El uso de modelos de pez cebra de Infecciones por Virus de la Influenza Humana A a la pantalla medicamentos antivirales y caracterizar inmune del huésped respuestas de las células

Resumen

Systemic and localized zebrafish infection models for human influenza A virus are demonstrated. Using a systemic infection model, zebrafish can be used to screen antiviral drugs. Using a localized infection model, zebrafish can be used to characterize host immune cell responses.

Resumen

Each year, seasonal influenza outbreaks profoundly affect societies worldwide. In spite of global efforts, influenza remains an intractable healthcare burden. The principle strategy to curtail infections is yearly vaccination. In individuals who have contracted influenza, antiviral drugs can mitigate symptoms. There is a clear and unmet need to develop alternative strategies to combat influenza. Several animal models have been created to model host-influenza interactions. Here, protocols for generating zebrafish models for systemic and localized human influenza A virus (IAV) infection are described. Using a systemic IAV infection model, small molecules with potential antiviral activity can be screened. As a proof-of-principle, a protocol that demonstrates the efficacy of the antiviral drug Zanamivir in IAV-infected zebrafish is described. It shows how disease phenotypes can be quantified to score the relative efficacy of potential antivirals in IAV-infected zebrafish. In recent years, there has been increased appreciation for the critical role neutrophils play in the human host response to influenza infection. The zebrafish has proven to be an indispensable model for the study of neutrophil biology, with direct impacts on human medicine. A protocol to generate a localized IAV infection in the Tg(mpx:mCherry) zebrafish line to study neutrophil biology in the context of a localized viral infection is described. Neutrophil recruitment to localized infection sites provides an additional quantifiable phenotype for assessing experimental manipulations that may have therapeutic applications. Both zebrafish protocols described faithfully recapitulate aspects of human IAV infection. The zebrafish model possesses numerous inherent advantages, including high fecundity, optical clarity, amenability to drug screening, and availability of transgenic lines, including those in which immune cells such as neutrophils are labeled with fluorescent proteins. The protocols detailed here exploit these advantages and have the potential to reveal critical insights into host-IAV interactions that may ultimately translate into the clinic.

Introducción

De acuerdo con la Organización Mundial de la Salud (OMS), virus de la gripe infectan a un 5-10% de los adultos y un 20-30% de los niños al año y causan 3-5 millones de casos de enfermedades graves y hasta 500.000 muertes en todo el mundo ^1. vacunas anuales contra la gripe siguen siendo la mejor opción para prevenir la enfermedad. Esfuerzos como el Plan de Acción Mundial de la OMS han aumentado el uso de la vacuna estacional, la capacidad de producción de vacunas, y la investigación y el desarrollo de estrategias de vacunas más potentes con el fin de reducir la morbilidad y la mortalidad asociadas con brotes de gripe estacional ^2. Los medicamentos antivirales como inhibidores de la neuraminidasa (por ejemplo, zanamivir y oseltamivir) están disponibles en algunos países y han demostrado ser eficaces en los síntomas atenuantes, cuando se administra dentro de las primeras 48 h de inicio ^{3, 4, 5.} A pesar de los esfuerzos mundiales, la contención de la gripe estacional outbreaks sigue siendo un desafío formidable en este momento, como el virus de la gripe deriva antigénica a menudo excede capacidades actuales para adaptarse a la genoma cambio de virus ^6. estrategias de vacunas dirigidas a nuevas cepas del virus deben ser desarrolladas con antelación y, a veces se vuelven menos de una eficacia óptima debido a los cambios imprevistos en los tipos de cepas que eventualmente predominan en una temporada de gripe. Por estas razones, existe una clara necesidad de desarrollar estrategias terapéuticas alternativas para contener las infecciones y la reducción de la mortalidad. En el logro de una mejor comprensión de la interacción huésped-virus, puede ser posible desarrollar nuevos medicamentos anti-influenza y terapias adyuvantes ^{7, 8.}

