Ein Roman<em&gt; Ex Ovo</em&gt; Banding-Technik intrakardialer Hämodynamik in einem embryonalen Hühner System ändern

Zusammenfassung

For the first time we present here a reproducible banding procedure to alter hemodynamics in the developing heart ex ovo. This is achieved by partially constricting the outflow tract (OFT).

Zusammenfassung

The new model presented here can be used to understand the influence of hemodynamics on specific cardiac developmental processes, at the cellular and molecular level. To alter intracardiac hemodynamics, fertilized chicken eggs are incubated in a humidified chamber to obtain embryos of the desired stage (HH17). Once this developmental stage is achieved, the embryo is maintained ex ovo and hemodynamics in the embryonic heart are altered by partially constricting the outflow tract (OFT) with a surgical suture at the junction of the OFT and ventricle (OVJ). Control embryos are also cultured ex ovo but are not subjected to the surgical intervention. Banded and control embryos are then incubated in a humidified incubator for the desired period of time, after which 2D ultrasound is employed to analyze the change in blood flow velocity at the OVJ as a result of OFT banding. Once embryos are maintained ex ovo, it is important to ensure adequate hydration in the incubation chamber so as to prevent drying and eventually embryo death. Using this new banded model, it is now possible to perform analyses of changes in the expression of key players involved in valve development and to understand the role of hemodynamics on cellular responses in vivo, which could not be achieved previously.

Einleitung

Abnormally formed outflow valves are the most common type of congenital heart defects ¹. However, defective cardiac valve structure and function, even though present at birth, may become symptomatic only in adulthood. In fact, several adult valve diseases can be attributed to a congenital origin. Treatment of such patients often involves replacing defective valves, and, importantly, replaced aortic valves have been shown to have congenital anomalies ². Given the fact that critical processes involved in valve development begin early during embryogenesis, the importance of better understanding the mechanisms that regulate these events is highlighted.

The primitive heart tube, which is the first functioning organ in an embryo, exhibits two distinct layers - an endothelial endocardium surrounded by myocardium - separated by extracellular matrix (cardiac jelly) which is mostly produced and secreted by the myocardium ^3-5. As development continues, valve primordia (endocardial cushions) are formed, after rightward looping of the embryonic heart, by local expansion of the cardiac jelly at the atrioventricular (AV) canal and the outflow tract (OFT) ^4,6. This expansion is mediated by the highly regulated process of epithelial-mesenchymal transition (EMT), during which the cardiac jelly becomes populated by endocardially-derived mesenchymal cells ⁶. In addition to the mesenchymal population derived through EMT, neural crest cells are also involved in valvulogenesis of the OFT ³.

Hemodynamic stimuli, such as shear stress, are important epigenetic factors that regulate heart development in the embryo ^7,8. Using a 3D in vitro system, we have previously shown shear stress to be a factor influencing the expression and deposition of fibrous extracellular matrix (ECM) proteins in AV and OFT cushions ^9,10. Moreover, studies carried out by several researchers have demonstrated that altered blood flow leads to improper valves and septa formation ^11-16. Recently, using the novel banding procedure presented here, we have shown that changing hemodynamics in the embryonic chick heart affects the early processes involved in OFT valve formation ¹⁷.

The technique described here provides a novel model for altering hemodynamics in the developing chick heart by partially constricting the OFT ex ovo. This reproducible procedure is relatively quick and allows researchers to obtain a sufficient number of embryos/whole hearts/OFT tissue, etc. for downstream analyses including gene expression studies. Moreover, this new model can be used to study 'chronic' effects of altered hemodynamics on OFT valve development.

Protokoll

Avian Embryonen werden nicht an Wirbeltieren unter IUCAC Vorschriften berücksichtigt.

