by the highly regulated process of epithelial-mesenchymal transition (EMT), during which the cardiac jelly becomes populated by endocardially-derived mesenchymal cells ⁶. In addition to the mesenchymal population derived through EMT, neural crest cells are also involved in valvulogenesis of the OFT ³.

Hemodynamic stimuli, such as shear stress, are important epigenetic factors that regulate heart development in the embryo ^7,8. Using a 3D in vitro system, we have previously shown shear stress to be a factor influencing the expression and deposition of fibrous extracellular matrix (ECM) proteins in AV and OFT cushions ^9,10. Moreover, studies carried out by several researchers have demonstrated that altered blood flow leads to improper valves and septa formation ^11-16. Recently, using the novel banding procedure presented here, we have shown that changing hemodynamics in the embryonic chick heart affects the early processes involved in OFT valve formation ¹⁷.

The technique described here provides a novel model for altering hemodynamics in the developing chick heart by partially constricting the OFT ex ovo. This reproducible procedure is relatively quick and allows researchers to obtain a sufficient number of embryos/whole hearts/OFT tissue, etc. for downstream analyses including gene expression studies. Moreover, this new model can be used to study 'chronic' effects of altered hemodynamics on OFT valve development.

프로토콜

조류 배아는 IUCAC의 규정에 따라 척추 동물로 간주되지 않습니다.

1. 수술에 대한 배아를 얻기

1. 80 품어 - 해밀턴과 햄버거 (HH) 단계에서 배아를 얻기 위해 약 72 시간 동안 40 ° C에서 가습 (60 %) 로커 배양기에서 90 수정 된 Bovan 닭고기 달걀 (무딘 끝을 위로하는) (17)에 기반 계란의 정확한 수를 결정 전력 분석 및 배아 ^(17)의 생존율. 적절한 공기 순환을 허용하도록 배양 플라스틱 계란 트레이를 사용합니다.
2. 이 원하는 발달 단계가 달성되면, 100mm X 26mm 페트리 접시에 약 20 ㎖ (중탄산 나트륨 (1g / L)로 보충) 따뜻한 (37 ° C) 타이로드의 버퍼를 붓는다.
3. 70 % 에탄올로 달걀 껍질을 소독.
4. 조심스럽게 메스 손잡이와 쉘 균열 조심스럽게 타이로드의 버퍼를 포함하는 접시에 그 내용을 공개. 그들은 시각적으로 표시하는 경우 배아 (i)를 폐기 이상 (ⅱ) 그들은오른쪽 발달 단계에서 (ⅲ) 그들은 잘못 노른자 및 / 또는 (ⅳ) 출혈 발생의 방향되지 않습니다. 즉시 개발을 손상하지 않도록 40 ​​° C에서 비켜 전 배치 후 수술을 실시되지 않은 배아를 유지합니다.
   주 : 준비는 해밀턴과 햄버거 ^(18)에 따라 수행된다. 병아리 태아의 이상은 육안에 의해 절개 범위에 따라 결정된다. 배아는 적절한 폴딩 및 벤딩과 혈관이 있는지 확인합니다.

2. OFT 밴딩

1. 하나의 11/0 나일론 수술 봉합사에서 개별 1cm 긴 스레드를 Tweeze과 느슨한 매듭을 형성​​한다. 모든 예비 성형 노트를 살균 UV.
2. 해부 현미경, 시각적으로 심장이 정상 속도 (~ 120 비트 / 분)에 치고되어 있는지 확인합니다. 그렇지 않은 경우, 배아를 버린다.
3. 전송 피펫을 사용하여 배아 표면에 따뜻한 (37 ° C) 타이로드의 버퍼 6 ml의 - 그냥 수술 전, 5를 적용합니다.
4. , 공정 거래 청에서 예비 성형 매듭의 한 끝을 통과 OFT / 심실 접합 (OVJ) (또는 원하는 위치)에서 봉합사를 놓고하여 심장을 둘러싸고있는 세포막을 포함하여 OFT을 죄기 매듭으로 끝을 전달합니다.
5. 따뜻한 6 ㎖ (37 ° C) 타이로드의 버퍼가 전송 피펫을 사용하여 - 수술 후 5 노른자의 표면을 젖은.
6. 제어 태아에게 줄무늬 배아 등 전 비켜을 유지; 그러나 수술에 대상이되지 않습니다.
7. 습윤 (60 %) 인큐베이터에서 40 ℃에서 시간의 소정 시간 동안, 배아를 인큐베이션.
8. 원하는 시점에 도달하면, 직선 위를 이용 난황에서 배아를 절제. 미세 집게로 심장을 해부 등으로 인해 변경된 혈역학 ¹⁷ 심장 형태의 변화로 여러 하류 연구에 사용합니다.