El anfitrión de la influenza humana A la interacción del virus (IAV) es compleja. Varios modelos animales de infección IAV humana se han desarrollado con el fin de profundizar en la interacción huésped-virus, INCLUYENDOing ratones, cobayas, ratas del algodón, hámsters, hurones y los macacos ^9. Mientras que proporciona datos importantes que han mejorado la comprensión de la dinámica de host-IAV, cada organismo modelo posee inconvenientes importantes que deben ser considerados cuando se trata de traducir los hallazgos en la medicina humana. Por ejemplo, los ratones, que son el modelo más ampliamente utilizado, no desarrollan síntomas de la infección fácilmente inducidas por IAV cuando están infectadas con la gripe humana aísla ^9. Esto se debe a que los ratones carecen del tropismo natural para la gripe humana aísla ya que las células epiteliales de ratón expresan alfa-2,3 vínculos de ácido siálico en lugar de los α-2,6 vínculos de ácido siálico expresadas en las células epiteliales humanas ^10. Las proteínas hemaglutinina presentes en las cepas humanas IAV favorable se unen y entran en las células anfitrionas teniendo vínculos de ácido siálico alfa-2,6 través de endocitosis mediada por receptor ^{9, 11, 12, 13.} Como consecuencia, ahora se acepta que en el desarrollo de modelos de ratón de la influenza humana, se debe tener cuidado para emparejar la cepa apropiada de ratón con la cepa de la gripe apropiada con el fin de lograr fenotipos de la enfermedad que recapitular aspectos de la enfermedad humana. En contraste, las células epiteliales en el tracto respiratorio superior de los hurones poseen 2,6 a-vínculos de ácido siálico que se asemejan a las células humanas ^14. Hurones infectados comparten muchas de las características patológicas y clínicas observadas en la enfermedad humana, incluyendo la patogenicidad y la transmisibilidad de los virus de la gripe humana y aviar ^{14, 15.} También son altamente susceptibles a los ensayos de eficacia de vacunas. Sin embargo, el modelo de hurón para la influenza humana tiene varias desventajas, principalmente relacionados con su tamaño y el costo de la cría que hacen adquisición de estadísticamente signifilos datos de peralte desafiantes. Además, los hurones han mostrado previamente diferencias en la farmacocinética de fármacos, biodisponibilidad y toxicidad que hacen probar la eficacia difícil. Por ejemplo, los hurones presentan toxicidad para el canal iónico M2 amantadina inhibidor ^16. Por lo tanto, es evidente que en la elección de un modelo animal para estudiar preguntas sobre infecciones IAV humanos, es importante tener en cuenta sus ventajas y limitaciones inherentes, y el aspecto de la interacción huésped-virus que se encuentra bajo investigación.

El pez cebra, Danio rerio, es un modelo de animal que proporciona oportunidades únicas para la investigación de la infección microbiana, el anfitrión de la respuesta inmune, y las posibles terapias de drogas ^{17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28. La presencia de ácidos siálicos unidos a α-2,6 en la superficie de células en el pez cebra sugirió su susceptibilidad a la IAV, que fue confirmada en estudios de infección y la imagen in vivo usando una cepa fluorescente reportero de IAV 19. En el pez cebra infectados por el IAV, aumento de la expresión de los ifnphi1 y MXA transcripciones antivirales indicó que una respuesta inmune innata había sido estimulado, y la patología que se muestra por pez cebra infectados por el IAV, incluyendo edema y la destrucción del tejido, fue similar a la observada en las infecciones de la gripe humana . Por otra parte, el inhibidor de la neuraminidasa antiviral Zanamivir mortalidad limitada IAV y la reducción de la replicación viral en el pez cebra 19.}

En este informe, un protocolo para el sistema de iniciacióninfecciones ic IAV en embriones de pez cebra se describe. El uso de zanamivir a dosis clínicamente relevantes como una prueba de principio, la utilidad de este modelo de pez cebra infección IAV para el cribado de compuestos para la actividad antiviral se demuestra. Además, un protocolo para la generación de una infección IAV localizada, epitelial en el pez cebra nadar vejiga, un órgano que se considera que es anatómica y funcionalmente análoga a la de pulmón de mamífero ^{21, 29, 30, 31,} se describe. El uso de este modelo de infección IAV localizada, el reclutamiento de neutrófilos al sitio de la infección se puede seguir, lo que permite las investigaciones sobre el papel de la biología de los neutrófilos en la infección IAV y la inflamación. Estos modelos de pez cebra complementan modelos animales existentes de infecciones IAV humanos y son particularmente útiles para el ensayo de moléculas pequeñas y respuestas de las células inmunitarias debido a la posibilidad de una mayor sATOS ESTADÍSTICOS potencia, capacidad de moderada a ensayos de alto rendimiento, y las habilidades para rastrear el comportamiento celular inmune y la función con la luz-microscopía.

Protocolo

Todo el trabajo debe realizarse con nivel de bioseguridad 2 (o BSL2) normas descritas por los Centros para el Control de Enfermedades (CDC) y de conformidad con las directrices establecidas por Institucional Cuidado de Animales y el empleo Comités (IACUC). Por favor, consultar con los funcionarios adecuados para garantizar la seguridad y el cumplimiento.

