Un romanzo<em&gt; Ex Ovo</em&gt; Tecnica Banding alterare intracardiaca Emodinamica in un sistema embrionali di pollo

Riepilogo

For the first time we present here a reproducible banding procedure to alter hemodynamics in the developing heart ex ovo. This is achieved by partially constricting the outflow tract (OFT).

Abstract

The new model presented here can be used to understand the influence of hemodynamics on specific cardiac developmental processes, at the cellular and molecular level. To alter intracardiac hemodynamics, fertilized chicken eggs are incubated in a humidified chamber to obtain embryos of the desired stage (HH17). Once this developmental stage is achieved, the embryo is maintained ex ovo and hemodynamics in the embryonic heart are altered by partially constricting the outflow tract (OFT) with a surgical suture at the junction of the OFT and ventricle (OVJ). Control embryos are also cultured ex ovo but are not subjected to the surgical intervention. Banded and control embryos are then incubated in a humidified incubator for the desired period of time, after which 2D ultrasound is employed to analyze the change in blood flow velocity at the OVJ as a result of OFT banding. Once embryos are maintained ex ovo, it is important to ensure adequate hydration in the incubation chamber so as to prevent drying and eventually embryo death. Using this new banded model, it is now possible to perform analyses of changes in the expression of key players involved in valve development and to understand the role of hemodynamics on cellular responses in vivo, which could not be achieved previously.

Introduzione

Abnormally formed outflow valves are the most common type of congenital heart defects ¹. However, defective cardiac valve structure and function, even though present at birth, may become symptomatic only in adulthood. In fact, several adult valve diseases can be attributed to a congenital origin. Treatment of such patients often involves replacing defective valves, and, importantly, replaced aortic valves have been shown to have congenital anomalies ². Given the fact that critical processes involved in valve development begin early during embryogenesis, the importance of better understanding the mechanisms that regulate these events is highlighted.

The primitive heart tube, which is the first functioning organ in an embryo, exhibits two distinct layers - an endothelial endocardium surrounded by myocardium - separated by extracellular matrix (cardiac jelly) which is mostly produced and secreted by the myocardium ^3-5. As development continues, valve primordia (endocardial cushions) are formed, after rightward looping of the embryonic heart, by local expansion of the cardiac jelly at the atrioventricular (AV) canal and the outflow tract (OFT) ^4,6. This expansion is mediated by the highly regulated process of epithelial-mesenchymal transition (EMT), during which the cardiac jelly becomes populated by endocardially-derived mesenchymal cells ⁶. In addition to the mesenchymal population derived through EMT, neural crest cells are also involved in valvulogenesis of the OFT ³.

Hemodynamic stimuli, such as shear stress, are important epigenetic factors that regulate heart development in the embryo ^7,8. Using a 3D in vitro system, we have previously shown shear stress to be a factor influencing the expression and deposition of fibrous extracellular matrix (ECM) proteins in AV and OFT cushions ^9,10. Moreover, studies carried out by several researchers have demonstrated that altered blood flow leads to improper valves and septa formation ^11-16. Recently, using the novel banding procedure presented here, we have shown that changing hemodynamics in the embryonic chick heart affects the early processes involved in OFT valve formation ¹⁷.

The technique described here provides a novel model for altering hemodynamics in the developing chick heart by partially constricting the OFT ex ovo. This reproducible procedure is relatively quick and allows researchers to obtain a sufficient number of embryos/whole hearts/OFT tissue, etc. for downstream analyses including gene expression studies. Moreover, this new model can be used to study 'chronic' effects of altered hemodynamics on OFT valve development.

Protocollo

embrioni aviaria non sono considerati animali vertebrati ai sensi della normativa IUCAC.

1. Ottenere embrioni per la chirurgia

1. Incubare 80 - 90 uova di gallina Bovan fecondate (smussato finire) in un umidificata (60%) bilanciere incubatore a 40 ° C per circa 72 ore per ottenere embrioni a Hamilton e Hamburger (HH) fase 17. determinare il numero esatto di uova sulla base di analisi della potenza e il tasso di sopravvivenza degli embrioni ^17. Utilizzare i vassoi di uova di plastica per l'incubazione per consentire un'adeguata circolazione dell'aria.
2. Dopo questa fase di sviluppo desiderato è raggiunto, versare circa 20 ml di acqua calda (37 ° C) di tampone di Tyrode (integrato con bicarbonato di sodio (1 g / L)) in un x 26 mm piastra di Petri a 100 mm.
3. Sterilizzare un guscio d'uovo con il 70% di etanolo.
4. rompere delicatamente il guscio con un manico bisturi e rilasciare con cautela il contenuto nel piatto contenente tampone di Tyrode. Scartare gli embrioni se (i) in cui appaiono visivamente anomala (ii)non sono in fase di sviluppo a destra (iii) sono impropriamente orientati sulla tuorlo e / o (iv) si verifica un sanguinamento. Conservare eventuali embrioni non soggetti a un intervento chirurgico subito dopo essere state poste ex ovo a 40 ° C in modo da non compromettere lo sviluppo.
   Nota: Staging è effettuata sulla base di Hamilton e Hamburger ^18. Anomalie di embrioni di pollo è determinata ad occhio nudo e nell'ambito di applicazione dissezione. Assicurarsi che l'embrione ha piegatura appropriata e flessione e vascolare.

