血液処理のための迅速な方法は、ヒト血液中の血漿ペプチドレベルの収量を増やすには

要約

RAPID血液処理方法は、ヒトで使用され、より高いペプチド濃度をもたらすだけでなく、適切な分子形態の評価を可能にすることができます。したがって、この方法は、ペプチド研究の貴重なツールとなるでしょう。

要約

食物摂取規制の分野での研究が重要性を増しています。これは、多くの場合、食物摂取を調節するペプチドの測定を含みます。ペプチドの濃度の正確な決意のためには、血液処理中に安定であるべきです。しかし、これはすぐに、内因性のペプチダーゼによって分解されるいくつかのペプチドには当てはまりません。最近、我々はR析出温度、cidificationを用いた血液処理方法を開発し、Pは 私は外因性のコントロールおよびラットでの使用のためのD ilution（RAPID）をsotopic、阻害をrotease。ここでは、ヒトで使用するためにこの技術を確立し、回復、分子形態および食物摂取規制ホルモンの循環濃度を調査しました。迅速な方法が大幅に¹²⁵ I標識ソマトスタチン28（+ 39％）、グルカゴン様ペプチド-1（+ 35％）の回復、アシルグレリン及びグルカゴン（+ 32％）、インスリンおよびキスペプチン（+ 29％向上しました）、のNesfatin-1（+ 28％）、レプチン（+ 21％）と標準的な処理（氷上でEDTA血液、P <0.001）と比較して、ペプチドYY _3-36（+ 19％）。標準的な処理の後にアシルグレリンの62％がそうdesacylグレリンを表す以前のピークが得られ分解された一方で、高速液体クロマトグラフィーは、迅速な処理後の予想位置での内因性アシルグレリンの溶出を示しました。標準処理た（p = 0.03）以下の1時23分に比べて3：RAPID処理した後、正常体重の被験者の血液中のアシル/ desacylグレリン比は1でした。また、内因性キスペプチンレベルは、標準的な処理に比べRAPID後に高かった（+ 99％、P = 0.02）。 RAPID血液処理方法は、ヒトで使用することができ、より高いペプチド濃度が得られ、正確な分子形態の評価を可能にします。

概要

肥満^1,2の世界的な増加罹患率の光では、食物摂取規制の分野での研究は重要性を増しています。唯一のペプチドが知られているこれまでのところそれが末梢 ​​生成され、中央に食物摂取を刺激するように作用するが、すなわちグレリン^3は 、過去数十年以内に、ペプチドの広い範囲は、例えば 、食物摂取を減少させることが確認されています。レプチン、ペプチドYY（PYY）、また、グルカゴン様ペプチド-1（GLP-1）およびインシュリン^4は 、そのため、空腹および満腹ペプチドレベルの調節機構を調査する研究において頻繁に評価され、同時に、それが想定され研究ペプチドが安定してプラズマ形成中に高収量で回収されます。 例えばのために前に示したようにしかし、非常に多くの場合、これは、急速な内因性の故障にそうではありません。グレリン^5を desacylするアシルから分解されるグレリン。したがって、我々は最近、血液プロセスへのための迅速な方法を説明しましたR析出温度、cidificationを採用したラットで歌う、Pは 私は外因性コントロールとDの ilution ^6を sotopic、阻害をrotease。この方法は、標準的な血液処理（氷上でEDTA血液^）6と比較して、正しい循環分子形態の決意について試験し、許可された11 12のペプチドの回復を改善しました。この方法は、コルチコトロピン放出因子¹³と同様に、グレリンの循環の検出のためにいくつかのその後の研究^7-12で使用されています。したがって、この方法は、げっ歯類のペプチド研究のために有用であることがわかりました。げっ歯類の研究は常に別の種に翻訳可能ではないので、この方法は、同様に、ヒトの血液中での使用のために確立されるべきです。