1. El pez cebra Cuidado y mantenimiento

1. Desovar pez cebra y recoger el número necesario de embriones para los experimentos. Cuando sea necesario, los tanques de cría en masa, como los descritos por Adatto et al. ^32, se puede emplear para recoger un gran número de embriones por etapas de desarrollo.
2. Permitir que los embriones se desarrollen hasta la fase deseada del desarrollo (48 horas después de la fertilización para una infección sistémica IAV [artículo 3] o 5 días después de la fertilización para una infección de la vejiga localizada, nadar [artículo 4]) en platos profundos de Petri de baja densidad (< 100 embriones / placa) a 28 ° C en agua estéril que contiene el huevo 60 mg / ml de sal de mar (por ejemplo, Instant Ocean) en agua destilada.
   1. Retire embriones muertos con pipetas de transferencia de plástico y cambie el huevo diario de agua para asegurar la salud y el desarrollo óptimos.

2. Preparación de Materiales y Reactivos

1. Preparar una solución de 4 mg / ml de stock de tricaína-S (ajustar el pH a 7,0-7,4) en agua destilada y se autoclave. Almacenar a 4 ° C.
2. Tire capilares de vidrio borosilicato con filamentos utilizando un extractor de micropipeta (por ejemplo Micropipeta Tirador con la siguiente configuración: ajuste de presión = 100, el calor = 550, tire = [valor], velocidad = 130, tiempo = 110).
   NOTA: Antes de recorte de la aguja, la longitud desde donde la aguja comienza a disminuir a la punta de la aguja sería de aproximadamente 12 a 15 mm. Esto puede variar, sin embargo, basándose en las preferencias y la aplicación. A, conicidad más gradual más largo puede ser más preferible debido a la mayor capacidad de perforar el embrión y el reducido risk de la flexión de la aguja o de ruptura.
3. Derretir 2 g de agarosa en agua de huevo 100 ml usando un horno de microondas. Hacer placas en los que alinear e inyectar los embriones por vertido funde de agarosa en placas de Petri profundas y permitiendo que se solidifique.
4. Hacer a 10 mg / ml de solución madre de zanamivir en agua libre de nucleasa. Alícuota y se congelan a -20 ° C.
5. Derretir 0,5 g de agarosa en agua de huevo 50 ml usando un horno de microondas para hacer embriones de montaje de agarosa. Mantener en el baño de agua a 50 ° C hasta que esté listo para usar durante la exploración.

3. sistémica IAV infección (48 horas después de la fecundación)

PRECAUCIÓN: Todo el personal de investigación deben consultar con sus supervisores y médicos con respecto a la vacunación antes de iniciar el trabajo con IAV.

