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要約

Systemic and localized zebrafish infection models for human influenza A virus are demonstrated. Using a systemic infection model, zebrafish can be used to screen antiviral drugs. Using a localized infection model, zebrafish can be used to characterize host immune cell responses.

要約

Each year, seasonal influenza outbreaks profoundly affect societies worldwide. In spite of global efforts, influenza remains an intractable healthcare burden. The principle strategy to curtail infections is yearly vaccination. In individuals who have contracted influenza, antiviral drugs can mitigate symptoms. There is a clear and unmet need to develop alternative strategies to combat influenza. Several animal models have been created to model host-influenza interactions. Here, protocols for generating zebrafish models for systemic and localized human influenza A virus (IAV) infection are described. Using a systemic IAV infection model, small molecules with potential antiviral activity can be screened. As a proof-of-principle, a protocol that demonstrates the efficacy of the antiviral drug Zanamivir in IAV-infected zebrafish is described. It shows how disease phenotypes can be quantified to score the relative efficacy of potential antivirals in IAV-infected zebrafish. In recent years, there has been increased appreciation for the critical role neutrophils play in the human host response to influenza infection. The zebrafish has proven to be an indispensable model for the study of neutrophil biology, with direct impacts on human medicine. A protocol to generate a localized IAV infection in the Tg(mpx:mCherry) zebrafish line to study neutrophil biology in the context of a localized viral infection is described. Neutrophil recruitment to localized infection sites provides an additional quantifiable phenotype for assessing experimental manipulations that may have therapeutic applications. Both zebrafish protocols described faithfully recapitulate aspects of human IAV infection. The zebrafish model possesses numerous inherent advantages, including high fecundity, optical clarity, amenability to drug screening, and availability of transgenic lines, including those in which immune cells such as neutrophils are labeled with fluorescent proteins. The protocols detailed here exploit these advantages and have the potential to reveal critical insights into host-IAV interactions that may ultimately translate into the clinic.

概要

世界保健機関（WHO）によると、インフルエンザウイルスは大人5〜10％であり、毎年子どもたちの20から30までパーセントに感染し、重症の3〜5000000例の原因となり、世界中の1 50万人が死亡。インフルエンザに対する毎年のワクチン接種は、病気を防ぐための最良の選択肢のまま。 WHOグローバル・アクションプランのような取り組みは、季節性インフルエンザの流行2に関連する罹患率および死亡率を減少させるために、季節性ワクチンの使用、ワクチン生産能力、そしてより強力なワクチン戦略の研究開発が増加しています。ノイラミニダーゼ阻害剤（ 例えばザナミビルおよびオセルタミビル）のような抗ウイルス薬は、一部の国で利用可能であり、発症3、4、5の最初の48時間以内に投与された場合、症状を緩和するのに有効であることが証明されています。グローバルな努力にもかかわらず、季節性インフルエンザの封じ込めのouインフルエンザウイルス抗原ドリフトは、多くの場合、ウイルス6の変化ゲノムに適応するために、現在の能力を超えるようtbreaksは、この時点では手ごわい課題です。ウイルスの新たな株を標的とワクチン戦略は、事前に開発されなければならない、時にはにより、最終的にインフルエンザシーズンに優勢株の種類が予期せぬ変化に最適に効果的な未満レンダリングされます。これらの理由から、感染症を含み、死亡率を減少させるための代替的な治療戦略を開発する明確な必要性が存在します。宿主-ウイルス相互作用の理解を達成することにより、新しい抗インフルエンザ薬およびアジュバント療法7,8を開発することが可能です。

