Utilisation de modèles Zebrafish de grippe humaine A Infections au virus pour le dépistage médicaments antiviraux et Caractériser hôte réponses immunitaires cellulaires

Résumé

Systemic and localized zebrafish infection models for human influenza A virus are demonstrated. Using a systemic infection model, zebrafish can be used to screen antiviral drugs. Using a localized infection model, zebrafish can be used to characterize host immune cell responses.

Résumé

Each year, seasonal influenza outbreaks profoundly affect societies worldwide. In spite of global efforts, influenza remains an intractable healthcare burden. The principle strategy to curtail infections is yearly vaccination. In individuals who have contracted influenza, antiviral drugs can mitigate symptoms. There is a clear and unmet need to develop alternative strategies to combat influenza. Several animal models have been created to model host-influenza interactions. Here, protocols for generating zebrafish models for systemic and localized human influenza A virus (IAV) infection are described. Using a systemic IAV infection model, small molecules with potential antiviral activity can be screened. As a proof-of-principle, a protocol that demonstrates the efficacy of the antiviral drug Zanamivir in IAV-infected zebrafish is described. It shows how disease phenotypes can be quantified to score the relative efficacy of potential antivirals in IAV-infected zebrafish. In recent years, there has been increased appreciation for the critical role neutrophils play in the human host response to influenza infection. The zebrafish has proven to be an indispensable model for the study of neutrophil biology, with direct impacts on human medicine. A protocol to generate a localized IAV infection in the Tg(mpx:mCherry) zebrafish line to study neutrophil biology in the context of a localized viral infection is described. Neutrophil recruitment to localized infection sites provides an additional quantifiable phenotype for assessing experimental manipulations that may have therapeutic applications. Both zebrafish protocols described faithfully recapitulate aspects of human IAV infection. The zebrafish model possesses numerous inherent advantages, including high fecundity, optical clarity, amenability to drug screening, and availability of transgenic lines, including those in which immune cells such as neutrophils are labeled with fluorescent proteins. The protocols detailed here exploit these advantages and have the potential to reveal critical insights into host-IAV interactions that may ultimately translate into the clinic.

Introduction

Selon l'Organisation mondiale de la santé (OMS), les virus grippaux infectent 5-10% des adultes et 20-30% des enfants chaque année et causent 3-5 millions de cas de maladie grave et jusqu'à 500.000 décès dans le monde ^1. vaccinations annuelles contre la grippe restent la meilleure option pour prévenir les maladies. Des efforts comme le Plan d' action mondial de l' OMS ont augmenté l' utilisation du vaccin saisonnier, la capacité de production de vaccins, et la recherche et le développement dans les stratégies de vaccination plus puissants afin de réduire la morbidité et la mortalité associées à des flambées de grippe saisonnière ^2. Les médicaments antiviraux tels que les inhibiteurs de la neuraminidase (par exemple zanamivir et l' oseltamivir) sont disponibles dans certains pays et se sont avérés efficaces dans les symptômes atténuants, lorsqu'il est administré dans les 48 premières heures d'apparition ^{3, 4, 5.} Malgré les efforts mondiaux, le confinement de la grippe saisonnière oustbreaks reste un formidable défi à ce moment, que le virus de la grippe dérive antigénique dépasse souvent les capacités actuelles pour adapter à l'évolution du génome du virus ^6. stratégies de vaccins ciblant de nouvelles souches de virus doivent être mis au point à l'avance et sont parfois rendues moins une efficacité optimale en raison de changements imprévus dans les types de souches qui prédominent éventuellement dans une saison grippale. Pour ces raisons, il y a un besoin évident de développer des stratégies thérapeutiques alternatives pour contenir les infections et réduire la mortalité. En obtenant une meilleure compréhension des interactions hôte-virus, il peut être possible d'élaborer de nouveaux médicaments anti-grippaux et des traitements adjuvants ^{7, 8.}