1. Gewinnung Embryonen für Chirurgie

1. Inkubieren 80-90 befruchtete Bovan Hühnereier (stumpfes Ende nach oben) in einem befeuchteten (60%) rocker Inkubator bei 40 ° C für etwa 72 Stunden Embryonen bei Hamilton und Hamburger (HH) Stufe 17. Bestimmen Sie genaue Anzahl der Eier zu erhalten, basierend auf Leistungsanalyse und Überlebensrate von Embryonen ^17. Verwenden Sie Kunststoff-Ei-Tabletts für die Inkubation, um eine angemessene Luftzirkulation zu ermöglichen.
2. Sobald diese gewünschte Entwicklungsstufe erreicht wird, gieße ca. 20 ml warmem (37 ° C) Tyrode-Puffer (mit Natriumbicarbonat supplementiert (1 g / L)) in eine 100 mm x 26 mm Petrischale.
3. Sterilisieren eine Eierschale mit 70% Ethanol.
4. knacken Sie vorsichtig die Schale mit einem Skalpell Griff und sorgfältig lösen seinen Inhalt in die Schüssel Tyrode-Puffer enthält. Entsorgen Embryonen, wenn (i) sie visuell abnormal erscheinen (ii) sienicht im richtigen Entwicklungsstadium sind, (iii) sie auf dem Dotter unsachgemäß ausgerichtet sind und / oder (iv) auftritt jede Blutungen. Behalten alle Embryonen nicht der Operation unterzogen , unmittelbar nach dem bei 40 ° C platziert ex ovo , um keine Entwicklung zu beeinträchtigen.
   Hinweis: Die Zuschaltung wird durchgeführt basierend auf Hamilton und Hamburger ^18. Abnormality von Hühnerembryonen ist mit dem bloßen Auge und unter der Dissektion Umfang bestimmt. Stellen Sie sicher, dass der Embryo entsprechende Faltung hat und Biegen und Gefäßen.

2. OFT Banding

1. Tweeze aus einzelnen 1 cm lange Fäden aus einem einzigen 11/0 Nylon chirurgisches Naht und bilden einen losen Knoten. UV alle vorgefertigten Knoten sterilisieren.
2. Unter einem Präpariermikroskop sicher visuell, dass das Herz mit einer normalen Rate schlägt (~ 120 Schläge / min). Wenn nicht, werfen Sie den Embryo.
3. Kurz vor der Operation anwenden 5 - 6 ml warmem (37 ° C) Tyrode-Puffer auf die Embryooberfläche eine Transferpipette.
4. Führen Sie einen freien Ende des vorgeformten Knoten unter der OFT, positionieren Sie die Naht an der OFT / Ventrikel Übergang (OVJ) (oder gewünschte Position), und das freie Ende in den Knoten passieren, wodurch die OFT einzuengen einschließlich der Membranen, die das Herz.
5. Nach der Operation benetzen die Oberfläche des Eigelbs mit 5 - 6 ml warmem (37 ° C) Tyrode-Puffer, der eine Transferpipette.
6. Behalten Sie die Kontrolle Embryonen ex ovo wie die gebänderte Embryonen; aber sie unterliegen nicht dem chirurgischen Eingriff.
7. Inkubiere die Embryonen, für die gewünschte Zeitdauer, bei 40 ° C in einem befeuchteten (60%) Inkubator.
8. Sobald der gewünschte Zeitpunkt erreicht ist, auszuschneiden, den Embryo aus dem Dotter mit geraden Schere. Präparieren Sie das Herz mit einer feinen Pinzette und verwenden für mehrere Downstream - Studien wie zum Beispiel Veränderungen der kardialen Morphologie aufgrund veränderter Hämodynamik ^17.

3. Bestätigen, dass der Banding Intervention eine Veränderung der Hämodynamik Ursachen

Anmerkung: Die teilweise durch die banding Eingriff verursachte Verengung führt zu einer Erhöhung der Blutströmungsgeschwindigkeit an der OVJ. Dieser hämodynamische Parameter wird zweckmßigerweise unter Verwendung von 2D-Ultraschallbildgebungs beurteilt, die bei dem gewünschten Zeitpunkt des Experiments durchgeführt wird.