2. OFT Banding

1. Tweeze fuori singoli thread lunghi 1 cm da un unico 11/0 nylon sutura chirurgica e formare un nodo sciolto. UV sterilizzare tutti i nodi preformati.
2. Sotto un microscopio dissezione, assicurarsi visivamente che il cuore batte a una velocità normale (~ 120 battiti / min). In caso contrario, eliminare l'embrione.
3. Appena prima dell'intervento chirurgico, applicare 5 - 6 ml di acqua calda (37 ° C) di tampone di Tyrode alla superficie embrione utilizzando una pipetta di trasferimento.
4. Far passare una estremità libera del nodo preformato sotto l'OFT, posizionare la sutura al OFT / ventricolo giunzione (OVJ) (o posizione desiderata), e passare l'estremità libera nel nodo costrizione in tal modo l'OFT comprese le membrane che circondano il cuore.
5. Dopo l'intervento chirurgico, bagnare la superficie del tuorlo con 5 - 6 ml di calda (37 ° C) di tampone di Tyrode utilizzando una pipetta di trasferimento.
6. Mantenere gli embrioni di controllo ex ovo come gli embrioni a bande; tuttavia non li soggetti alla procedura chirurgica.
7. Incubare gli embrioni, per la quantità di tempo desiderato, a 40 ° C in un (60%) incubatrice umidificata.
8. Una volta che il punto di tempo desiderato viene raggiunto, asportare l'embrione dal tuorlo con le forbici diritte. Sezionare il cuore con una pinza sottile e utilizzare per diversi studi a valle, come i cambiamenti nella morfologia cardiaca a causa di alterata emodinamica ^17.

3. A conferma che l'intervento bendaggio causa un cambiamento nella Emodinamica

Nota: La costrizione parziale dovuto all'intervento bande porta ad un aumento della velocità del flusso sanguigno al OVJ. Questo parametro emodinamico è convenientemente valutata utilizzando immagini ecografiche 2D, che viene eseguita nel punto desiderato tempo dell'esperimento.

1. Poiché solo un singolo embrione può essere ripreso alla volta, mantenere tutti gli altri embrioni designati per l'imaging ad ultrasuoni in un incubatore a 40 °.
2. Porre la capsula di Petri contenente l'embrione di essere ripreso su una piastra elettrica fissata a 40 ° C.
3. Riempire il piatto, fino all'orlo, con acqua calda (37 ° C) del buffer di Tyrode. Versare lentamente la soluzione tampone nel piatto in modo da mantenere intatto il tuorlo. Se, tuttavia, l'integrità del tuorlo è compromessa durante questa fase, scartare l'embrione.
4. Orient dell'embrione tale che l'asse centrale dell'embrione è perpendicolare alla sonda ad ultrasuoni che è sospeso da un supporto regolabile.
5. Con l'opera macchina ad ultrasuoniTing in B-mode, ottenere un'immagine 2D del cuore pulsante sullo schermo e spostare il palco (piastra elettrica) in modo tale che l'OFT, ventricolo e OVJ sono chiaramente visibili.
6. Passare alla modalità pulsato onda (PW), alla frequenza di ripetizione degli impulsi desiderata (ad esempio, 20 kHz) e di ottenere esattamente dati di velocità al OVJ. Una immagine B-mode del cuore pulsante si ottiene sullo schermo.
   1. Spostare lo stadio per vedere l'OFT, ventricolo e la OVJ. Utilizzando il software macchina ad ultrasuoni, ottenere misure di velocità esattamente al OVJ.

Nota: Se la frequenza cardiaca di un embrione diminuisce durante l'imaging, i dati di velocità così ottenuti non devono essere utilizzati per l'analisi. Tutti embrioni utilizzati per misure di velocità non dovrebbero preferibilmente essere utilizzati per altri esperimenti dopo ecografica.

Risultati

Mostrato nella Figura 1 sono strumenti necessari per OFT bande raccomandato. La capsula di Petri (Figura 1A) contenente l'embrione ex ovo deve essere sufficientemente profonda in modo da non distruggere l'embrione quando coperto con il coperchio. Capsule di Petri profondi (Figura 1C) dovrebbero essere utilizzati anche per l'imaging ad ultrasuoni per consentire un adeguato volume di tampone di Tyrode da versare in cim...

Discussione

Questa tecnica è relativamente semplice e facile da eseguire, tuttavia alcuni punti chiave devono essere tenuti in considerazione in modo da ottenere risultati accurati valle. Gli embrioni devono essere mantenuti ex ovo in una capsula di Petri che contiene tampone di Tyrode di fornire adeguata reidratazione. E 'anche importante per idratare il tuorlo post-chirurgia con tampone di Tyrode e per assicurarsi che la camera di incubazione è adeguatamente idratato. Interventi chirurgici non devono essere eseguit...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fertilized Bovan chicken eggs	Clemson University, Clemson, SC
11 / 0 Nylon suture	Ashaway	S30001	UV sterilize knots before surgery
100 x 26 mm petri dish	VWR	25387-030
Transfer pipettes	Thermo Scientific	232-20S
Scalpel handle #3	Fine Science Tools	91003-12
Straight scissor	Roboz	RS-6702
Dumont #5 fine forceps	Fine Science Tools	11254-20
Tyrodes buffer	Sigma-Aldrich	2145-10L	Filter sterlize before use
Sodium bicarbonate	Fisher Scientific	S233-500
Vevo 770 Ultrasound Imaging system	VisualSonics, Inc.	VS-11392
708 Ultrasound transducer	VisualSonics, Inc.	VS-11171