L'hôte-grippe humaine Une interaction virus (IAV) est complexe. Plusieurs modèles animaux d'infection IAV humaine ont été développés afin de mieux comprendre l'interaction hôte-virus, yment les souris, les cobayes, les rats de cotonniers, les hamsters, les furets et les macaques ^9. Tout en fournissant des données importantes qui ont amélioré la compréhension de la dynamique hôte-IAV, chaque organisme modèle possède des inconvénients importants qui doivent être considérés lors de la tentative de traduire les résultats en médecine humaine. Par exemple, les souris, qui sont le modèle le plus largement utilisé, ne développent pas facilement des symptômes d'infection IAV induites lorsqu'ils sont infectés par la grippe humaine isole ^9. En effet , les souris manquent de tropisme naturel pour les isolats de la grippe humaine étant donné que les cellules epitheliales de souris expriment des liaisons alpha-2,3 d'acide sialique à la place des liaisons α-2,6 d'acide sialique exprimés sur les cellules épithéliales humaines ^10. Les protéines hémagglutinine présentes dans IAV isolats humains se lient favorablement et pénètrent dans les cellules hôtes portant des liaisons acide sialique alpha-2,6 par endocytose médiée par le récepteur ^{9, 11, 12, 13.} En conséquence, il est maintenant admis que dans le développement de modèles de souris pour la grippe humaine, il faut prendre soin de jumeler la souche appropriée de la souris avec la souche appropriée de la grippe afin d'atteindre phénotypes de la maladie qui récapitulent les aspects de la maladie humaine. En revanche, les cellules épithéliales des voies respiratoires supérieures du furet possèdent des liaisons alpha-2,6 d'acide sialique qui ressemblent à des cellules humaines ^14. Furets infectés partagent plusieurs des caractéristiques pathologiques et cliniques observées dans la maladie humaine, y compris la pathogénicité et la transmissibilité des virus grippaux humains et aviaires ^{14, 15.} Ils sont aussi extrêmement sensibles à des essais d'efficacité du vaccin. Néanmoins, le modèle de furet pour la grippe humaine présente plusieurs inconvénients principalement liés à leur taille et le coût de l'élevage qui font l'acquisition de statistiquement signifidonnées catifs difficiles. En outre, les furets ont déjà affiché des différences dans la pharmacocinétique des médicaments, la biodisponibilité et la toxicité qui rendent les tests d'efficacité difficile. Par exemple, les furets présentent une toxicité pour le canal ionique M2 ¹⁶ inhibiteur amantadine. Ainsi, il est clair que dans le choix d'un modèle animal pour étudier des questions sur les infections IAV humaines, il est important de tenir compte des avantages et des limites inhérentes, et l'aspect de l'interaction hôte-virus qui est sous enquête.

Le poisson zèbre, Danio rerio, est un modèle animal qui offre des possibilités uniques pour enquêter sur l' infection microbienne, hôte réponse immunitaire, et les thérapies médicamenteuses potentielles ^{17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28.} La présence d'acide sialique α-2,6-liés à la surface des cellules dans le poisson zèbre a suggéré sa sensibilité à l' IAV, qui a été confirmé dans des études d'infection et imager in vivo en utilisant une souche rapporteuse fluorescente de ¹⁹ IAV. Chez le poisson zèbre IAV infectées, l' augmentation de l' expression des ifnphi1 et MXA transcrits anti - viraux ont indiqué qu'une réponse immunitaire innée a été stimulée, et la pathologie affichée par le poisson zèbre IAV infectés, y compris l' oedème et la destruction des tissus, a été similaire à celui observé dans les infections de la grippe humaine . En outre, l'IAV inhibiteur de neuraminidase antiviral Zanamivir mortalité limitée et la réplication virale réduite dans zebrafish ^19.