1. dechorionate manualmente embriones en el día del experimento usando # 5 fórceps. Tenga cuidado de eliminar la eutanasia y los embriones que han sido heridos en el proceso en 200 g solución Tricaína / ml.
2. preparación df IAV para la microinyección
   NOTA: Las cepas que se han demostrado para infectar embriones de pez cebra son la influenza A / PR / 8/34 (H1N1) (APR8), influenza A X-31 A / Aichi / 68 (H3N2) (X-31), y el indicador fluorescente cepa de la gripe NS1-GFP ^33. Los detalles sobre APR8 y X-31, y otras cepas, se pueden encontrar en la base de datos de investigación Influenza
   1. Propagar la cepa NS1-GFP de IAV en huevos embrionados de pollo como se ha descrito previamente ^{34, 35.} Recoger, alícuota, y titule el fluido alantoideo que contiene IAV, y se almacena a -80 ° C. Pre-titularon APR8 y X-31 virus se pueden adquirir comercialmente.
      1. Justo antes de la infección, descongelar rápidamente una alícuota IAV en las manos enguantadas y luego se coloca rápidamente en hielo para reducir la pérdida de título.
   2. dilución viral
      1. Si el uso de los APR8 o X-31 virus, se diluye hasta 3,3 x 10 ⁶ huevos dosis infectiva 50% (EID50) / ml en, suplem helada PBS estérilentados con 0,25% de rojo fenol (para ayudar en la visualización) en una campana de flujo laminar. Al mismo tiempo establecer un control que contenía PBS estéril con un 0,25% de rojo fenol.
      2. Si se utiliza NS1-GFP cepa ^33, diluir a ~ 1,5 x 10 ² unidades formadoras de placas (UFP) por nl en, PBS que contenía enfriado con hielo rojo fenol 0,25% estéril (para ayudar en la visualización) en una campana de flujo laminar. Al mismo tiempo establecer un control que contiene el fluido alantoideo de huevos de gallina no infectadas diluido como el virus en PBS estéril con un 0,25% de rojo fenol.
      3. Mantener IAV en hielo hasta que esté listo para su uso.
   3. solución de virus de la pipeta de microinyección en agujas que utilizan puntas Microloader justo antes de su uso. Insertar la aguja de microinyección en el soporte apropiado del aparato de inyección (por ejemplo, sistema de inyección de presión MPPI-3).
   4. Mientras ve bajo el microscopio estereoscópico, el clip suavemente la punta de la aguja de microinyección con afilados, esterilizada # 5 pinzas.
      NOTA: Es recoded que la punta microinyección ser recortado gradualmente.
   5. Presione el pedal del sistema de inyección a presión e inyectar en una gota de aceite de inmersión microscopio en un portaobjetos de calibración del micrómetro. Medir el diámetro de la gota. Calcular el volumen de la gota utilizando la ecuación, V = 4 / 3πr ^3, donde V es el volumen en nl y r es el radio en micras.
      NOTA: Si el diámetro de la gota es demasiado pequeño, vidrio adicional puede ser cortada, o ajustes de presión y de temporización se puede ajustar. Si el diámetro de la gota es demasiado grande, ajustes de presión y de tiempo se pueden ajustar.
   6. Ajustar la configuración de presión y de tiempo en el inyector de presión y / o Reclip la punta de la aguja hasta que el volumen de inyección deseado se alcanza (típicamente 1-3 nl). Los ajustes de presión entre 20 y 30 psi configuración y duración del pulso entre 40 y 80 ms son típicos. Ajustar la presión de retorno de modo que contrarresta la presión capilar, pero no se escapa IAV (neto presión cero).
3. Alinear embriones para Inyección
   1. Anestesiar a los embriones dechorionated en 200 g / ml Tricaína.
   2. Una vez que cesa el movimiento, la transferencia de embriones 10-20 a una placa de agarosa al 2% (preparado en el apartado 2.3) con una pipeta de plástico. Utilice una pipeta de plástico para eliminar el exceso de líquido.
   3. alinee con cuidado los embriones para la microinyección con un capilar de vidrio de borosilicato sellados al fuego pulido y. El uso de un microscopio estereoscópico, los embriones suavemente orientar de manera que el conducto de Cuvier o la vena cardinal posterior está en línea con la aguja de microinyección (Figura 1A).
4. La microinyección IAV
   1. Suavemente inserte la aguja de microinyección en el conducto de Cuvier o la vena cardinal posterior. Presione el pedal para inyectar el volumen deseado de IAV en el sistema circulatorio del embrión (Figura 1A). Los embriones se pueden inyectar más de una vez si es necesario.
      NOTA: El bolo de inyección debe ser barrido en la circulación y distribbuido por todo el cuerpo. Si el volumen de inyección se acumula en el sitio de la inyección, retire embrión a partir de la experimentación y la eutanasia a.
   2. Repetir las inyecciones en diferentes embriones con solución de control específica para la cepa del virus elegido. Para APR8 y X-31, utilice el control descrito en el apartado 3.2.2.1; para la NS1-GFP, utilice el control descrito en el apartado 3.2.2.2.
5. embriones de transferencia a placas de Petri marcadas que contienen agua estéril huevo y el lugar en incubadoras a 33 ° C.
   NOTA: Infected embriones deben ser cultivadas a 33 ° C para apoyar la replicación viral mejorada. Además, la incubación a 33 ° C imita más de cerca la temperatura del tracto respiratorio superior humano, que está en estrecho contacto con las temperaturas más bajas en el ambiente externo y es donde se producen infecciones IAV. Los embriones pueden aclimatarse a un amplio rango de temperatura de ^34.

