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요약

I 125 - 표지 지드의 합성 및 무도 클릭 반응을 이용 dibenzocyclooctyne (DBCO) - 기 - 컨쥬 게이트 13 나노 크기의 금 나노 입자의 방사성 표지에 대한 세부 절차를 설명한다.

초록

Here, we demonstrate a detailed protocol for the radiosynthesis of a 125I-labeled azide prosthetic group and its application to the efficient radiolabeling of DBCO-group-functionalized gold nanoparticles using a copper-free click reaction. Radioiodination of the stannylated precursor (2) was carried out by using [125I]NaI and chloramine T as an oxidant at room temperature for 15 min. After HPLC purification of the crude product, the purified 125I-labeled azide (1) was obtained with high radiochemical yield (75 ± 10%, n = 8) and excellent radiochemical purity (>99%). For the synthesis of radiolabeled 13-nm-sized gold nanoparticles, the DBCO-functionalized gold nanoparticles (3) were prepared by using a thiolated polyethylene glycol polymer. A copper-free click reaction between 1 and 3 gave the 125I-labeled gold nanoparticles (4) with more than 95% of radiochemical yield as determined by radio-thin-layer chromatography (radio-TLC). These results clearly indicate that the present radiolabeling method using a strain-promoted copper-free click reaction will be useful for the efficient and convenient radiolabeling of DBCO-group-containing nanomaterials.

서문

The strain-promoted copper-free click reaction between azides and cyclooctynes has been extensively applied to the efficient bioorthogonal labeling of a wide range of biomolecules, nanomaterials, and living subjects1-7. Due to the excellent site-specificity and rapid reaction rate of this conjugation reaction, it has also been used to synthesize radiolabeled tracers. A few 18F-labeled azide or DBCO prosthetic groups have been prepared for in vitro labeling of various cancers targeting peptides and antibodies, as well as for in vivo pre-targeted imaging of tumors8-13. In addition to these examples, the same conjugation reaction was applied to the metal-radioisotope-labeling of nanomaterials for positron emission tomography (PET) imaging studies14-16.

For several decades, radioactive iodines have been used for biomedical research and clinical trials through PET imaging (124I), single-photon emission computed tomography (SPECT) imaging (123I, 125I), and thyroid cancer treatment (131I)17-21. Therefore, an efficient method for radioactive iodine labeling is fundamentally important for various investigations, including molecular imaging studies, analysis of organ distribution of biomolecules, biomarker identification, and drug development. A copper-free click reaction strategy could be used in radioactive iodine labeling. However, this application has not been investigated as extensively as 18F-labeled biomolecules22-23. Here, we will provide a step-by-step protocol for the synthesis of an 125I-labeled azide for radiolabeling of DBCO-group-derived molecules. The procedures in the present report will include radioiodination of the stannylated precursor, purification steps with HPLC, and solid phase extraction. We also demonstrate efficient radiolabeling of DBCO-group-modified 13-nm-sized gold nanoparticles using the 125I-labeled azide. The detailed protocol in this report will help synthetic chemists understand a new radiolabeling methodology for the synthesis of radiolabeled products.

프로토콜

주의 : 방사성 요오드의 산화 된 형태가 매우 휘발성 적절한 리드 방패와 리드 유리 병 취급해야합니다. 모든 방사 단계는 통풍이 잘되는 숯을 여과 후드에서 수행 한 실험 절차는 방사능 검출 장치에 의해 모니터링해야한다.

I 125 - 표지 된 아 지드의 합성 화학 및 역상 카트리지 (1)의 제조

  1. 용액의 시약의 조제
    1. 150 μL의 아 지드 전구체 (2) 무수 에탄올 (그림 1)의 1 mg의 용해.
      참고 : 아 지드 전구체에 대한 자세한 합성 절차 (2) 이전의 종이 (22)에보고되었다.
    2. 1X 인산 완충 생리 식염수 (pH는 7.4) 20 μL를 1 mg을 클로라민 T를 녹인다.
    3. 20 μL의 H 2 O 2 mg의 나트륨 메타 비설 파이트를 녹여
  2. Prepara카트리지 기
    1. 10 ㎖의 H 2 O이어서 10 ㎖의 무수 에탄올로 TC18 카트리지 워시 공기와 카트리지의 행렬을 건조하지 마십시오.