本研究の目的は、広く¹⁴と頻繁にuの推奨される標準的な血液処理、氷上でEDTA血液、と比較して、ヒトでの血液処理のための迅速な方法を試験することでした臨床だけでなく、研究の場でのsed。 （食物摂取に対する効果を表1に示した）処理の後、我々は、確立されたペプチドを含む食物摂取の調節に関与する¹²⁵ I標識化ペプチドの選択の回復をテストならびに新しい候補は、最近、摂食調節における役割を果たすことが示唆しました両方の方法で。ホルモンは、異なる長さおよび電荷（ 表2）のペプチドを表すために選択しました。また、グレリンのために我々は、標準およびRAPID方法以下の分子形態（複数可）を調べました。最後に、我々は、ペプチドはまた、最近RAPIDまたは標準処理以下の食物摂取^15,16の調節に役割を果たしていることが示唆、内因性グレリン（アシルおよびdesacylグレリン）、ならびにキスペプチンレベルを評価しました。さらに、我々はまた、possibを研究するために（10.2から67.6 kg /日m ²の範囲）ボディマス指数の広い範囲で被験体の集団において、これらのペプチドのレベルを調査しました慢性的に改変された体重に関連するル違い。

診断、評価、およびプラン：
試験参加者
すべての試験参加者は、新たにシャリテ-Universitätsmedizinベルリンで心身医学の部門の（封入病院に入院の2日以内であった）の患者を入院し、書面によるインフォームドコンセントを与えました。性別の影響を回避するために唯一の女性患者が含まれていました。 42科目の合計は、この研究に参加し、3群に分けた：正常体重（BMI 18.5〜25キロ/ m ²であり、N = 12）、神経性無食欲症（BMI <17.5キロ/ m ²であり、N = 15）と肥満（BMI、> 30 kg /日m ²であり、n = 15）。拒食症と肥満患者ました疾患-10の国際分類に従って診断し、それぞれ体重増加（拒食症）や体重減少（肥満）、入院。すべての正常体重の患者は、関連する身体的障害なしに起因する身体表現の症状だけに入院しました。胃腸の身体表現の症状や消化管手術の既往歴のある患者は除外しました。除外基準はまた、年齢<18歳、現在妊娠中や未処理の精神病疾患を包含しました。採血は、それぞれ、体重を増加または減少させるために食事療法を受ける前に、2日目または入院後3で実施しました。人体計測パラメータは、同じ日に評価しました。

プロトコル

プロトコルは、ヒトの研究（プロトコル番号EA1 / 10分の114）のための地域倫理委員会によって承認されました。

1.血液処理

1. 標準的な手順やRAPID方法に従って前腕静脈およびプロセスから一晩絶食した後、07：00〜08:00の間の静脈血を採取します。被験者は、採血前に運動したり、喫煙しないように指示します。
2. 標準的な処理のために、4℃で10分間、3000×gで10分以内に冷やしたEDTA含有チューブ内の血液や遠心分離機を集めます。上清を収集し、ラジオイムノアッセイによってさらに処理するまで-80℃に保ちます。
3. 迅速な処理のために、すぐに血液を希釈し、氷冷緩衝液中で1:10（pHは3.6）、0.1M酢酸アンモニウム、0.5 M NaClを含むおよび酵素阻害剤（採血後1分以内）（ジプロチンA、E-64-D、アンチパイン、ロイペプチン、キモスタチン、1 / mlの）。その後、4℃で10分間、3,000×gで10分以内に遠心分離し、上清たちを集めますラット⁶で前に詳述したようにポリプロピレン製チューブにピペットをる。
   1. 、100％アセトニトリル（速度10ml /分）を用いたクロマトグラフィーカートリッジを（360 mgを、55から105μm）を充電0.1％トリフルオロ酢酸（TFA、速度10ml /分）で平衡化し、1mlの一定速度で上清とロード/シリンジポンプを用いて分。
   2. その後3mlの0.1％TFA（流量10ml /分）でカートリッジを洗浄し、ゆっくりとTFA（2ml /分）0.1％を含有する2 mlの70％アセトニトリルで溶出します。
   3. ラジオイムノアッセイによってさらに処理するまで-80℃で真空遠心分離およびストアを使用してドライ溶出したサンプル。
      注：ポリプロピレン（RAPID処理）とホウケイ酸（ラジオイムノアッセイ）結合特性を有意に低い表面を示すため^、26の前に研究したペプチドのほとんどのペプチドの損失を最小限にチューブ内のすべてのステップを実施します。