1. Da nur ein einziger Embryo zu einem Zeitpunkt abgebildet werden, halten alle anderen zur Ultraschallbildgebung bezeichnet Embryonen in einem 40 ° C Inkubator.
2. Legen Sie die Petrischale den Embryo enthält, auf einem Heizkissen bei 40 ° C eingestellt abgebildet werden.
3. Füllen Sie die Schüssel, bis zum Rand, mit warmem (37 ° C) Tyrode-Puffer. Gießen Sie langsam die Pufferlösung in die Schale, um das Eigelb intakt zu halten. Wenn jedoch die Integrität des Eigelbs bei diesem Schritt kompromittiert, verwerfen den Embryo.
4. Orient der Embryo, so dass die Mittelachse des Embryos senkrecht zu der Ultraschallsonde, die aus einem einstellbaren Ständer aufgehängt ist.
5. Mit dem Ultraschallgerät Operting in B-Modus, ein 2D-Bild des schlagenden Herzens auf dem Bildschirm zu erhalten und die Stufe (Heizkissen), so dass das OFT, Ventrikel und OVJ sind deutlich sichtbar bewegen.
6. Umschalten auf die gepulste Wellen (PW) -Modus, bei der gewünschten Impulswiederholungsfrequenz (zB 20 kHz) und erhalten Geschwindigkeitsdaten genau an der OVJ. Ein B-Modus-Bild des schlagenden Herzens wird auf dem Bildschirm erhalten.
   1. Bewegen Sie die Stufe der OFT, Ventrikel und die OVJ zu sehen. Mit Hilfe der Ultraschall-Maschine-Software, erhalten Geschwindigkeitsmessungen genau an der OVJ.

Hinweis: Wenn der Herzfrequenz eines Embryos während der Bilderzeugung verringert, die Geschwindigkeit so erhaltenen Daten nicht für die Analyse verwendet werden. Alle Embryonen für die Geschwindigkeitsmessungen verwendet werden, sollten vorzugsweise nicht für andere Experimente nach der Ultraschall-Bildgebung verwendet werden.

Ergebnisse

In Abbildung 1 dargestellt sind Instrumente für OFT Banding erforderlich empfohlen. Die Petrischale (1A) , um den Embryo ex ovo enthält , sollte tief genug sein, um nicht den Embryo zu zerstören , wenn sie mit dem Deckel bedeckt. Tiefpetrischalen (1C) sollte auch für die Ultraschall - Bildgebung verwendet werden , ein ausreichendes Volumen an Tyrode-Puffer zu ermöglichen , oben auf dem Dotter gegossen werden.

Diskussion

Diese Technik relativ schnell und einfach durchzuführen, jedoch bestimmte Schlüsselpunkte müssen im Auge behalten werden, um genaue nachgelagerten Ergebnisse zu erzielen. Embryonen ex ovo in einer Petrischale gehalten werden , die Tyrode-Puffer enthält ausreichende Rehydratisierung vorzusehen. Es ist auch wichtig, den Dotter nach der Operation mit Tyrode-Puffer, um Hydrat und sicher, dass die Inkubationskammer zu machen, ist ausreichend mit Flüssigkeit versorgt. Chirurgie sollte nicht auf einem Embryo durc...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fertilized Bovan chicken eggs	Clemson University, Clemson, SC
11 / 0 Nylon suture	Ashaway	S30001	UV sterilize knots before surgery
100 x 26 mm petri dish	VWR	25387-030
Transfer pipettes	Thermo Scientific	232-20S
Scalpel handle #3	Fine Science Tools	91003-12
Straight scissor	Roboz	RS-6702
Dumont #5 fine forceps	Fine Science Tools	11254-20
Tyrodes buffer	Sigma-Aldrich	2145-10L	Filter sterlize before use
Sodium bicarbonate	Fisher Scientific	S233-500
Vevo 770 Ultrasound Imaging system	VisualSonics, Inc.	VS-11392
708 Ultrasound transducer	VisualSonics, Inc.	VS-11171