125 I 표지 아 지드 보철 그룹의 2 Radiosynthesis

  1. 전구체의 방사성 요오드화 반응
    1. 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브에 지드 전구체 용액 및 아세트산 (10 μL) (무수 에탄올 150 ㎕의 1 mg)을 추가한다.
    2. 반응 혼합물에 0.1 M의 NaOH (50 μL)에 [125 I]의 NaI 150 MBq의 추가.
    3. 클로라민 T 용액 (1X 인산 완충 식염수 20 ㎕의 1 mg)을 첨가하고 튜브를 마이크로 원심 함유하는 반응 혼합물을 닫는다.
    4. 방사성 요오드화 반응이 완료 될 때까지 실온에서 15 분간 반응 혼합물을 인큐베이션.
    5. 반응 혼합물에 소듐 메타 바이 설 파이트 용액 (2 ㎎을 20 μL의 H 2 O)를 추가방사성 요오드화 반응을 해소합니다.
    6. 조 생성물을 0.2 μl를 인출 한 후 용액을 100 ㎕로 희석 (H 2 O / CH 3 CN, 1 : 1) HPLC 분석.
      참고 : 모든 HPLC 실험의 경우, H 2 O (용매 A)를 포함하는 0.1 % 포름산 및 이동상 0.1 % 포름산 함유 아세토 니트릴 (용매 B)를 사용합니다.
    7. 칼럼 상 반전 (역상 분석 무선-HPLC를 이용하여 희석하고, 조 생성물을 C18 분석; 유속 : 1 ml / 분 용리액 구배 : 0-2 분 동안 20 % 용매 B, 20 % ~ 80 % 용매 B에 대한 2-22 분, 22 ~ 23 분 80~100% 용매 B, 그리고 23-28 분 동안 100 % 용매 B, 체류 시간 : 16.4 분) (그림 2).
  2. 분취 HPLC로 조 생성물을 정제하여
    주 : 이러한 주입기, 컬럼, 검출기 수집 튜브 및 폐수 수집 된 컨테이너 HPLC 부품 주위에 충분한 납 차폐를 제공한다.
    1. 일 철수HPLC 바이알에 전체 반응 혼합물을 전자. 아세토 니트릴 (0.5 mL)로 반응 관을 씻어 동일한 주입 병에 린스를 추가합니다. H 2 O (1 mL)로 수집 된 용액을 희석.
    2. (조제 무선 HPLC 상에 주입하여 조 생성물을 C18 컬럼 상 역방향 유속 : 10 ㎖ / 분 용리액 구배 : 2-22 분 동안 0-2 분, 20 % ~ 80 % 용매 B 20 % 용매 B를 22 ~ 23 분 동안 80~100% 용매 B, 그리고 23-28 분 동안 100 % 용매 B).
    3. I 125 - 표지 지드 (1)를 나타내는 피크 방사능 수집을 유리 시험관에 (도 2) (이들의 HPLC 조건에서의 t R은 17.8-18.8 분이다).
    4. 제조사의 프로토콜에 따라 방사선 도즈 교정기를 사용하여 분획의 방사 화학적 수율을 측정한다.
    5. 제품의 방사 화학적 순도를 결정하기위한 동일한 HPLC 조건을 사용하여 분석 무선 HPLC로 정제 된 생성물을 주입한다.
  3. 제품의 고체상 추출
    1. 40ml의 순수 H 2 O로 원하는 생성물 (1)을 포함하는 분획을 희석
    2. 컨디셔닝 TC18 카트리지에 희석액을 추가합니다.
    3. 추가로 15 ML의 H 2 O와 카트리지를 세척
    4. 리드 방패에 의해 보호되는 10 ml의 유리 바이알에 2 ㎖의 아세톤으로 카트리지에 갇혀 제품 (1) 용출. 제조사의 프로토콜에 따라 방사선 도즈 교정을 사용하여 용출 된 생성물의 방사능을 측정한다.
      주 : 디메틸 설폭 사이드 (DMSO) 또는 무수 에탄올 또한 카트리지로부터의 생성물의 용출을 위해 사용될 수있다. 방사능의 약 5-10 %는 보통 카트리지 스틱, 남은 방사선 표지 생성물은 완전히 유기 용매의 과잉을 사용하여 용출 될 수 없다.
    5. 질소 또는 아르곤 가스의 흐름과 함께 아세톤을 증발시켰다.
    6. 재를 녹여다음 방사성 표지 단계에 대한 DMSO (100-200 μL)와 sidue.

DBCO 기 - 금 나노 입자 컨쥬 게이트 (3)의 합성

  1. 13 나노 크기의 금 표면 변형 DBCO 기 함유 폴리에틸렌 글리콜 나노 입자
    1. 준비 나트륨 구연산 안정화 된 금 나노 입자 (3) (평균 크기 = 13 ㎚) 이전의 보고서 (24)에 따라.
    2. (10 nM 내지 15 mL) 중 시트 레이트 - 안정화 된 금 나노 입자에 트윈 20 (1 ㎜, 1.5 ㎖)의 수용액을 추가한다. 궤도 통에 20 분의 솔루션을 흔들어.
    3. DBCO 기 함유 폴리에틸렌 글리콜 티올 (평균 분자량 = 5,000, 100 μM, 1.5 ㎖)의 수용액을 추가한다. 오비탈 진탕 기에서 2 시간 동안 용액을 흔들어.
  2. DBCO 그룹 - 개질 된 금 나노 입자의 정제
    1. 정제 DBCO 그룹 - 개질 된 금 나노 입자 (4) </ 연속 원심 분리 (11,400 XG, 15 분 × 3)로> 강한.
    2. 뜨는을 가만히 따르다 및 금 나노 입자 펠릿의 재 부유 순수을 추가합니다.