Dans ce rapport, un protocole de système d'amorçageinfections ic IAV dans des embryons de poisson zèbre est décrite. Utilisation de zanamivir à des doses cliniquement pertinentes comme une preuve de principe, l'utilité de ce modèle d'infection zebrafish IAV pour les composés de criblage pour l'activité antivirale est démontrée. En outre, un protocole pour générer une version localisée, l' infection de l' épithélium IAV dans la vessie natatoire du poisson zèbre, un organe qui est considéré comme anatomiquement et fonctionnellement analogue au poumon de mammifère ^{21, 29, 30, 31,} est décrit. L'utilisation de ce modèle d'infection IAV localisée, le recrutement des neutrophiles au site de l'infection peut être suivi, ce qui permet des enquêtes sur le rôle des neutrophiles dans la biologie infection IAV et de l'inflammation. Ces modèles se complètent de poisson zèbre modèles animaux existants d'infections IAV humaines et sont particulièrement utiles pour tester de petites molécules et les réponses des cellules immunitaires à cause de la possibilité de renforcer spuissance STATISTIQUE, capacité de modérée à des essais à haut débit, et les capacités de suivre le comportement des cellules immunitaires et la fonction de la lumière-microscopie.

Protocole

Tous les travaux doivent être effectués en utilisant le niveau de biosécurité 2 (ou NSB2) normes décrites par les US Centers for Disease Control (CDC) et conformément aux directives établies par Institutional Animal Care et l'utilisation des comités (IACUC). S'il vous plaît conférer avec les fonctionnaires compétents pour assurer la sécurité et la conformité.

1. Zebrafish Entretien et maintenance

1. Spawn zebrafish et de recueillir le nombre requis d'embryons pour les expériences. Lorsque, bassins d'élevage de masse nécessaires, comme ceux décrits par Adatto et al. ^32, peuvent être utilisés pour recueillir un grand nombre d'embryons au stade de développement mis en scène.
2. Permettre aux embryons de développer jusqu'au stade désiré de développement (48 heures après la fécondation pour une infection systémique IAV [section 3] ou 5 jours après la fécondation pour une localisée, nager infection de la vessie [article 4]) dans des boîtes profondes de Petri à faible densité (< 100 embryons / plat) à 28 ° C dans l'eau d'œuf stérile contenant 60 pg / ml de sel de mer (par exemple, Instant Ocean) dans de l' eau distillée.
   1. Retirer les embryons morts avec des pipettes de transfert en plastique et changer oeuf eau par jour pour assurer la santé et le développement optimal.

2. Préparation des Matériaux et réactifs

1. Préparer un ml de solution 4 mg / stock de Tricaine-S (ajuster le pH à 7,0-7,4) dans de l'eau distillée et autoclave. Conserver à 4 ° C.
2. Tirez capillaires en verre borosilicate avec des filaments en utilisant un extracteur micropipette (par exemple Micropipette Extracteur avec les paramètres suivants: réglage de la pression = 100, la chaleur = 550, tirez = [aucune valeur], vitesse = 130, temps = 110).
   NOTE: Avant de tailler l'aiguille, la longueur de l'endroit où l'aiguille commence à diminuer à la pointe de l'aiguille serait d'environ 12-15 mm. Cela peut toutefois varier en fonction des préférences et de l'application. Un cône plus long et plus progressif peut être plus préférables en raison de la plus grande capacité de percer l'embryon et la réduction risk de la flexion de l'aiguille ou de rupture.
3. Faire fondre 2 g d'agarose dans 100 ml d'eau d'œuf à l'aide d'un micro-ondes. Faire des plaques sur lesquelles aligner et injecter les embryons en versant fondu agarose dans des boîtes de Pétri profondes et en lui permettant de se solidifier.
4. Faire 10 mg / ml stock d'zanamivir dans l'eau sans nucléase. Aliquoter et congeler à -20 ° C.
5. Faire fondre 0,5 g d'agarose dans 50 ml d'eau d'œuf à l'aide d'un micro-ondes pour faire l'embryon de montage agarose. Maintenir dans un bain d'eau à 50 ° C jusqu'à l'utilisation lors de l'imagerie.