4. localizada, Vejiga natatoria IAV infección en Tg (mpx: mCherry) pez cebra transgénico (5 días después de la fertilización)

1. Preparación de IAV para la microinyección
   1. Diluir la solución de inyección tensión y control de NS1-GFP como se describe en la sección 3.2.
   2. Preparar agujas como se describe en la sección 2.2.
   3. Alinear Tg (mpx: mCherry) ³⁵ larvas que contiene vejigas natatorias inflados como se describe en la sección 3.3 con la siguiente excepción. Alinear larvas de tal manera que la aguja puede perforar la vejiga natatoria y el virus puede ser depositado en la parte posterior de la vejiga natatoria, como se describió anteriormente ³⁶ (Figura 2A).
2. La microinyección IAV
   1. Suavemente inserte la aguja de microinyección en la vejiga natatoria e inyectar el volumen deseado (por ejemplo 5 nl) hacia la parte posterior de la estructura (Figura 2A).
      NOTA: El bolo inyección debe recoger hacia el posterior y la burbuja de aire de la vejiga natatoria debe be desplazado hacia delante. La expresión de GFP debe comenzar a ser observados a las 3 horas después de la inyección.
   2. Repetir las inyecciones con solución de control específica para la cepa del virus elegido, como se describe en el apartado 3.4.2.
3. Transferir las larvas a placas de Petri que contenían agua estéril huevo y el lugar en incubadoras a 33 ° C.

5. Antiviral Drug Treatment

NOTA: El protocolo siguiente se describe el tratamiento Zanamivir anteriormente se muestra en la Gabor et al. ^19. Este protocolo puede ser modificado para la pantalla de otros medicamentos antivirales y tiene el potencial de ser modificado para detectar múltiples compuestos en una placa de 96 pocillos, formato de alto rendimiento.

1. A las 3 horas después de la infección, reemplazar el agua de huevo de NS1-GFP y control de los peces infectados con agua estéril que contiene el huevo 0, 16.7, o 33.3 ng / ml zanamivir.
   NOTA: Estas concentraciones fueron elegidos con el fin de tratar de replicar los niveles fisiológicos obtenidos foadministración llowing de Zanamivir en pacientes humanos (100, 200, o 600 mg, iv, dos veces al día o 10 mg inhalados, dos veces al día). Las concentraciones en suero en pacientes humanos variaron desde 9,83 hasta 45,3 ng / ml ^36.
2. En el transcurso de 5 días, cambiar el agua huevo cada 12 horas y reemplazar con agua estéril que contiene el huevo la cantidad apropiada de zanamivir.
3. Realizar un seguimiento del curso de la infección.
   1. Anestesiar el pez cebra en 200 g / ml Tricaína. Monitor de la expresión de GFP mediante microscopía de fluorescencia estéreo para observar visualmente diferencias en los patrones de infección entre los peces infectados-IAV y control y entre los peces inmerso en las diferentes concentraciones de fármacos.
   2. Seguimiento de la morbilidad y la mortalidad en el transcurso de 5 días.
      1. Registra las observaciones acerca de la dinámica de infección relacionados con la patología de la enfermedad, incluidos los signos de letargo y la evidencia de edema, las diferencias en la pigmentación ocular, y deformidades craneofaciales, y lordosis. patología de la enfermedadtípicamente se hace evidente en los peces infectados de control a las 24-48 horas después de la inyección, dependiendo de la cantidad de virus inyectado. Recoge imágenes de 24 horas después de la inyección.
      2. Cada 24 horas durante 5 días después de la infección, registrar el número de larvas muertas, morbosa, y saludable. La muerte se define por la ausencia de un latido del corazón perceptible. Trazar datos si lo deseas. Por ejemplo, los datos de la trama como un gráfico de barras apiladas, con porcentajes de peces sanos, mórbida, o muertos representan en el eje y, y el grupo de tratamiento en el eje x. ¹⁹
         NOTA: Las mortalidades pueden ser anotados por las estimaciones de supervivencia de Kaplan-Meier. Dependiendo de la aplicación, puede ser apropiado para desarrollar enfoques alternativos para la morbilidad peces de puntuación, incluyendo una matriz de puntuación que pueden cuantificar los grados de morbilidad en base a las características patológicas mencionadas anteriormente observados.
      3. Consulte con un experto en estadística para aplicar los análisis estadísticos apropiados.

6. la migración de neutrófilos

NOTA: El protocolo siguiente se describe un método para el seguimiento de la migración de neutrófilos a la vejiga natatoria después de una infección localizada, epitelial IAV. Los métodos descritos pueden ser modificados para probar los efectos de las manipulaciones genéticas y químicas. Usando esta técnica, será posible caracterizar los mecanismos subyacentes comportamiento de neutrófilos durante una infección IAV.