ヒト宿主-インフルエンザウイルス（IAV）の相互作用は複雑です。ヒトIAV感染のいくつかの動物モデルがINCLUD、宿主 - ウイルス相互作用への洞察を得るために開発されていますマウス、モルモット、コットンラット、ハムスター、フェレット、およびマカク9る。ホスト-IAVダイナミクスの理解を高めてきた重要なデータを提供しながら、各モデル生物は、ヒトの医療に調査結果を翻訳しようとしたときに考慮しなければならない重大な欠点を有しています。ヒトインフルエンザが9を分離に感染したとき例えば、最も広く使用されているモデルであるマウスは、容易にIAV誘発性感染症の症状を発症しません。マウスは、マウスの上皮細胞ではなくヒト上皮細胞10上で発現α-2,6シアル酸結合のα-2,3シアル酸結合を発現するので、ヒトインフルエンザ自然向性単離物欠いているためです。人間IAVに存在する赤血球凝集素タンパク質は、好意的受容体媒介性エンドサイトーシス9、11を介してα-2,6シアル酸結合を保有する宿主細胞に結合し、入力して隔離します12、13>まで。その結果、現在ではヒトインフルエンザのためのマウスモデルを開発中で、ケアは、人間の病気の側面を再現疾患の表現型を達成するために、インフルエンザの適切な株とマウスの適切な歪みをペアリングするために注意しなければならないことが認められています。対照的に、フェレットの上気道上皮細胞は、ヒト細胞14に似ているα-2,6シアル酸結合を有します。感染したフェレットは、ヒトおよび鳥インフルエンザウイルス14、15の病原性と伝達率などのヒト疾患において観察された病理学的および臨床的特徴の多くを共有しています。彼らはまた、ワクチンの有効性試験に非常に適しています。それにもかかわらず、ヒトインフルエンザのためのフェレットモデルは、統計的にsignifiの取得を行い、主にそのサイズと畜産のコストに関連するいくつかの欠点があります挑戦カントデータ。また、フェレットは、以前のテストの有効性を困難にする薬剤の薬物動態、生物学的利用能、および毒性の違いを表示しています。例えば、フェレットはM2イオンチャネル阻害剤、アマンタジン16に毒性を示します。したがって、人間IAV感染症についての質問を研究するための動物モデルを選択する際に、その固有の利点と限界、および調査中であるホストウイルスの相互作用の側面を考慮することが重要であることは明らかです。

ゼブラフィッシュ、 ゼブラフィッシュ 、微生物感染を調査するためのユニークな機会を提供する動物モデルである、免疫応答をホストし、そして潜在的な薬物療法17、18、19、20、21、22、23、<SUPクラス= "外部参照"> 24、25、26、27、28。ゼブラフィッシュの細胞の表面上のα-2,6結合したシアル酸の存在は、感染研究で裏付けとIAV 19の蛍光レポーター株を用いてin vivoで画像化したIAV、への感受性を示唆しました。 IAV感染ゼブラフィッシュでは、抗ウイルスifnphi1とMXA転写産物の発現増加は、先天性免疫応答が刺激されたことを示し、および浮腫および組織破壊を含むIAV感染ゼブラフィッシュ、で表示される病変は、ヒトインフルエンザ感染で観察されたものと同様でした。また、IAV抗ウイルスノイラミニダーゼ阻害剤ザナミビル限られた死亡率およびゼブラフィッシュ19で減少ウイルス複製。

この報告書では、システムを開始するためのプロトコルゼブラフィッシュ胚におけるIC IAV感染について説明します。プルーフの原理として臨床的に関連する用量でザナミビルを使用して、抗ウイルス活性について化合物をスクリーニングするためのこのゼブラフィッシュIAV感染モデルの有用性が実証されます。さらに、ゼブラフィッシュ浮き袋、解剖学的に哺乳動物の肺21に機能的に類似であると考えられている臓器、29、30、31に局在し、上皮IAV感染を発生するためのプロトコルは、記載されています。この局所的なIAV感染モデルを用いて、感染部位への好中球動員は、IAV感染および炎症における好中球生物学の役割の調査を可能に追跡することができます。これらのゼブラフィッシュモデルは、ヒトIAV感染の既存の動物モデルを補完し、小分子およびので増強の可能性の免疫細胞応答を試験するために特に有用ですtatisticalパワー、ハイスループットアッセイに中程度の能力、および光顕微鏡での免疫細胞の挙動と機能を追跡する能力。

プロトコル

すべての作業は、バイオセーフティーレベル2（またはBSL2）米国疾病管理センターによって記述規格（CDC）を使用して実施し、施設内動物管理使用委員会（IACUC）によって確立された指令に基づくべきです。安全性とコンプライアンスを確保するため、適当な当局と協議してください。

