Utilizzando modelli di Zebrafish di umana virus infezioni allo schermo farmaci antivirali e caratterizzare host immune cellulo Risposte

Riepilogo

Systemic and localized zebrafish infection models for human influenza A virus are demonstrated. Using a systemic infection model, zebrafish can be used to screen antiviral drugs. Using a localized infection model, zebrafish can be used to characterize host immune cell responses.

Abstract

Each year, seasonal influenza outbreaks profoundly affect societies worldwide. In spite of global efforts, influenza remains an intractable healthcare burden. The principle strategy to curtail infections is yearly vaccination. In individuals who have contracted influenza, antiviral drugs can mitigate symptoms. There is a clear and unmet need to develop alternative strategies to combat influenza. Several animal models have been created to model host-influenza interactions. Here, protocols for generating zebrafish models for systemic and localized human influenza A virus (IAV) infection are described. Using a systemic IAV infection model, small molecules with potential antiviral activity can be screened. As a proof-of-principle, a protocol that demonstrates the efficacy of the antiviral drug Zanamivir in IAV-infected zebrafish is described. It shows how disease phenotypes can be quantified to score the relative efficacy of potential antivirals in IAV-infected zebrafish. In recent years, there has been increased appreciation for the critical role neutrophils play in the human host response to influenza infection. The zebrafish has proven to be an indispensable model for the study of neutrophil biology, with direct impacts on human medicine. A protocol to generate a localized IAV infection in the Tg(mpx:mCherry) zebrafish line to study neutrophil biology in the context of a localized viral infection is described. Neutrophil recruitment to localized infection sites provides an additional quantifiable phenotype for assessing experimental manipulations that may have therapeutic applications. Both zebrafish protocols described faithfully recapitulate aspects of human IAV infection. The zebrafish model possesses numerous inherent advantages, including high fecundity, optical clarity, amenability to drug screening, and availability of transgenic lines, including those in which immune cells such as neutrophils are labeled with fluorescent proteins. The protocols detailed here exploit these advantages and have the potential to reveal critical insights into host-IAV interactions that may ultimately translate into the clinic.

Introduzione

Secondo l'Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS), i virus influenzali infettano il 5-10% degli adulti e il 20-30% dei bambini ogni anno e causano 3-5 milioni di casi di malattie gravi e fino a 500.000 morti in tutto il mondo ^1. vaccinazioni annuali contro l'influenza rimangono l'opzione migliore per prevenire la malattia. Gli sforzi come il piano d'azione globale che hanno aumentato l'uso vaccino stagionale, la capacità di produzione di vaccini, e la ricerca e lo sviluppo in più potenti strategie vaccinali al fine di ridurre la morbilità e la mortalità associate con focolai di influenza stagionale ^2. I farmaci antivirali come gli inibitori della neuraminidasi (ad esempio Zanamivir e Oseltamivir) sono disponibili in alcuni paesi e si sono dimostrati efficaci nei sintomi attenuanti, quando somministrato entro le prime 48 ore di insorgenza ^{3, 4, 5.} Nonostante gli sforzi a livello mondiale, il contenimento dell'influenza stagionale outbreaks rimane una sfida formidabile in questo momento, come virus dell'influenza deriva antigenica spesso supera capacità attuali di adattarsi al cambiamento genoma del virus ^6. strategie vaccinali di targeting di nuovi ceppi di virus devono essere sviluppate in anticipo e sono a volte resi meno di ottimale efficace a causa di cambiamenti imprevisti nei tipi di ceppi che alla fine predominano in una stagione influenzale. Per queste ragioni, vi è una chiara necessità di sviluppare strategie terapeutiche alternative per contenere le infezioni e riducendo la mortalità. Con il raggiungimento di una migliore comprensione delle interazioni ospite-virus, potrebbe essere possibile sviluppare nuovi farmaci anti-influenzali e terapie adiuvanti ^{7, 8.}