4. 구리 무료 클릭 반응을 통해 DBCO - 그룹 - 개질 된 금 나노 입자의 방사성 표지

  1. I 125 - 표지 된 아 지드를 사용하여 125 I 표지 된 금 나노 입자의 합성 (1)
    1. 원심 분리 (11,400 × g으로 15 분간)을 사용하여 DBCO 그룹 - 개질 된 금 나노 입자의 농축 용액을 제조하고, 2 μM로 금 나노 입자의 농도를 조절한다.
    2. 금 나노 입자의 현탁액을 DMSO (5 μL)의 125I 표지 지드 (1) 4.1 MBq의 추가 (4) (2 μM, 50 μL).
    3. 60 분 동안 40 ° C에서 얻어진 반응 혼합물을 인큐베이션.
    4. 조 생성물로부터 분취 량 (0.2 μL)를 인출하고, 실리카 - 코에 적용ated 박층 크로마토 그래피 (TLC) 판.
    5. 이동상으로서 에틸 아세테이트를 사용하여 TLC 판을 개발한다.
    6. 전파 TLC 스캐너의 TLC 플레이트를 배치하고, 제조자의 프로토콜에 따라 방사성 표지 반응 (도 3)을 감시하는 스캐너를 실행.
  2. 조 생성물을 정제하여
    1. 원심 분리하여 125 I 표지 된 금 나노 입자 (4) (11,400 × g으로 15 분간)를 포함하는 반응 혼합물을 정제 하였다.
    2. 뜨는을 가만히 따르다 및 금 나노 입자 펠릿의 재 부유 순수을 추가합니다.
    3. 정제 된 제품에서 나누어지는 (0.2 μl를) 철회 및 실리카 코팅 된 TLC 판에 적용합니다.
    4. 이동상으로서 에틸 아세테이트를 사용하여 TLC 판을 개발한다.
    5. 무선-TLC 스캐너에 TLC 판을 놓고 125I 표지 GOL의 방사 화학적 수율 및 방사 화학적 순도를 결정하기 위해 스캐너를 실행제조 업체의 프로토콜에 따라 D 나노 입자 (4) (그림 3).

결과

stannylated 전구체 (2)의 방사성 요오드화 반응은 방사능 표지 된 생성물을 제공하기 위해 실온에서 15 분 동안 [125 I] NaI를 아세트산 및 클로라민 T 150 MBq의를 사용하여 수행 하였다 (1). 조 혼합물을 예비 HPLC 정제 후, 목적 생성물을 방사 화학적 수율은 75 ± 10 % (N = 8)을 얻었다. HPLC 분석은 125 I 표지 된 생성물의 방사 화학적 순도는 99 %...

토론

일반적으로, 정제 된 I-125 표지 지드 (1)의 관찰 방사 화학적 수율은 75 ± 10 %이었다 (N = 8). 방사성 표지는 방사능 MBq의 50-150로 수행하고, 그 결과 방사 상당히 일치한다. [125 I]의 NaI (t 1/2 = 59.4 d) 방사성 요오드화 반응에 사용 하였다 개월 이상 방사성 붕괴를 시행 한의 방사 화학적 수율로 관찰하면 약간 (53~65%) 감소 하였다. 따라서, [125

공개

The authors have nothing to disclose.

감사의 말

This work was supported by grants from the National Research Foundation of Korea, funded by the government of the Republic of Korea, (Grant nos. 2012M2B2B1055245 and 2012M2A2A6011335) and by the RI-Biomics Center of Korea Atomic Energy Research Institute.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Chloramine T trihydrateSigma402869
[125I]NaI in aq. NaOHPerkin-ElmerNEZ033A010MC
Sodium metabisulfite SigmaS9000
Formic acidSigma251364
Sep-Pak tC18 plus cartridgeWatersWAT036800
Dimethyl sulfoxide SigmaD2650
AcetoneSigma650501
EthanolSigma459844
Gold(III) chloride trihydrateSigma520918
Tween 20 SigmaP1379
DBCO PEG SH (MW 5,000)NANOCSPG2-DBTH-5k
TLC silica gel 60 F254Merck
Analytical HPLCAgilent1290 InfinityModel number
Preparative HPLCAgilent1260 InfinityModel number
Analytical C18 reverse-phase columnAgilentZorbax Eclipse XDB-C18
Preparative C18 reverse-phase columnAgilentPrepHT XDB-C18
Radio TLC scannerBioscanAR-2000Model number
Radioisotope dose calibratorCapintec, IncCRC -25R dose calibratorModel number

참고문헌

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