1. Montaje de pez cebra de la Imagen
   1. Anestesiar a las larvas de obtener imágenes en 200 g / ml Tricaína.
   2. Transferir un individuo Tg (mpx: mCherry) larva que ha sido infectado con NS1-GFP a un pozo de un 24 pocillos, placa de fondo de cristal en una pequeña gota de agua de huevo (~ 50-100 l). Repetir con otros peces IAV-infectada y control.
   3. Poco a poco agregue 1% de agarosa al embrión medios de montaje para cada uno (sección 2.5) y, teniendo cuidado de no introducir burbujas grandes.
      1. Ajuste cuidadosamente la posición de la larva de modo que se monta en su lado.Goody y Henry ³⁷ describen cómo hacer que las sondas que funcionan bien en esta aplicación utilizando pasadores de insectos que se montan en capilares de vidrio borosilicato con filamentos y superglued en su lugar.
   4. Una vez que la agarosa se endurece, llenar con cuidado los pocillos individuales con agua huevo que contiene 200 mg / ml Tricaína.
   5. Con un microscopio confocal, la captura az serie pila de campo claro y fluorescencia imágenes utilizando un objetivo 20X se centró en la vejiga natatoria.
      1. Establecer los límites superior e inferior de forma que capturen toda la fluorescencia verde y roja visiblemente observable.
      2. Capturar imágenes en 2.0 microsegundos / píxel con pasos que son ≤ 4 micras. El aumento del tiempo por píxel y la reducción de la distancia entre los pasos (por ejemplo, 0,5 - 1,0 micra) aumenta la resolución de la imagen y la calidad.
      3. Generar una imagen en dos dimensiones mediante la fusión de las capas.
      4. Comparar el número de neutrófilos mpx-mCherry-positivas presentes in las vejigas natatorias de pez cebra IAV-infectada y se inyecta el control.

Resultados

Aquí, se proporcionan datos que muestran cómo la infección sistémica IAV en el pez cebra se puede utilizar para probar la eficacia del fármaco (Figura 1A). Los embriones en 48 horas después de la fertilización se inyectan con APR8 (figuras 1C, 1F), X-31 (figuras 1D, 1G), o NS1-GFP (Figuras 1H-1i) a través del conducto de Cuvier para iniciar una infección viral. Otra cohorte de embriones en 48 horas después de l...

Discusión

Para maximizar los beneficios obtenidos por el uso de un pequeño animal para modelar las interacciones huésped-patógeno humano, es importante formular preguntas e hipótesis de investigación prueba que aprovechan las ventajas inherentes del sistema modelo. Como modelo para la infección IAV humana, el pez cebra tiene varios puntos fuertes, incluyendo una alta fecundidad, la claridad óptica, receptividad en la detección de drogas, y la disponibilidad de líneas transgénicas que etiquetan las células inmunes como ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Instant Ocean	Spectrum Brands	SS15-10
100 mm x 25 mm sterile disposable Petri dishes	VWR	89107-632
Transfer pipettes	Fisherbrand	13-711-7M
Tricaine-S (MS-222)	Western Chemical
Borosilicate glass capillary with filament	Sutter Instrument	BF120-69-10
Flaming/Brown micropipette puller	Sutter Instrument	P-97
Agarose	Lonza	50004
Zanamivir	AK Scientific	G939
Dumont #5 forceps	Electron Microscopy Sciences	72700-D
Microloader tips	Eppendorf	930001007
Microscope immersion oil	Olympus	IMMOIL-F30CC
Microscope stage calibration slide	AmScope	MR095
MPPI-3 pressure injector	Applied Scientific Instrumentation
Stereo microscope	Olympus	SZ61
Back pressure unit	Applied Scientific Instrumentation	BPU
Micropipette holder kit	Applied Scientific Instrumentation	MPIP
Foot switch	Applied Scientific Instrumentation	FSW
Micromanipulator	Applied Scientific Instrumentation	MM33
Magnetic base	Applied Scientific Instrumentation	Magnetic Base
Phenol red	Sigma-Aldrich	P-4758
Low temperature incubator	VWR	2020
SteREO Discovery.V12	Zeiss
Illuminator	Zeiss	HXP 200C
Cold light source	Zeiss	CL6000 LED
Glass-bottom multiwell plate, 24 well	Mattek	P24G-0-13-F
Confocal microscope	Olympus	IX-81 with FV-1000 laser scanning confocal system
Fluoview software	Olympus
Prism v6	GraphPad
Influenza A/PR/8/34 (H1N1) virus	Charles River	490710
Influenza A X-31, A/Aichi/68 (H3N2)	Charles River	490715
Influenza NS1-GFP			Referenced in Manicassamy et al. 2010
Tg(mpx:mCherry)			Referenced in Lam et al. 2013