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  • Reimpressões e Permissões

Resumo

Um procedimento pormenorizado para a síntese de uma azida marcado com 125I e a radiomarcação de dibenzocyclooctyne (DBCO) -Grupo-conjugados, nanopartículas de ouro de 13 nm de tamanho, utilizando uma reacção de clique sem cobre é descrito.

Resumo

Here, we demonstrate a detailed protocol for the radiosynthesis of a 125I-labeled azide prosthetic group and its application to the efficient radiolabeling of DBCO-group-functionalized gold nanoparticles using a copper-free click reaction. Radioiodination of the stannylated precursor (2) was carried out by using [125I]NaI and chloramine T as an oxidant at room temperature for 15 min. After HPLC purification of the crude product, the purified 125I-labeled azide (1) was obtained with high radiochemical yield (75 ± 10%, n = 8) and excellent radiochemical purity (>99%). For the synthesis of radiolabeled 13-nm-sized gold nanoparticles, the DBCO-functionalized gold nanoparticles (3) were prepared by using a thiolated polyethylene glycol polymer. A copper-free click reaction between 1 and 3 gave the 125I-labeled gold nanoparticles (4) with more than 95% of radiochemical yield as determined by radio-thin-layer chromatography (radio-TLC). These results clearly indicate that the present radiolabeling method using a strain-promoted copper-free click reaction will be useful for the efficient and convenient radiolabeling of DBCO-group-containing nanomaterials.

Introdução

The strain-promoted copper-free click reaction between azides and cyclooctynes has been extensively applied to the efficient bioorthogonal labeling of a wide range of biomolecules, nanomaterials, and living subjects1-7. Due to the excellent site-specificity and rapid reaction rate of this conjugation reaction, it has also been used to synthesize radiolabeled tracers. A few 18F-labeled azide or DBCO prosthetic groups have been prepared for in vitro labeling of various cancers targeting peptides and antibodies, as well as for in vivo pre-targeted imaging of tumors8-13. In addition to these examples, the same conjugation reaction was applied to the metal-radioisotope-labeling of nanomaterials for positron emission tomography (PET) imaging studies14-16.

For several decades, radioactive iodines have been used for biomedical research and clinical trials through PET imaging (124I), single-photon emission computed tomography (SPECT) imaging (123I, 125I), and thyroid cancer treatment (131I)17-21. Therefore, an efficient method for radioactive iodine labeling is fundamentally important for various investigations, including molecular imaging studies, analysis of organ distribution of biomolecules, biomarker identification, and drug development. A copper-free click reaction strategy could be used in radioactive iodine labeling. However, this application has not been investigated as extensively as 18F-labeled biomolecules22-23. Here, we will provide a step-by-step protocol for the synthesis of an 125I-labeled azide for radiolabeling of DBCO-group-derived molecules. The procedures in the present report will include radioiodination of the stannylated precursor, purification steps with HPLC, and solid phase extraction. We also demonstrate efficient radiolabeling of DBCO-group-modified 13-nm-sized gold nanoparticles using the 125I-labeled azide. The detailed protocol in this report will help synthetic chemists understand a new radiolabeling methodology for the synthesis of radiolabeled products.

Protocolo

Cuidado: A forma oxidada de iodo radioativo é bastante volátil e devem ser manuseados com escudos de chumbo adequados e frascos de chumbo. Todos os passos radioquímica deve ser levada a cabo em uma capa filtrou-carvão bem ventilado, e os procedimentos experimentais devem ser monitorizadas por meio de dispositivos de detecção de radioactividade.