1.ゼブラフィッシュの手入れとメンテナンス

  1. ゼブラフィッシュをスポーンし、実験のための胚の必要な数を収集します。 Adatto らによって記載されたもののような、必要な場合、大量飼育タンク。 図32は 、発育ステージの胚の多数を収集するために使用することができます。
  2. 胚は低密度で深いペトリ皿中の所望の発達段階（ローカライズされた、泳ぐ膀胱感染の全身IAV感染[セクション3]または5日後に受精のための48時間後に受精[セクション4]）（まで発展することを許可します< 6を含む滅菌卵の水に28℃での100の胚/皿）蒸留水で0 / mlの海の塩（ 例えば 、インスタントオーシャン）。
    1. プラスチック製のトランスファーピペットで死んだ胚を削除し、最適な健康と発展を確保するために毎日卵水を変更します。

材料および試薬の調製

  1. 蒸留水とオートクレーブ中で（7.0から7.4にpHを調整）トリカイン-Sの4 mg / mlでストック溶液を準備します。 4℃で保存。
  2. マイクロピペットプラー使用してフィラメントとホウケイ酸ガラスキャピラリーを引いて（以下の設定で例えばマイクロピペットプラーを：圧力設定= 100、熱= 550を引っ張る= [値なし]、速度= 130、時間= 110）。
    注：前に針をトリミングに、針は、針の先端にテーパーし始めるところからの長さは約12〜15ミリメートルであろう。これは、好みや用途に基づいて、しかしながら、変化することができます。長く、より緩やかなテーパーが原因胚を貫通する能力の増加と減少里のより好ましいかもしれません針曲げや折れのSK。
  3. マイクロ波を用いて100 mLの卵水にアガロース2gのメルト。深いペトリ皿にアガロース溶融注ぎ、それを固化させることにより、ラインアップや胚を注入する上でプレートを作成します。
  4. ヌクレアーゼフリー水にザナミビルの10 mg / mlでストックしてください。 -20℃で小分けし、凍結。
  5. 胚取り付けアガロースを作るためにマイクロ波を使用して50ミリリットル卵水に0.5グラムのアガロースを溶かします。撮像時に使用する直前まで50℃の水浴中で維持します。