2.測定

注：このセクションの手順は、実験室で行われるべきです放射性物質との仕事のために認定されています。私が取るべき¹²⁵での作業のための標準予防策。

1. 放射性標識ペプチドの回復
   1. ¹²⁵ I放射性標識ヒトのペプチドを得る（ 例えば 、アシル-グレリン、GLP-1、グルカゴン、インスリン、キスペプチン、レプチン、のNesfatin-1、PYY _3-36およびソマトスタチン-28）。
   2. その後、新鮮に0.1％酢酸（1mlあたり〜10万CPM）で希釈し、実験まで、粉末状のペプチドを保管してください。
   3. 標準的な血液処理のため、直接チューブ、（実験を開始する前に、直接カウント）3,000-6,000 CPMを含む放射性標識を50μlとチューブへの血液の転送1ミリリットルを含む冷却EDTAに採血後。
   4. 9ミリリットルRAPIDバッファー（組成は1.3を参照のこと）および30,000〜60,000 cpmのを含む500μlの放射性標識を含むチューブに血液をEDTA含有の迅速な処理のために、転送1ミリリットルの血液。 radiolabeの1:10希釈用10倍高いボリュームに迅速な処理のためのリットル。
   5. 1.3.2へのステップ1.2で説明したようにその後、プロセスサンプル。
   6. 回収実験のために、真空遠心分離によりない乾燥試料を行い、-80℃で保管しないでください。その代わりに、直接、その後ガンマカウンターを用いて放射性標識ペプチドの回収率を評価します。
   7. RAPIDサンプルで使用される放射性標識の量の比較可能性を得るために、全容積の1/10を分析しながら、標準試料中の全上清を測定します。測定には、ガンマカウンターにフィットするチューブに上清を転送し、カウント毎分を評価します
   8. 100％標準として、処理を受けない¹²⁵ I放射性標識ペプチドの50μlの二つのサンプルを使用しています。 2.1.7で説明したように他のサンプルと同時に測定します。
   9. 各ペプチドについての実験を5〜6回を実行します。
2. 放射性標識グレリンの高速液体クロマトグラフィー
   1. （c）に血液を撤回チューブと（実験の開始前に、直接カウント）15,000〜20,000 cpmのを含む200μlの放射性標識されたアシルグレリンを含むチューブへの転送1ミリリットルを含むhilled EDTA。
   2. RAPID処理、9ミリリットル（組成1.3を参照用）RAPIDバッファおよび15,000〜20,000 cpmのを含む200μlの放射性標識されたアシルグレリンを含むチューブに移す1ミリリットルの血液のために。
   3. 1.3.2へのステップ1.2で説明したようにその後、プロセスサンプル。
   4. 逆相HPLCによるさらなる分析のために、直接水中の17％アセトニトリル（いずれも0.1％TFAを補った）で平衡化した安定な結合のC18カラム（×50mmの2.1ミリメートル、1.8μm）の上にサンプルをロードします。
   5. 5分間の平衡化後、40分（流速1ml /分）でサンプルを溶出するために17-40％のアセトニトリルの勾配を使用します。
   6. 1ミリリットル毎分の画分を収集し、ガンマカウンターを使用して放射能を分析します。
   7. 別の実験では、負荷200μlの放射性標識されたアシルグレリンは、15,000〜20,000を含みますcpmを直接カラムにし、ステップ2.2.6に2.2.4で説明したようにHPLCを行います。
3. ラジオイムノアッセイ
   1. ラジオイムノアッセイのために、凍結した上清（標準処理）を解凍し、室温で乾燥した粉末（RAPID法）真空。
   2. 直前のラジオイムノアッセイ、プラズマ（500μL）の元のボリュームに応じて二重蒸留H ₂ Oで乾燥RAPIDサンプルを再懸濁。
   3. ^12,27の前に説明したように、製造業者のプロトコルに従って商業ラジオイムノアッセイを用いてキスペプチンと合計（desacylとアシルグレリンの両方を含む）、ならびにアシルグレリンを評価します。安定したペレットの形成を可能にホウケイ酸チューブを使用してください。
      1. 初日には、24時間の期間のためにメーカーが提供する希釈でアッセイ緩衝液および一次抗体（ 例えば 、抗グレリン）でサンプルをインキュベートします。
      2. 2日目に^、125 Iトレーサー（ 例えば ^、125 I-グレリン）を追加し、VORTEXと24時間の期間インキュベートします。
      3. 3日目に、沈殿試薬、渦を追加し、製造業者により推奨されるようにインキュベートします。その後、遠心分離管、4℃で20分間、3,000×gで。上清を取り出して、ガンマカウンターを使用して、ペレット中の放射能をカウント
   4. 総マイナスアシルグレリンの差としてdesacylグレリンを計算します。各個々のサンプルのためdesacylグレリンによってアシルを分割することにより、アシル/ desacylグレリン率を評価します。
   5. すべてのサンプルを処理する - 可能であれば - 1バッチで、アッセイ間変動を避けるために。今回の実験でアッセイ内変動は<、<アシルグレリンの合計と<9％7％キスペプチンは8％でした。