L'host-influenza umana A interazione virus (IAV) è complessa. Diversi modelli animali di infezione umana IAV sono stati sviluppati in modo da ottenere una visione in l'interazione ospite-virus, inclusa,ing topi, cavie, ratti, criceti cotone, furetti e macachi ^9. Oltre a fornire dati importanti che hanno migliorato la comprensione delle dinamiche di accoglienza-IAV, ogni organismo modello possiede svantaggi significativi che devono essere considerati quando si tenta di tradurre le scoperte in medicina umana. Ad esempio, i topi, che sono il modello più diffuso, non facilmente sviluppano sintomi di infezione IAV-indotte quando infettati con il virus dell'influenza umana isolati ^9. Questo perché i topi non hanno il trofismo naturale per l'influenza umana isolati da cellule epiteliali del mouse esprimono alfa-2,3 legami acido sialico invece delle α-2,6 collegamenti acido sialico espressi sulle cellule epiteliali umane ^10. Le proteine emoagglutinina presenti in IAV ceppi umani favorevolmente legano ed entrano cellule ospiti cuscinetto legami alfa-2,6 acido sialico attraverso endocitosi mediata dai recettori ^{9, 11, 12, 13.} Di conseguenza, è ormai accettato che nello sviluppo di modelli murini per l'influenza umana, la cura deve essere presa per abbinare la tensione appropriata del mouse con il ceppo di influenza appropriata al fine di ottenere fenotipi di malattia che ricapitolano aspetti della malattia umana. In contrasto, cellule epiteliali del tratto respiratorio superiore furetti possiedono alfa-2,6 legami di acido sialico che assomigliano cellule umane ^14. Furetti infetti condividono molte delle caratteristiche patologiche e cliniche osservate nella malattia umana, compresa la patogenicità e trasmissibilità del virus ¹⁴ di influenza umana e ^{aviaria, 15.} Essi sono anche altamente suscettibili di prove di efficacia del vaccino. Tuttavia, il modello furetto per l'influenza umana ha diversi svantaggi principalmente legati alla loro dimensione e il costo di allevamento che fanno acquisizione di statisticamente signifidati sopraelevazione impegnativi. Inoltre, furetti hanno già mostrato differenze nella farmacocinetica di droga, la biodisponibilità e tossicità che rendono l'efficacia di prova difficile. Ad esempio, i furetti presentano tossicità per il canale ionico M2 amantadina inibitore ^16. Pertanto, è chiaro che nella scelta di un modello animale per studiare domande circa infezioni IAV umani, è importante considerare vantaggi e limiti intrinseci, e l'aspetto della interazione ospite-virus che è indagato.

Il zebrafish, Danio rerio, è un modello animale che fornisce opportunità uniche per studiare l'infezione microbica, ospiterà la risposta immunitaria, e potenziali terapie farmacologiche ^{17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28.} La presenza di acidi sialici α-2,6-legate sulla superficie delle cellule nel zebrafish suggerito la sua suscettibilità al IAV, che è stata confermata in studi infezione e ripreso in vivo utilizzando un ceppo reporter fluorescente di IAV ^19. In zebrafish IAV-infetti, un aumento dell'espressione dei antivirali ifnphi1 e MXA trascrizioni indicato che una risposta immunitaria innata era stato stimolato, e la patologia visualizzato da zebrafish IAV-infettati, incluso edema e la distruzione dei tessuti, era simile a quella osservata nelle infezioni influenzali umani . Inoltre, la IAV inibitore della neuraminidasi antivirali Zanamivir mortalità limitata e ridotta la replicazione virale in zebrafish ^19.