1. Preparação dos produtos químicos e o cartucho de fase reversa para a síntese da azida 125 I-rotulados

  1. Preparação de reagentes em solução
    1. Dissolve-se 1 mg de azida do precursor (2) em 150 ul de etanol absoluto (Figura 1).
      NOTA: Um procedimento sintético detalhado para o precursor azida (2) foi relatada em estudo anterior 22.
    2. Dissolve-se 1 mg de cloramina T em 20 ul de 1x tampão salino de fosfato (pH = 7,4).
    3. Dissolve-se 2 mg de metabissulfito de sódio em 20 mL de H 2 O.
  2. Preparação do cartucho
    1. Lavar o cartucho de TC18 com 10 ml de etanol absoluto seguida por 10 ml de H 2 O. Não se secar a matriz de o cartucho com ar.

2. radioss�tese do protético grupo azida marcada com 125I

  1. Radioiodação reacção do precursor
    1. Adicionar a solução precursora de azida (1 mg em 150 ul de etanol absoluto) e ácido acético (10 ul) para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
    2. Adicionar 150 MBq de [125I] NaI em NaOH 0,1 M (50 mL) à mistura de reacção.
    3. Adicionar uma solução de cloramina T (1 mg em 20 ul de 1x tampão de fosfato salino) e fechar-se a mistura de reacção tubo de microcentrífuga contendo.
    4. Incubar a mistura de reacção à temperatura ambiente durante 15 min, até que a reacção é completada a radioiodinação.
    5. Adicionar uma solução de metabissulfito de sódio (2 mg em 20 ul de H2O) à mistura reaccionalpara extinguir a reação radioiodação.
    6. Retirar 0,2 mL do produto em bruto e depois dilui-se com 100 ul de solução (H 2 O / CH 3 CN, 1: 1) para análise por HPLC.
      NOTA: Para todas as experiências de HPLC, utilizar 0,1% de ácido fórmico contendo H2O (solvente A) e 0,1% de ácido fórmico contendo acetonitrilo (solvente B) como eluentes.
    7. Analisar o produto em bruto diluído usando um de fase inversa analítica rádio-HPLC (C18 de fase reversa; taxa de fluxo: 1 ml / min; gradiente de eluente: 20% de solvente B durante 0-2 min, 20-80% de solvente B durante 2-22 minutos, 80-100% de solvente B durante 22-23 min, e 100% de solvente B durante 23-28 min; tempo de retenção: 16,4 min) (Figura 2).
  2. A purificação do produto em bruto com uma HPLC preparativa
    NOTA: Fornecer suficiente blindagem de chumbo em torno de partes de HPLC tal como o injector, coluna, detector, frasquinhos de colheita, e o recipiente no qual o efluente é recolhido.
    1. retirar thum e todo mistura reaccional para dentro de um frasco de HPLC. Lavar o tubo de reacção com acetonitrilo (0,5 mL) e adicionar a água de lavagem para o mesmo frasco de injecção. Dilui-se a solução recolhida com H 2 O (1 mL).
    2. Injectar o produto em bruto para um rádio-preparativa de HPLC (coluna C18 de fase inversa; caudal: 10 ml / min; gradiente de eluente: 20% de solvente B durante 0-2 min, 20-80% de solvente B durante 2-22 min, 80-100% de solvente B durante 22-23 min, e 100% de solvente B durante 23-28 min).
    3. Recolhe-se o pico que representa a azida radioactivos 125I-marcado (1) (tR sob estas condições de HPLC é 17,8-18,8 min) num tubo de ensaio de vidro (Figura 2).
    4. Medir o rendimento radioquímico da fracção utilizando um calibrador de doses de radioactividade de acordo com o protocolo do fabricante.
    5. Injectar o produto purificado sobre um rádio-HPLC analítica usando as mesmas condições de HPLC para determinar a pureza radioquímica do produto.
  3. Extracção em fase sólida do produto
    1. Dilui-se a fracção que contém o produto desejado (1) com 40 ml de H2O puro
    2. Adicionar a solução diluída em um cartucho de TC18 pré-condicionados.
    3. Lavar o cartucho com um adicional de 15 ml de H 2 O.
    4. Elui-se o produto (1) preso no cartucho com 2 ml de acetona para um frasco de vidro de 10 ml, que é protegido por um escudo de chumbo. Medir a radioactividade do produto eluído utilizando um calibrador de doses de radioactividade de acordo com o protocolo do fabricante.
      NOTA: Dimetil sulfóxido (DMSO) ou etanol absoluto, também pode ser usado para eluição do produto a partir do cartucho. Cerca de 5-10% da radioactividade normalmente adere ao cartucho, e o produto marcado radioactivamente restante não pode ser totalmente fluido utilizando quantidades em excesso de solvente orgânico.
    5. Evapora-se a acetona, com uma corrente de azoto ou árgon gasoso.
    6. Dissolve-se o residue com DMSO (100-200 uL) para o próximo passo de radiomarcação.

