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要約

125 I標識アジドの合成と銅のないクリック反応を用いて、dibenzocyclooctyne（DBCO） -基コンジュゲート、13-nmサイズの金ナノ粒子の放射性標識のための詳細な手順が記載されています。

要約

Here, we demonstrate a detailed protocol for the radiosynthesis of a 125I-labeled azide prosthetic group and its application to the efficient radiolabeling of DBCO-group-functionalized gold nanoparticles using a copper-free click reaction. Radioiodination of the stannylated precursor (2) was carried out by using [125I]NaI and chloramine T as an oxidant at room temperature for 15 min. After HPLC purification of the crude product, the purified 125I-labeled azide (1) was obtained with high radiochemical yield (75 ± 10%, n = 8) and excellent radiochemical purity (>99%). For the synthesis of radiolabeled 13-nm-sized gold nanoparticles, the DBCO-functionalized gold nanoparticles (3) were prepared by using a thiolated polyethylene glycol polymer. A copper-free click reaction between 1 and 3 gave the 125I-labeled gold nanoparticles (4) with more than 95% of radiochemical yield as determined by radio-thin-layer chromatography (radio-TLC). These results clearly indicate that the present radiolabeling method using a strain-promoted copper-free click reaction will be useful for the efficient and convenient radiolabeling of DBCO-group-containing nanomaterials.

概要

The strain-promoted copper-free click reaction between azides and cyclooctynes has been extensively applied to the efficient bioorthogonal labeling of a wide range of biomolecules, nanomaterials, and living subjects1-7. Due to the excellent site-specificity and rapid reaction rate of this conjugation reaction, it has also been used to synthesize radiolabeled tracers. A few 18F-labeled azide or DBCO prosthetic groups have been prepared for in vitro labeling of various cancers targeting peptides and antibodies, as well as for in vivo pre-targeted imaging of tumors8-13. In addition to these examples, the same conjugation reaction was applied to the metal-radioisotope-labeling of nanomaterials for positron emission tomography (PET) imaging studies14-16.

For several decades, radioactive iodines have been used for biomedical research and clinical trials through PET imaging (124I), single-photon emission computed tomography (SPECT) imaging (123I, 125I), and thyroid cancer treatment (131I)17-21. Therefore, an efficient method for radioactive iodine labeling is fundamentally important for various investigations, including molecular imaging studies, analysis of organ distribution of biomolecules, biomarker identification, and drug development. A copper-free click reaction strategy could be used in radioactive iodine labeling. However, this application has not been investigated as extensively as 18F-labeled biomolecules22-23. Here, we will provide a step-by-step protocol for the synthesis of an 125I-labeled azide for radiolabeling of DBCO-group-derived molecules. The procedures in the present report will include radioiodination of the stannylated precursor, purification steps with HPLC, and solid phase extraction. We also demonstrate efficient radiolabeling of DBCO-group-modified 13-nm-sized gold nanoparticles using the 125I-labeled azide. The detailed protocol in this report will help synthetic chemists understand a new radiolabeling methodology for the synthesis of radiolabeled products.

プロトコル

注意：放射性ヨウ素の酸化形態は非常に揮発性であり、十分なリードシールドとリードバイアルで処理する必要があります。すべての放射化学的手順は風通し木炭濾過フード内で行われるべきであり、実験手順は、放射能検出装置によって監視される必要があります。

125 I標識アジドの合成のための化学物質と逆相カートリッジの調製

  1. 溶液中の試薬の調製
    1. 150μlの無水エタノール中アジド前駆体（2）（ 図1）1mgを溶解させます。
      注：アジド前駆体の詳細な合成手順は、（2）前報22で報告されました。
    2. 1×リン酸緩衝生理食塩水（pHは= 7.4）20μlに1mgのクロラミンTを溶解させます。
    3. 20μlのH 2 Oで2 mgのメタ重亜硫酸ナトリウムを溶解させます
  2. Preparaカートリッジの化
    1. 10ミリリットルのH 2 O、続いて10ミリリットル無水エタノールでTC18カートリッジを洗います空気とカートリッジのマトリックスを乾燥させないでください。