3.全身IAV感染症（48時間後に受精）

注意：すべての研究員がIAVで作業を開始する前にワクチン接種に関する上司や医師に相談してください。

  1. ＃5鉗子を用いた実験の日に手動dechorionate胚。 200 / mlのトリカイン溶液中のプロセスで負傷された胚を削除し、安楽死させるように注意してください。
  2. 準備OマイクロインジェクションのためのF IAV
    注：ゼブラフィッシュ胚に感染することが示されている株は、インフルエンザA / PR / 8/34（H1N1）（APR8）、インフルエンザA X-31 A /愛知県/ 68（H3N2）（X-31）、および蛍光レポーターでありますインフルエンザ株NS1-GFP 33。 APR8とX-31、および他の株についての詳細は、インフルエンザ研究データベースで見つけることができます
    1. 以前に34、35に記載されているように発育鶏卵でIAVのNS1-GFP株を伝播します。 、収集アリコート、およびIAVを含む尿膜液を滴定し、-80℃で保存。 APR8予備滴定及びX-31ウイルスは、商業的に購入することができます。
      1. 感染の直前に、急速に手袋をはめた手でIAVのアリコートを解凍し、その後すぐに力価の損失を低減するために氷の上に置きます。
    2. ウイルス希釈
      1. APR8またはX-31ウイルスを使用している場合は、滅菌、氷冷PBSのsupplemで50％（EID50）/ mlの3.3×10 6卵感染量に希釈します0.25％フェノールレッドでentedは、層流フード中で（視覚化を助けるために）。同時に、0.25％フェノールレッドを滅菌PBSを含むコントロールを設定します。
      2. NS1-GFP系統33を使用する場合、層流フード中で0.25％フェノールレッドを含む滅菌氷冷PBS（可視化を助けるために）でNLあたりの単位（PFU）を形成〜1.5×10 2プラークに希釈します。同時に、0.25％フェノールレッドとの無菌PBS中のウイルスのように希釈された非感染鶏の卵からの尿膜腔液を含むコントロールを設定します。
      3. 使用する準備ができるまで氷上でIAVを維持します。
    3. 使用直前にmicroloaderのヒントを使用して、マイクロインジェクション針にピペットウイルス液。射出装置（ 例えば MPPI-3圧力噴射システム）の適切なホルダーにマイクロインジェクションの針を挿入します。
    4. 実体顕微鏡下で表示している状態で、優しくシャープ、滅菌＃5鉗子でマイクロインジェクションの針の先端をクリップ。
      注：それはrecommenされますDEDマイクロインジェクションの先端が徐々にクリップされていること。
    5. 圧力注入システムのフットペダルを押し、キャリブレーションマイクロスライド上の顕微鏡液浸油の液滴に注入します。ドロップの直径を測定します。式を使用して液滴の体積を計算するV = VボリュームがNLであり、Rはミクロンで半径/3πr3 4。
      注：ドロップ径が小さすぎると、追加のガラスがクリッピングされ得るか、または圧力およびタイミングの設定を調整することができます。液滴の直径が大きすぎると、圧力及びタイミングの設定を調整することができます。
    6. 圧力インジェクタの圧力とタイミング設定を調整および/または所望の注入量は、（一般的に1-3 NL）が達成されるまで、針の先端をreclip。 40と80秒20〜30 psiのパルス持続時間の設定との間の圧力設定が典型的です。それは毛細管圧力に対抗するが、IAV（正味ゼロ圧力）を漏れないように背圧を調整します。
  3. 注射用胚の位置を合わせます
    1. 200 / mlのトリカインでdechorionated胚を麻酔。
    2. 動きが停止すると、プラスチック製のピペットで（セクション2.3で調製）を2％アガロースプレートに10-20胚を移します。過剰な液体を除去するためにプラスチック製のピペットを使用してください。
    3. 静かにファイアーポリッシュと密封されたホウケイ酸ガラスキャピラリーとマイクロインジェクションのための胚を合わせます。優しくオリエント胚、立体顕微鏡を使用したように、キュビエのダクトまたは後部の主静脈は、マイクロインジェクション針（ 図1A）に沿ったものです。
  4. IAVマイクロインジェクション
    1. ゆっくりキュビエのダクトまたは後部主静脈へのマイクロインジェクションの針を挿入します。胚（ 図1A）の循環系にIAVの所望の体積を注入するためにフットペダルを押し下げます。必要に応じて胚を複数回注入することができます。
      注：注射ボーラスは、循環とDISTRIBに飲み込まれるべきです体全体uted。注入量は、注射部位に集まる場合、実験から胚を除去し、安楽死させます。
    2. 選択されたウイルスの株に特異的な制御ソリューションで別の胚に注射を繰り返します。 APR8とX-31については、セクション3.2.2.1で説明した制御を使用します。 NS1-GFPのために、セクション3.2.2.2で説明したコントロールを使用します。
  5. 33℃のインキュベーターに無菌卵水と場所を含む標識ペトリ皿に胚を移します。
    注：感染した胚は、強化されたウイルスの複製をサポートするために、33℃で増殖させなければなりません。加えて、33℃でのインキュベーションは、より密接に外部環境のより低い温度に密着しているとIAV感染症が発生した場所である人間の上気道の温度を模倣します。胚は、広い温度範囲34に順応することができます。