3. Síntese de DBCO-grupo conjugado Nanopartículas de Ouro

  1. Modificação da superfície de ouro de 13 nm de tamanho nanopartículas com DBCO contendo grupo polietilenoglicol
    1. Prepare-de sódio estabilizado citrato de nanopartículas de ouro (3) (média size = 13 nm) de acordo com um relatório anterior 24.
    2. Adicionar uma solução aquosa de Tween 20 (1 mM, 1,5 mL) às nanoparticulas de ouro estabilizadas-citrato (10 nM, 15 ml). Agitar a solução durante 20 min num agitador orbital.
    3. Adicionar uma solução aquosa de DBCO contendo-grupo tiol polietileno glicol (peso molecular médio = 5000, 100 ^ M, 1,5 ml). Agitar a solução durante 2 h num agitador orbital.
  2. A purificação das nanopartículas de ouro DBCO-modificado com grupo
    1. Purificar o nanopartículas de ouro DBCO-modified-grupo (4) </ Strong> por centrifugação sucessiva (11.400 xg, 15 min x 3).
    2. Decantar o sobrenadante e adicionar água pura para a ressuspensão das peletes de nanopartulas de ouro.

4. A marcação radioactiva de DBCO-modified-grupo do ouro nanopartículas através do livre-Cobre Clique Reaction

  1. Síntese de nanopartículas de ouro 125 marcado com I utilizando a azida de 125I-marcado (1)
    1. Prepara-se uma solução concentrada de nanopartículas de ouro DBCO-modificado com grupo usando centrifugação (11400 xg, 15 min), e ajustar a concentração das nanopartículas de ouro de 2 uM.
    2. Adicionar 4,1 MBq de azida marcada com 125 I (1) em DMSO (5 ul) a uma suspensão de nanopartículas de ouro (4) (2 ^ M, 50 ul).
    3. Incubar a mistura de reacção resultante a 40 ° C durante 60 min.
    4. Retirar uma aliquota (0,2 pi) do produto em bruto e aplicá-lo sobre um gel co-cromatografia em camada fina ated (TLC) placa.
    5. Desenvolver a placa de TLC, utilizando acetato de etilo como a fase móvel.
    6. Colocar a placa de TLC em um scanner de rádio-TLC e executar o scanner para monitorizar a reacção de marcação radioactiva (Figura 3) de acordo com o protocolo do fabricante.
  2. A purificação do produto em bruto
    1. Purifica-se a mistura de reacção contendo os 125 marcado com I nanopartículas de ouro (4) por centrifugação (11400 xg, 15 min).
    2. Decantar o sobrenadante e adicionar água pura para a ressuspensão das peletes de nanopartulas de ouro.
    3. Retirar uma aliquota (0,2 pi) do produto purificado e aplicá-lo sobre uma placa de CCF de sílica-revestido.
    4. Desenvolver a placa de TLC, utilizando acetato de etilo como a fase móvel.
    5. Colocar a placa de TLC em um scanner de rádio-TLC e executar a análise para determinar o rendimento radioquímico e pureza radioquímica do gol 125 marcado com ID (4) nanopartículas (Figura 3) de acordo com o protocolo do fabricante.