3. systémique IAV Infection (48 heures après la fécondation)

ATTENTION: Tout le personnel de recherche devraient consulter leurs superviseurs et les médecins en ce qui concerne la vaccination avant de commencer le travail avec IAV.

1. dechorionate manuellement les embryons le jour de l'expérience en utilisant # 5 forceps. Prendre soin d'enlever et euthanasier les embryons qui ont été blessés dans le processus de 200 pg / ml de solution Tricaine.
2. Préparation of IAV pour microinjection
   NOTE: Les souches qui ont été montrés pour infecter des embryons de poisson zèbre sont la grippe A / PR / 8/34 (H1N1) (APR8), la grippe A X-31 A / Aichi / 68 (H3N2) (X-31), et le rapporteur fluorescent souche de la grippe NS1-GFP ^33. Détails sur APR8 et X-31, et d'autres souches, se trouvent à la base de données recherche sur l'influenza
   1. Propager la souche NS1-GFP de IAV dans des œufs de poule embryonnés comme décrit précédemment ^{34, 35.} Collecter, aliquote et titrer le fluide allantoïque contenant IAV, et conserver à -80 ° C. Pré-titrés APR8 et X-31 virus peuvent être achetés dans le commerce.
      1. Juste avant l'infection, décongeler rapidement une aliquote IAV dans les mains gantées et placez ensuite rapidement sur la glace pour réduire la perte de titre.
   2. dilution virale
      1. Si vous utilisez les APR8 ou X-31 des virus, diluer à 3,3 x 10 ⁶ oeuf dose infectieuse 50% (DIO50) / ml dans stérile, PBS glacé supplémENTED avec 0,25% de rouge de phénol (pour aider à la visualisation) dans une hotte à flux laminaire. En même temps mettre en place un contrôle contenant du PBS stérile avec 0,25% de phénol rouge.
      2. Si l'on utilise la souche NS1-GFP ^33, diluer à environ 1,5 x 10 ² unités formant des plages (PFU) par nl dans stérile PBS glacé contenant 0,25% de rouge de phénol (pour aider à la visualisation) dans une hotte à flux laminaire. En même temps mettre en place un contrôle fluide allantoïque contenant des oeufs de poulet non infectés dilué comme le virus dans du PBS stérile avec 0,25% de phénol rouge.
      3. Maintenir IAV sur la glace jusqu'à utilisation.
   3. solution de virus Pipet dans des aiguilles de microinjection à l'aide des conseils de microloader juste avant d'utiliser. Insérer l' aiguille de micro - injection dans le support approprié du dispositif d'injection (par exemple 3-MPPI système d'injection sous pression).
   4. Lors de l'affichage sous le microscope stéréo, couper délicatement la pointe de l'aiguille de microinjection avec tranchants, # stérilisée 5 forceps.
      NOTE: Il est recomded que la pointe de microinjection clipser progressivement.
   5. Appuyer sur la pédale du système d'injection sous pression et à injecter dans une goutte d'huile à immersion au microscope sur une lame de calibrage micromètres. Mesurer le diamètre de la goutte. Calculer le volume de la goutte en utilisant l'équation V = ^4/3 3πr, où V est le volume en nl et r est le rayon en um.
      NOTE: Si le diamètre de la goutte est trop petit, le verre supplémentaire peut être coupé ou des paramètres de pression et de synchronisation peut être ajustée. Si le diamètre des gouttes est trop grande, les paramètres de pression et de temps peuvent être ajustés.
   6. Régler les paramètres de pression et de synchronisation sur l'injecteur de pression et / ou reclipper la pointe de l'aiguille jusqu'à ce que le volume d'injection désirée est atteinte (typiquement 1-3 nl). Réglage de la pression entre 20 et 30 psi et la durée d'impulsion réglages entre 40 et 80 msec sont typiques. Ajustez la contre-pression afin qu'il compteurs pression capillaire, mais ne fuit pas IAV (pression nette zéro).
3. Alignez Embryons pour injection
   1. Anesthetize embryons dechorionated à 200 pg / ml Tricaine.
   2. Une fois que le mouvement cesse, transférer 10-20 embryons à une plaque d'agarose 2% (préparé dans la section 2.3) avec une pipette en plastique. Utilisez la pipette en plastique pour enlever l'excès de liquide.
   3. alignez délicatement les embryons pour la microinjection d'un capillaire scellé verre borosilicate poli-feu et. En utilisant un microscope stéréo, embryons doucement orienter de telle sorte que le canal de Cuvier ou de la veine cardinale postérieure est en ligne avec l'aiguille de microinjection (figure 1A).
4. IAV microinjection
   1. Insérez délicatement l'aiguille de microinjection dans le canal de Cuvier ou de la veine cardinale postérieure. Enfoncer la pédale pour injecter le volume désiré de IAV dans le système circulatoire de l'embryon (figure 1A). Les embryons peuvent être injectés par plus d'une fois si nécessaire.
      NOTE: Le bolus d'injection doit être balayé dans la circulation et distribbué à travers le corps. Si le volume d'injection recueille sur le site d'injection, retirer l'embryon de l'expérience et Euthanasier.
   2. Répéter les injections sur différents embryons avec une solution de contrôle spécifique à la souche du virus choisi. Pour APR8 et X-31, utilisez la commande décrite dans la section 3.2.2.1; pour la NS1-GFP, utilisez la commande décrite dans la section 3.2.2.2.
5. embryons de transfert aux boîtes de Pétri marqués contenant de l'eau d'œuf stérile et dans des incubateurs à 33 ° C.
   NOTE: Infected embryons doivent être cultivées à 33 ° C pour soutenir la réplication virale améliorée. En outre, l'incubation à 33 ° C imite de plus près la température de l'appareil respiratoire supérieur humain, qui est en contact étroit avec des températures plus basses dans l'environnement externe et où les infections IAV se produisent. Les embryons peuvent acclimater à une large plage de température ^34.