125 I標識アジド補欠分子族の2放射合成

  1. 前駆体の放射性ヨウ素化反応
    1. 1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブにアジド前駆体溶液（無水エタノールを150μl中1mg）および酢酸（10μl）を追加します。
    2. 反応混合物に0.1 MのNaOH（50μL）の[125 I]のNaI 150 MBqのを追加します。
    3. クロラミンT溶液（1×リン酸緩衝生理食塩水の20μlの中で1 mg）を加え、反応混合物を含むマイクロチューブを閉じます。
    4. 放射性ヨウ素化反応が完了するまで、15分間室温で反応混合物をインキュベートします。
    5. 反応混合物にメタ重亜硫酸ナトリウム溶液（20μlのH 2 O中の2 mg）を加えます放射性ヨウ素化反応を停止します。
    6. 粗生成物の0.2μLを撤回した後、溶液100μl（H 2 O / CH 3 CN、1：1）を用いて希釈し、HPLC分析のために。
      注：すべてのHPLC実験のために、H 2 O（A溶媒）及び溶離剤としてアセトニトリル（溶媒B）を含有する0.1％ギ酸を含む0.1％ギ酸を使用します。
    7. 逆相分析用無線-HPLCを（逆相C18カラムを用いて希釈し、粗生成物を分析;流速：1ml /分;溶離剤勾配：0-2分20％溶媒Bのため20〜80％溶媒B 2-22分、22-23分80〜100％の溶媒B、および23から28分間、100％溶媒B;保持時間：16.4分）（ 図2）。
  2. 分取HPLCで粗生成物の精製
    注：このような注入器、カラム、検出器、コレクションバイアル、および流出物は収集された容器としてHPLC部品の周囲に十分な鉛遮蔽を提供します。
    1. 目を撤回HPLCバイアル中に反応混合物全体を電子。アセトニトリル（0.5ml）で反応管を洗浄し、同じ注射バイアルにリンスを追加します。 H 2 O（1mL）で回収した溶液を希釈します。
    2. 取ラジオ-HPLC（逆相C18カラムを上に、粗生成物を注入し、流速：10ml /分;溶離液勾配：0-2分20％溶媒B、2-22分間の百分の20から80溶媒B、 22-23分80〜100％の溶媒B、および23から28分間、100％溶媒B）。
    3. ガラス試験管において125 I標識アジド（1）（これらのHPLC条件下でのt Rは 17.8から18.8分である）（ 図2）を表す放射性ピークを集めます。
    4. 製造業者のプロトコルに従って放射能線量キャリブレータを使用して、画分の放射化学的収率を測定します。
    5. 生成物の放射化学的純度を決定するための同一のHPLC条件を使用して分析ラジオHPLCに精製された生成物を注入します。
  3. 製品の固相抽出
    1. 40ミリリットルで、所望の生成物（1）を含む画分を希釈し、純粋なH 2 O
    2. 予め調整TC18カートリッジに希釈した溶液を加えます。
    3. 追加の15ミリリットルのH 2 Oでカートリッジを洗浄
    4. 生成物を溶出（1）鉛シールドによって保護されている10-mlのガラスバイアルに2ミリリットルのアセトンでカートリッジ内に閉じ込められました。製造業者のプロトコルに従って放射能線量キャリブレータを用いて溶出し、製品の放射能を測定します。
      注：ジメチルスルホキシド（DMSO）または無水エタノールは、また、カートリッジからの生成物の溶出のために使用することができます。放射能の約5〜10％、通常カートリッジに付着し、残りの放射性標識生成物が完全に有機溶媒の過剰量を用いて溶出することができません。
    5. 窒素またはアルゴンガスの流れでアセトンを蒸発させます。
    6. 再溶解させます次の放射性標識工程のためのDMSO（100〜200μl）を持つs​​idue。

DBCO-基結合金ナノ粒子の3合成

  1. DBCO基含有ポリエチレングリコールと13-nmサイズの金ナノ粒子の表面修飾
    1. 既報24に従って、クエン酸ナトリウム安定化金ナノ粒子（3）（平均サイズ= 13 nm）を準備します。
    2. （10 nMの15 ml）をクエン酸で安定化した金ナノ粒子にTween 20を（1mMの1.5 ml）の水溶液を加えます。オービタルシェーカー上で20分間この溶液を振ります。
    3. DBCO基含有ポリエチレングリコールチオール（平均分子量= 5,000、100μM1.5 ml）の水溶液を加えます。オービタルシェーカー上で2時間のためのソリューションを振ります。
  2. DBCO基変性金ナノ粒子の精製
    1. 精製DBCO基修飾金ナノ粒子（4）</連続的な遠心分離（11,400×gで、15分×3）によって>強いです。
    2. 上清を除去し、金ナノ粒子ペレットの再懸濁のための純水を追加します。