Resultados

A reacção de radioiodação do precursor estanilado (2) foi realizado utilizando 150 MBq de [125I] NaI, ácido acético, e cloramina T à temperatura ambiente durante 15 min para proporcionar o produto marcado radioactivamente (1). Depois de purificação por HPLC preparativa da mistura em bruto, o produto desejado foi obtido com 75 ± 10% (n = 8) de rendimento radioquímico. HPLC analica revelou que a pureza radioquímica do produto marcado...

Discussão

Em geral, o rendimento radioquímico observada da azida 125 purificada marcada com I (1) foi de 75 ± 10% (n = 8). A marcação radioactiva foi feita com 50-150 MBq de radioactividade, e os resultados são bastante consistente radioquímica. Se [125I] NaI (T 1/2 = 59,4 d) que foram submetidos a decaimento radioactivo durante mais de um mês foi utilizado na reacção de radioiodação, observou-se o rendimento radioquímico de 1 a ser ligeiramen...

Divulgações

The authors have nothing to disclose.

Agradecimentos

This work was supported by grants from the National Research Foundation of Korea, funded by the government of the Republic of Korea, (Grant nos. 2012M2B2B1055245 and 2012M2A2A6011335) and by the RI-Biomics Center of Korea Atomic Energy Research Institute.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Chloramine T trihydrateSigma402869
[125I]NaI in aq. NaOHPerkin-ElmerNEZ033A010MC
Sodium metabisulfite SigmaS9000
Formic acidSigma251364
Sep-Pak tC18 plus cartridgeWatersWAT036800
Dimethyl sulfoxide SigmaD2650
AcetoneSigma650501
EthanolSigma459844
Gold(III) chloride trihydrateSigma520918
Tween 20 SigmaP1379
DBCO PEG SH (MW 5,000)NANOCSPG2-DBTH-5k
TLC silica gel 60 F254Merck
Analytical HPLCAgilent1290 InfinityModel number
Preparative HPLCAgilent1260 InfinityModel number
Analytical C18 reverse-phase columnAgilentZorbax Eclipse XDB-C18
Preparative C18 reverse-phase columnAgilentPrepHT XDB-C18
Radio TLC scannerBioscanAR-2000Model number
Radioisotope dose calibratorCapintec, IncCRC -25R dose calibratorModel number