4. Localisée, vessie natatoire IAV Infection à Tg (mpx: mCherry) poisson zèbre transgénique (5 jours après la fécondation)

1. Préparation de l'IAV pour microinjection
   1. Diluer la solution d'injection et de contrôle souche NS1-GFP comme décrit dans la section 3.2.
   2. Préparer des aiguilles comme décrit dans la section 2.2.
   3. Alignez Tg (mpx: mCherry) ³⁵ larves contenant des vessies natatoires gonflées comme décrit dans la section 3.3 , à l'exception suivante. Aligner les larves de telle manière que l'aiguille puisse percer la vessie natatoire et le virus peut être déposé dans la partie postérieure de la vessie natatoire, comme décrit précédemment ³⁶ (figure 2A).
2. IAV microinjection
   1. Insérez délicatement l'aiguille de microinjection dans la vessie natatoire et injecter le volume désiré (par exemple 5 nl) vers la partie postérieure de la structure (figure 2A).
      NOTE: Le bolus d'injection devrait recueillir vers le postérieur et la bulle d'air de la vessie natatoire devrait be déplacé vers l'avant. expression de la GFP devrait commencer à observer au post-injection 3 h.
   2. Répéter les injections avec une solution de contrôle spécifique à la souche du virus choisi, comme décrit dans la section 3.4.2.
3. Transfert des larves à des boîtes de Pétri contenant de l'eau d'œuf stérile et dans des incubateurs à 33 ° C.

5. Antiviral traitement de la toxicomanie

NOTE: Le protocole ci - dessous décrit le traitement Zanamivir montré précédemment dans Gabor et al. ^19. Ce protocole peut être modifié à l'écran d'autres médicaments antiviraux et a le potentiel d'être modifié à l'écran plusieurs composés dans une plaque à 96 puits, format à haut débit.