4.ローカライズ、Tgの水泳膀胱IAV感染（MPX：mCherryを） のトランスジェニックゼブラフィッシュ（5日後に受精）

  1. マイクロインジェクションのためのIAVの準備
    1. NS1-GFP株を希釈し、3.2節で説明したように注射液を制御します。
    2. 2.2節で説明したように針を準備します。
    3. 以下の例外を除いて、3.3節で説明したように膨張鰾を含む35幼虫：Tgは（mCherryをMPX）を合わせます。針は浮き袋を貫通することができ、以前36（ 図2A）に記載されているようにウイルスは、浮き袋の後部に堆積させることができるように幼虫を合わせます。
  2. IAVマイクロインジェクション
    1. ゆっくり泳ぐ膀胱内にマイクロインジェクションの針を挿入した構造（ 図2A）の後方に向かって所望の体積（ 例えば 5 NL）を注入します。
      注：注射ボーラスが後方に向かって収集しなければならないと浮き袋の気泡は、bの必要がありますeが前方に変位します。 GFP発現は3時間後、注射で観察することを開始する必要があります。
    2. セクション3.4.2で説明したように、選択されたウイルスの株に特異的な制御ソリューションで注射を繰り返します。
  3. 33℃のインキュベーター中の滅菌卵水と場所を含むペトリ皿に幼虫を転送します。

5.抗ウイルス薬物治療

注：以下のプロトコールは、以前ガボールらに示したザナミビル処理について説明します。 19。このプロトコルは、他の抗ウイルス薬をスクリーニングするために変更され、96ウェルプレート、ハイスループット形式で、複数の化合物をスクリーニングするために修正される可能性を有することができます。

  1. 3時間後の感染では、0、16.7、33.3 ngの/ mlのザナミビルを含む滅菌卵水と卵NS1-GFP-の水と制御感染魚を交換してください。
    注：これらの濃度は、foは達成生理的レベルを複製しようとするために、選択されましたヒト患者におけるザナミビルのllowing管理（100、200、または600 mgを、静脈内、1日2回または1日10 mgを1日2回、吸入）。ヒト患者における血清濃度は、9.83から45.3 ngの/ mlの36の範囲でした。
  2. 5日間にわたって、12時間ごとに卵の水を変更し、ザナミビルの適切な量を含有する滅菌卵水と交換してください。
  3. 感染の経過を追跡します。
    1. 200 / mlのトリカインにゼブラフィッシュを麻酔。視覚的にIAV感染と対照魚の間および薬物の異なる濃度に浸漬した魚のうち、感染パターンの違いを観察するステレオ蛍光顕微鏡によってGFP発現を監視します。
    2. 5日間にわたって罹患率と死亡率を追跡します。
      1. 無気力や浮腫の証拠、色素沈着、眼および頭蓋顔面奇形の違い、および前弯の兆候を含む、疾患の病理学に関連する感染症のダイナミクス、約レコード観測。疾患病状典型的には、注入されたウイルスの量に依存して、24-48時間ポスト噴射の制御感染魚に明らかになる。イメージの24時間後、注射を収集します。
      2. 5日後、感染の24時間毎に、死者の数、病的、および健康幼虫を記録。死は、識別可能な心拍の欠如によって定義されます。所望のようにデータをプロットします。例えば、健康な病的な、または死んだ魚の割合で積み重ね棒グラフとしてプロットデータは、y軸とx軸上の処置群にプロット。 19
        注：死亡率は、カプラン・マイヤー生存推定によって獲得することができます。アプリケーションに応じて、観察前述の病理学的特徴に基づいて、罹患の程度を定量化することができるスコアリングマトリックスを含む魚の罹患率をスコアリングするための代替的なアプローチを開発することが適切であり得ます。
      3. 適切な統計分析を適用するために、統計学者に相談してください。

6。好中球遊走

注：以下のプロトコールは、ローカライズ、上皮IAV感染後の浮き袋に好中球移動を追跡するための方法を記載しています。記載された方法は、遺伝的および化学的操作の影響を試験するために修飾することができます。この技術を使用して、IAV感染の間に好中球の動作の基礎となるメカニズムを特徴づけることが可能になります。