Referências

  1. Jewett, J. C., Bertozzi, C. R. Cu-free Click Cycloaddition Reactions in Chemical Biology. Chem. Soc. Rev. 39, 1272-1279 (2010).
  2. Debets, M. F., et al. Bioconjugation with Strained Alkenes and Alkyne. Acc. Chem. Res. 44, 805-815 (2011).
  3. Sletten, E. M., Bertozzi, C. R. From Mechanism to Mouse: A Tale of Two Bioorthogonal Reactions. Acc. Chem. Res. 44, 666-676 (2011).
  4. Koo, H., et al. Bioorthogonal Cu-Free Click Chemistry in vivo for Tumor-Targeted Delivery of Nanoparticles. Angew. Chem. Int. Ed. 51, 11836-11840 (2012).
  5. Chang, P. V., et al. Copper-Free Click Chemistry in Living Animals. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 1821-1826 (2010).
  6. Bostic, H. E., Smith, M. D., Poloukhtine, A. A., Popik, V. V., Best, M. D. Membrane Labeling and Immobilization via copper-free Click Chemistry. Chem. Commun. 48, 1431-1433 (2012).
  7. Someya, T., Ando, A., Kimoto, M., Hirao, I. Site-Specific Labeling of RNA by Combining Genetic Alphabet Expansion Transcription and Copper-Free Click Chemistry. Nucl. Acids Res. 43, 6665-6676 (2015).
  8. Lee, S. B., et al. Mesoporous Silica Nanoparticle Pretargeting for PET Imaging Based on a Rapid Bioorthogonal Reaction in a Living Body. Angew. Chem. Int. Ed. 52, 10549-10552 (2013).
  9. Sachin, K., et al. F-18 Labeling Protocol of Peptides Based on Chemically Orthogonal Strain-Promoted Cycloaddition under Physiologically Friendly Reaction Conditions. Bioconjugate Chem. 23, 1680-1686 (2012).
  10. Evans, H. L., et al. Copper-Free Click - A Promising Tool for Pre-targeted PET Imaging. Chem. Commun. 48, 991-993 (2012).
  11. Campbell-Verduyn, L. S., et al. Strain-Promoted Copper-Free "Click" Chemistry for 18F Radiolabeling of Bombesin. Angew. Chem. Int. Ed. 50, 11117-11120 (2011).
  12. Arumugam, S., Chin, J., Schirrmacher, R., Popik, V. V., Kostikov, A. P. 18F]Azadibenzocyclooctyne ([18F]ADIBO): A Biocompatible Radioactive Labeling Synthon for Peptides using Catalyst Free [3+2] Cycloaddition. Bioorg. Med. Chem. Lett. 21, 6987-6991 (2011).
  13. Bouvet, V., Wuest, M., Wuest, F. Copper-Free Click Chemistry with the Short-Lived Positron Emitter Fluorine-18. Org. Biomol. Chem. 9, 7393-7399 (2011).
  14. Satpati, D., Bauer, N., Hausner, S. H., Sutcliffe, J. L. Synthesis of [64Cu]DOTA-ADIBON3-Ala-PEG28-A20FMDV2 via Copper-Free Click Chemistry for PET Imaging of Integrin αvβ6. J. Radioanal. Nucl. Chem. 302, 765-771 (2014).
  15. Lee, D. E., et al. Facile Method To Radiolabel Glycol Chitosan Nanoparticles with 64Cu via Copper-Free Click Chemistry for MicroPET Imaging. Mol. Pharmaceutics. 10, 2190-2198 (2013).
  16. Zeng, D. 64Cu Core-Labeled Nanoparticles with High Specific Activity via Metal-Free Click Chemistry. ACS Nano. 6, 5209-5219 (2012).
  17. Jeon, J., et al. Radiosynthesis and in vivo Evaluation of [125I]2-4(iodophenethyl)-2-Methylmalonic Acid as a Potential Radiotracer for Detection of Apoptosis. J. Radioanal. Nucl. Chem. 308, 23-29 (2016).
  18. Adam, M. J., Wilbur, D. S. Radiohalogens for Imaging and Therapy. Chem. Soc. Rev. 34, 153-163 (2005).
  19. Jeon, J., et al. Radiosynthesis of 123I-Labeld Hesperetin for Biodistribution Study of Orally Administered Hesperetin. J. Radioanal. Nucl. Chem. 306, 437-443 (2015).
  20. Kil, K. E., et al. Development of [123I]IPEB and [123I]IMPEB as SPECT Radioligands for Metabotropic Glutamate Receptor Subtype. ACS Med. Chem. Lett. 5, 652-656 (2014).
  21. Chen, M. K., et al. The Utility of I-123 Pretherapy Scan in I-131 Radioiodine Therapy for Thyroid Cancer. Thyroid. 22, 304-309 (2012).
  22. Jeon, J., et al. Efficient Method for Iodine Radioisotope Labeling of Cyclooctyne-Containing Molecules using Strain-Promoted Copper-Free Click Reaction. Bioorg. Med. Chem. 23, 3303-3308 (2015).
  23. Choi, M. H., et al. Synthesis and Evaluation of an 125I-Labeled Azide Prosthetic Group for Efficient and Bioorthogonal Radiolabeling of Cyclooctyne-Group Containing Molecules using Copper-Free Click Reaction. Bioorg. Med. Chem. Lett. 26, 875-878 (2016).
  24. Kim, Y. H., et al. Tumor Targeting and Imaging Using Cyclic RGD-PEGylated Gold Nanoparticle Probes with Directly Conjugated Iodine-125. Small. 7, 2052-2060 (2011).

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