1. A 3 heures après l'infection, remplacer l'eau d'œuf de NS1-GFP et les poissons témoins infectés avec de l'eau d'œuf stérile contenant 0, 16,7 ou 33,3 ng / ml zanamivir.
   NOTE: Ces concentrations ont été choisies afin de tenter de reproduire les niveaux physiologiques obtenus foadministration llowing du zanamivir chez les patients humains (100, 200, ou 600 mg, iv, deux fois par jour ou 10 mg par inhalation, deux fois par jour). Les concentrations sériques chez les patients humains ont varié de 9,83 à 45,3 ng / ml ^36.
2. Au cours de 5 jours, changer l'eau d'œuf toutes les 12 heures et le remplacer par l'eau d'œuf stérile contenant la quantité appropriée de zanamivir.
3. Suivre cours de l'infection.
   1. Anesthetize zebrafish dans 200 pg / ml Tricaine. Surveiller l'expression de la GFP par microscopie à fluorescence stéréo pour observer visuellement les différences dans les schémas d'infection entre les poissons IAV infectés et de contrôle et parmi les poissons immergés dans les différentes concentrations de médicaments.
   2. Suivre la morbidité et de la mortalité au cours de 5 jours.
      1. Enregistrer les observations au sujet de la dynamique d'infection liés à la pathologie de la maladie, y compris des signes de léthargie et des preuves de l'œdème, des différences dans la pigmentation, oculaire et malformations cranio-faciales, et la lordose. pathologie de la maladiedevient généralement apparente dans le contrôle des poissons infectés au post-injection 24-48 h, en fonction de la quantité de virus injecté. Collecter des images post-injection de 24 heures.
      2. Chaque 24 heures pendant 5 jours après l'infection, enregistrer le nombre de larves mortes, morbide, et en bonne santé. La mort est définie par l'absence d'un battement de coeur perceptible. Tracer les données comme vous le souhaitez. Par exemple, les données de tracé sous forme de graphique à barres empilées, avec des pourcentages de poissons en bonne santé, morbide, ou mort tracées sur l'axe y et le groupe de traitement sur l'axe des x. ¹⁹
         NOTE: Mortalités peuvent être marqués par des estimations de survie de Kaplan-Meier. Selon l'application, il peut être approprié de développer des approches alternatives pour la morbidité de poissons de notation, y compris une matrice de notation qui peut quantifier les degrés de morbidité en fonction des caractéristiques pathologiques mentionnés ci-dessus observés.
      3. Consultez un statisticien pour appliquer les analyses statistiques appropriées.

6. neutrophiles migration

NOTE: Le protocole ci-dessous décrit une méthode pour le suivi de la migration des neutrophiles à la vessie natatoire après une localisée, infection épithéliale IAV. Les procédés décrits peuvent être modifiés pour tester les effets des manipulations génétiques et chimiques. En utilisant cette technique, il sera possible de caractériser les mécanismes sous-jacents le comportement des neutrophiles lors d'une infection IAV.