3.統計分析

1. コルモゴロフ - スミルノフ検定を使用して、データの分布を決定します。平均±平均の標準誤差（SEM）としてデータを表現します。
2. 両者の違いを評価しますt検定により群。ホルム-シダック法に続くすべてのペアワイズ多重比較手順（テューキー事後テスト）または双方向ANOVAによって複数のグループ間の差異を評価します。
3. p <0.05 の有意で検討し、統計プログラムを使用して分析を行います。

結果

RAPID血液処理は、標準的な血液処理と比較して、ヒト血液中の¹²⁵ I放射性標識ペプチドの収量を増加させます。
標準的な血液処理（氷上でEDTA血液）の後、放射性標識されたペプチドの回収率は9/9ペプチド（ - K 48から68パーセント、 図1Aに至るまで）で〜60％でした。 RAPID処理アシルグレリン（n-オクタノイルグレリン、グルカゴ?...

ディスカッション

我々は、血液処理のための迅速な方法は、ラット⁶で標準的な血液処理に比較して11月12日のペプチドの回復を改善することの前に報告しました。本研究では、この方法は、ヒトにおける使用に適していることを示しています。迅速な処理に続いて、テストした9 ¹²⁵ 9のI標識ペプチドの回復は、標準的な血液処理（氷上でEDTA血液）に比べて改善されました。観察された改善は、?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Diprotin A	Peptides International, Louisville, KY, USA	IDP-4132
E-64-d	Peptides International, Louisville, KY, USA	IED-4321-v
Antipain	Peptides International, Louisville, KY, USA	IAP-4062
Leupeptin	Peptides International, Louisville, KY, USA	ILP-4041
Chymostatin	Peptides International, Louisville, KY, USA	ICY-4063
Sep-Pak C18 cartridges	Waters Corporation, Milford, MA, USA	WAT051910	360 mg, 55-105 µm
Acyl-ghrelin	Millipore, Billerica, MA, USA	9088-HK	Radioactive
GLP-1	Millipore, Billerica, MA, USA	9035-HK	Radioactive
Glucagon	Millipore, Billerica, MA, USA	9030	Radioactive
Insulin	Millipore, Billerica, MA, USA	9011S	Radioactive
Leptin	Millipore, Billerica, MA, USA	9081-HK	Radioactive
Kisspeptin-10	Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA	T-048-56	Radioactive
Nesfatin-1	Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA	T-003-26	Radioactive
PYY3-36	Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA	T-059-02	Radioactive
Somatostatin-28	Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA	T-060-16	Radioactive
ZORBAX Rapid Resolution HT SB-C18 column	Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA	822700-902	2.1 mm x 50 mm, 1.8 µm
Agilent 1200 LC	Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA		HPLC, several components, therefore no single catalog number
Kisspeptin  RIA	Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA	# RK-048-56	Radioactive
Total ghrelin RIA	Millipore, Billerica, MA, USA	# GHRT-89HK	Radioactive
Active ghrelin RIA	Millipore, Billerica, MA, USA	# GHRA-88HK	Radioactive
SigmaStat 3.1	Systat Software, San Jose, CA, USA	online download