4.銅系クリック反応を介したDBCO基修飾金ナノ粒子の放射性標識

  1. 125 I標識アジドを使用して、125 I標識した金ナノ粒子の合成（1）
    1. 遠心分離（11,400×gで、15分）を使用してDBCO基修飾金ナノ粒子の濃縮液を用意し、2μMに金ナノ粒子の濃度を調整します。
    2. （2μM、50μL）（4）金ナノ粒子の懸濁液にDMSO（5μL）に（1）125 I標識アジドの4.1 MBqのを追加します。
    3. 60分間40℃で得られた反応混合物をインキュベートします。
    4. 粗生成物からのアリコート（0.2μl）を撤回し、シリカ共にそれを適用します薄層クロマトグラフィー（TLC）プレートated。
    5. 移動相として酢酸エチルを使用して、TLCプレートを開発。
    6. 製造業者のプロトコルに従って（ 図3）放射性TLCスキャナーでTLCプレートを配置し、放射性標識反応を監視するためのスキャナを実行します。
  2. 粗生成物の精製
    1. 遠心分離（11,400×gで15分間）によって125 I標識された金ナノ粒子（4）を含む反応混合物を精製します。
    2. 上清を除去し、金ナノ粒子ペレットの再懸濁のための純水を追加します。
    3. 精製された生成物からのアリコート（0.2μl）を撤回し、シリカ被覆TLCプレート上にそれを適用します。
    4. 移動相として酢酸エチルを使用して、TLCプレートを開発。
    5. 放射性TLCスキャナーでTLCプレートを配置し、125 I標識ゴルの放射化学的収率および放射化学的純度を決定するためのスキャナを実行製造業者のプロトコルに従ってDナノ粒子（4）（ 図3）。

結果

スタンニル化前駆体（2）の放射性ヨウ素化反応は、放射性標識生成物を提供するために15分間室温で[125 I] NaIを、酢酸、及びクロラミンTの150 MBqのを使用して実施した（1）。粗混合物を分取HPLC精製後、所望の生成物は、放射化学的収率の75±10％（N = 8）を得ました。分析用HPLCは、125 I標識産物の放射化学的純度は99％以上（

ディスカッション

一般的に、精製された125 I標識アジド（1）の観察された放射化学収率は75±10％であった（n = 8）。放射性標識は、放射能の50から150 MBqので達成された、および放射化学的結果は非常に一貫しています。 [125 I] NaIを（T 1/2 = 59.4 d）の放射性ヨウ素化反応に使用した1ヶ月以上放射性崩壊を受け、1の放射化学的収率があることが観察された場...

開示事項

The authors have nothing to disclose.

謝辞

This work was supported by grants from the National Research Foundation of Korea, funded by the government of the Republic of Korea, (Grant nos. 2012M2B2B1055245 and 2012M2A2A6011335) and by the RI-Biomics Center of Korea Atomic Energy Research Institute.

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Chloramine T trihydrateSigma402869
[125I]NaI in aq. NaOHPerkin-ElmerNEZ033A010MC
Sodium metabisulfite SigmaS9000
Formic acidSigma251364
Sep-Pak tC18 plus cartridgeWatersWAT036800
Dimethyl sulfoxide SigmaD2650
AcetoneSigma650501
EthanolSigma459844
Gold(III) chloride trihydrateSigma520918
Tween 20 SigmaP1379
DBCO PEG SH (MW 5,000)NANOCSPG2-DBTH-5k
TLC silica gel 60 F254Merck
Analytical HPLCAgilent1290 InfinityModel number
Preparative HPLCAgilent1260 InfinityModel number
Analytical C18 reverse-phase columnAgilentZorbax Eclipse XDB-C18
Preparative C18 reverse-phase columnAgilentPrepHT XDB-C18
Radio TLC scannerBioscanAR-2000Model number
Radioisotope dose calibratorCapintec, IncCRC -25R dose calibratorModel number

参考文献

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