  1. イメージングのためにゼブラフィッシュのマウント
    1. 200 / mlのトリカインに結像される幼虫を麻酔。
    2. 卵、水（〜50-100μl）を小滴で、24ウェル、ガラスボトムプレートのウェルにNS1-GFPに感染した幼虫：個々 のTg（mCherryをMPX）を転送します。他のIAV感染と対照魚と繰り返します。
    3. ゆっくりと大きな気泡を導入しないように注意しながら、各ウェル（セクション2.5）にメディアをマウント1％アガロース胚を追加します。
      1. それはその側面に搭載されているように、ゆっくりと幼虫の位置を調整します。グッディとヘンリー37は、フィラメントとホウケイ酸ガラスキャピラリーに取り付けられ、所定の位置にsupergluedされた昆虫のピンを使用して、このアプリケーションで十分に機能するプローブを作成する方法について説明します。
    4. アガロースが硬化したら、軽く200 / mlのトリカインを含む卵の水で個々のウェルを埋めます。
    5. 共焦点顕微鏡を用いて、浮き袋に焦点を当てた20Xの対物レンズを用いて、明視野および蛍光画像のAZスタックシリーズをキャプチャします。
      1. 彼らはすべての目に見え、観察緑と赤の蛍光を捕捉するように上限と下限を設定します。
      2. 2.0マイクロ秒/≤4μmであるステップとピクセルで画像をキャプチャします。画素あたりの時間を増加させ、ステップ（ 例えば 0.5から1.0μm）との間の距離を小さくすると画像の解像度と品質を向上します。
      3. 層をマージして2次元画像を生成します。
      4. 現在私MPX-mCherryを陽性好中球の数を比較nはIAV感染および制御注入ゼブラフィッシュの鰾。

結果

ここでは、ゼブラフィッシュにおける全身IAV感染は、薬効（ 図1A）をテストするために使用することができる方法を示すデータが提供されます。 48時間後、受精における胚は、ウイルス感染を開始するためキュビエのダクトを介しAPR8（ 図1C、1F）、X-31（ 図1D、1G）、またはNS1-GFP（ 図1H-1I）を注射します。 48時間後に?...

ディスカッション

ヒト宿主 - 病原体相互作用をモデル化するために、小さな動物を使用することから得られる利益を最大化するためには、モデルシステムの固有の利点を生かす研究課題とテスト仮説をフレームに重要です。人間IAV感染のモデルとして、ゼブラフィッシュは、高い繁殖力、光学的透明度、薬物スクリーニングに従順、および好中球などの免疫細胞を標識したトランスジェニック系統の可用性を?...

開示事項

The authors have nothing to disclose.

謝辞

The authors wish to thank Mark Nilan for zebrafish care and maintenance and Meghan Breitbach and Deborah Bouchard for propagating NS1-GFP and determining IAV titers. This research was supported by NIGMS grant NIH P20GM103534 and the Maine Agricultural and Forest Experiment Station (Publication Number 3493).

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Instant OceanSpectrum BrandsSS15-10
100 mm x 25 mm sterile disposable Petri dishes VWR89107-632
Transfer pipettes Fisherbrand13-711-7M
Tricaine-S (MS-222)Western Chemical
Borosilicate glass capillary with filament Sutter Instrument BF120-69-10
Flaming/Brown micropipette puller Sutter InstrumentP-97
AgaroseLonza50004
ZanamivirAK ScientificG939
Dumont #5 forceps Electron Microscopy Sciences72700-D
Microloader tipsEppendorf930001007
Microscope immersion oilOlympusIMMOIL-F30CC
Microscope stage calibration slide AmScopeMR095
MPPI-3 pressure injector Applied Scientific Instrumentation
Stereo microscopeOlympusSZ61
Back pressure unitApplied Scientific InstrumentationBPU
Micropipette holder kitApplied Scientific InstrumentationMPIP
Foot switchApplied Scientific InstrumentationFSW
MicromanipulatorApplied Scientific InstrumentationMM33
Magnetic baseApplied Scientific InstrumentationMagnetic Base
Phenol red Sigma-Aldrich P-4758
Low temperature incubatorVWR2020
SteREO Discovery.V12Zeiss
IlluminatorZeissHXP 200C
Cold light sourceZeiss CL6000 LED
Glass-bottom multiwell plate, 24 wellMattekP24G-0-13-F
Confocal microscopeOlympusIX-81 with FV-1000 laser scanning confocal system
Fluoview softwareOlympus
Prism v6GraphPad
Influenza A/PR/8/34 (H1N1) virus Charles River 490710
Influenza A X-31, A/Aichi/68 (H3N2) Charles River 490715
Influenza NS1-GFPReferenced in Manicassamy et al. 2010
Tg(mpx:mCherry)Referenced in Lam et al. 2013

参考文献

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