1. Zebrafish Montage for Imaging
   1. Anesthetize larves à imager dans 200 pg / ml Tricaine.
   2. Transférer une Tg (mpx: mCherry) individuelle larve qui a été infecté par NS1-GFP à un puits d'une 24 bien, le verre plaque de fond dans une petite goutte d'eau d'œuf (~ 50-100 pi). Répéter l'opération avec d'autres poissons IAV infectés et de contrôle.
   3. Ajouter lentement 1% milieux de montage embryon agarose à chaque (section 2.5) et, en prenant soin de ne pas introduire de grosses bulles.
      1. ajuster en douceur de la position de la chenille de sorte qu'il est monté sur le côté.Goody et Henry ³⁷ décrivent comment faire des sondes qui fonctionnent bien dans cette application en utilisant des broches d' insectes qui sont montés dans des capillaires en verre borosilicate avec filaments et superglued en place.
   4. Une fois que l'agarose durcit, remplir doucement les puits individuels avec de l'eau d'oeuf contenant 200 ug / ml Tricaine.
   5. Avec un microscope confocal, capture az série pile de fond clair et fluorescence des images en utilisant un objectif 20X concentré sur la vessie natatoire.
      1. Définissez les limites supérieure et inférieure de sorte qu'ils saisissent toutes la fluorescence verte et rouge visible observable.
      2. Capture d'images à 2.0 microsecondes / pixel avec des étapes qui sont ≤ 4 um. Augmentant par pixel et en réduisant la distance entre les étapes (par exemple de 0,5 à 1,0 um) augmente la résolution et une qualité d' image.
      3. Générer une image en deux dimensions par la fusion des couches.
      4. Comparez le nombre de neutrophiles mpx-mCherry-positifs présents in les vessies natatoires de zebrafish IAV infectés et de contrôle-injecté.

Résultats

Ici, des données montrant comment l' infection IAV systémique chez le poisson zèbre peut être utilisé pour tester l' efficacité des médicaments (figure 1A) sont fournis. Embryons à 48 heures après la fécondation sont injectés avec APR8 (figures 1C, 1E), X-31 (figures 1D, 1G) ou NS1-GFP (figures 1 H-1I) par l' intermédiaire du canal de Cuvier pour initier une infection virale. Une autre cohorte d&#...

Discussion

Afin de maximiser les avantages tirés de l'utilisation d'un petit animal pour modéliser les interactions hôte-pathogène humain, il est important d'encadrer les questions de recherche et de tester des hypothèses qui misent sur les avantages inhérents du système modèle. En tant que modèle pour l'infection IAV humaine, le poisson zèbre a plusieurs points forts, y compris une fécondité élevée, la clarté optique, amenability au dépistage de drogues, et la disponibilité des lignées transgéni...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Instant Ocean	Spectrum Brands	SS15-10
100 mm x 25 mm sterile disposable Petri dishes	VWR	89107-632
Transfer pipettes	Fisherbrand	13-711-7M
Tricaine-S (MS-222)	Western Chemical
Borosilicate glass capillary with filament	Sutter Instrument	BF120-69-10
Flaming/Brown micropipette puller	Sutter Instrument	P-97
Agarose	Lonza	50004
Zanamivir	AK Scientific	G939
Dumont #5 forceps	Electron Microscopy Sciences	72700-D
Microloader tips	Eppendorf	930001007
Microscope immersion oil	Olympus	IMMOIL-F30CC
Microscope stage calibration slide	AmScope	MR095
MPPI-3 pressure injector	Applied Scientific Instrumentation
Stereo microscope	Olympus	SZ61
Back pressure unit	Applied Scientific Instrumentation	BPU
Micropipette holder kit	Applied Scientific Instrumentation	MPIP
Foot switch	Applied Scientific Instrumentation	FSW
Micromanipulator	Applied Scientific Instrumentation	MM33
Magnetic base	Applied Scientific Instrumentation	Magnetic Base
Phenol red	Sigma-Aldrich	P-4758
Low temperature incubator	VWR	2020
SteREO Discovery.V12	Zeiss
Illuminator	Zeiss	HXP 200C
Cold light source	Zeiss	CL6000 LED
Glass-bottom multiwell plate, 24 well	Mattek	P24G-0-13-F
Confocal microscope	Olympus	IX-81 with FV-1000 laser scanning confocal system
Fluoview software	Olympus
Prism v6	GraphPad
Influenza A/PR/8/34 (H1N1) virus	Charles River	490710
Influenza A X-31, A/Aichi/68 (H3N2)	Charles River	490715
Influenza NS1-GFP			Referenced in Manicassamy et al. 2010
Tg(mpx:mCherry)			Referenced in Lam et al. 2013