3. 밴딩 개입이 혈류의 변화를 원인 것을 확인

주 : 밴딩 개입에 의한 부분적인 수축이 OVJ에서 혈류 속도의 증가를 이끈다. 이는 혈역학 파라미터 편리 실험의 목적하는 시점에서 수행되는 2 차원 초음파 영상을 이용하여 평가된다.

1. 단일 배아 한번에 이미징 될 수 있기 때문에, 40 ° C의 배양기에서 초음파 영상에 대해 지정된 다른 배아를 유지한다.
2. 배아를 포함하는 배양 접시 40 ° C로 설정 가열 패드에 몇 군데에 배치합니다.
3. 따뜻한 (37 ° C) 타이로드의 버퍼로, 가장자리까지 접시를 입력합니다. 그대로 노른자를 유지하기 위해 천천히 접시에 완충 용액을 붓는다. 그러나, 난황의 무결성이 단계 동안 손상되​​는 경우, 배아를 버린다.
4. 배아의 중심 축이 조절 스탠드에서 일시 중단되는 초음파 프로브에 수직 인 것을 동양 배아 등.
5. 초음파 시스템 오페라팅은 B-모드에서 화면의 박동 심장의 2D 이미지를 획득하고 OFT, 심실과 OVJ 명확하게 볼 수 있습니다 있도록 스테이지 (손 난로)를 이동합니다.
6. 원하는 펄스 반복 주파수 (예를 들어, 20 kHz에서)에서, 펄스 파 (PW) 모드로 전환하고 OVJ 정확히 속도 데이터를 얻을 수 있습니다. 심박동의 B 모드 영상이 화면에 얻어진다.
   1. 공정 거래 청, 심실과 OVJ을 볼 수있는 무대를 이동합니다. 초음파 시스템 소프트웨어를 사용하여 정확하게 OVJ로 속도 측정을 얻었다.

주 : 배아의 심장 박동수는 촬상 동안 감소하면, 얻어진 속도 데이터를 분석을 위해 사용되지 않아야한다. 속도 측정에 사용 된 모든 배아는 바람직하게는 초음파 촬상 후에 다른 실험에 사용되어서는 안된다.

결과

그림 1은 OFT 밴딩에 필요한 악기를 사용하는 것이 좋습니다. 뚜껑이 덮여 때 배아를 파괴하지 않도록 배아 예를 포함하는 페트리 접시 (도 1a)는 오보 충분히 깊어 야한다. 깊은 배양 접시 (도 1C)는 또한 타이로드의 버퍼의 충분한 양이 난황 위에 붓고 수 있도록 초음파 이미징을 위해 사용되어야한다.

토론

이 기술은 상대적으로 빠르게 수행하기 쉬운, 그러나 특정 키 포인트는 정확한 다운 스트림 결과를 얻을 수 있도록 염두에 보관해야합니다. 배아는 충분한 수분 보충을 제공하는 타이로드의 버퍼를 포함하는 배양 접시에서 비켜 예를 유지되어야한다. 타이로드의 버퍼와 노른자 수술 후 수분을하고 배양 챔버가 적절하게 수화되어 있는지 확인하는 것도 중요하다. 출혈이 볼 수 또는 노른자...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fertilized Bovan chicken eggs	Clemson University, Clemson, SC
11 / 0 Nylon suture	Ashaway	S30001	UV sterilize knots before surgery
100 x 26 mm petri dish	VWR	25387-030
Transfer pipettes	Thermo Scientific	232-20S
Scalpel handle #3	Fine Science Tools	91003-12
Straight scissor	Roboz	RS-6702
Dumont #5 fine forceps	Fine Science Tools	11254-20
Tyrodes buffer	Sigma-Aldrich	2145-10L	Filter sterlize before use
Sodium bicarbonate	Fisher Scientific	S233-500
Vevo 770 Ultrasound Imaging system	VisualSonics, Inc.	VS-11392
708 Ultrasound transducer	VisualSonics, Inc.	VS-11171