In questo rapporto, un protocollo per l'avvio del sistemainfezioni ic IAV in embrioni di zebrafish è descritto. Utilizzando Zanamivir a dosi clinicamente rilevanti come una prova di principio, è dimostrata l'utilità di questo zebrafish modello di infezione IAV per i composti di screening per l'attività antivirale. Inoltre, un protocollo per la generazione di un localizzata, epiteliale infezione IAV nel zebrafish nuotare vescica, un organo che è considerato anatomicamente e funzionalmente analogo al polmone mammiferi ^{21, 29, 30, 31,} è descritto. Usando questo modello di infezione IAV localizzata, il reclutamento dei neutrofili al sito di infezione possono essere monitorati, consentendo indagini il ruolo della biologia dei neutrofili nelle infezioni IAV e l'infiammazione. Questi modelli zebrafish integrano modelli animali esistenti di infezioni IAV umane e sono particolarmente utili per testare piccole molecole e le risposte delle cellule immunitarie a causa della possibilità di una maggiore spotere Istituti statistici, capacità di moderata a test high-throughput, e le capacità per monitorare il comportamento delle cellule immunitarie e la funzione di luce-microscopia.

Protocollo

Tutti i lavori devono essere eseguiti utilizzando il livello di biosicurezza 2 (o BSL2) standard descritti dai Centri statunitensi per il controllo delle malattie (CDC) e in conformità con le direttive stabilite dalla Institutional Animal Care e sull'uso di comitati (IACUC). Si prega di conferire con i funzionari competenti per garantire la sicurezza e la conformità.

1. Zebrafish Cura e manutenzione

1. Spawn zebrafish e raccogliere il numero necessario di embrioni per gli esperimenti. Quando necessario, vasche di allevamento di massa, come quelli descritti dal Adatto et al. ^32, possono essere impiegati per raccogliere un gran numero di embrioni evolutivamente-messa in scena.
2. Lasciare embrioni a svilupparsi fino stadio desiderato di sviluppo (48 ore post-fertilizzazione per un'infezione sistemica IAV [sezione 3] o 5 giorni dopo la fecondazione per una, nuotare infezione della vescica localizzata [sezione 4]) in piatti profondi Petri a bassa densità (< 100 embrioni / piatto) a 28 ° C in acqua uovo sterile contenente 60 mg / ml sale marino (es Instant Ocean) in acqua distillata.
   1. Rimuovere embrioni morti con pipette di trasferimento in plastica e cambiare uovo acqua al giorno per garantire la salute e lo sviluppo ottimale.

2. Preparazione dei Materiali e reagenti

1. Preparare un 4 mg / ml soluzione stock di Tricaine-S (aggiustare il pH a 7,0-7,4) in acqua distillata e autoclave. Conservare a 4 ° C.
2. Tirare capillari di vetro borosilicato con filamenti con un estrattore micropipetta (ad es Micropipetta Estrattore con le seguenti impostazioni: impostazione della pressione = 100, il calore = 550, tirare = [nessun valore], velocità = 130, tempo = 110).
   NOTA: Prima di rifilatura l'ago, la lunghezza da dove l'ago comincia a cono alla punta dell'ago sarebbe di circa 12-15 mm. Questo può variare, tuttavia, in base alle preferenze e applicazione. A lungo, conicità più graduale può essere preferibile a causa della maggiore capacità di perforare l'embrione e la ri ridottask della piegatura dell'ago o rottura.
3. Sciogliere 2 g di agarosio in acqua uovo 100 ml usando un forno a microonde. Fai piastre su cui allineare ed iniettare gli embrioni versando fuso agarosio in piatti profondi Petri e permettendogli di solidificare.
4. Fare un 10 mg / ml magazzino del Zanamivir in acqua priva di nucleasi. Aliquotare e congelare a -20 ° C.
5. Sciogliere 0,5 g di agarosio in acqua uovo 50 ml utilizzando un forno a microonde per rendere il montaggio degli embrioni di agarosio. Mantenere a bagnomaria a 50 ° C fino al momento dell'uso durante l'imaging.

3. sistemica IAV infezione (48 ore post-fecondazione)

ATTENZIONE: Tutto il personale di ricerca devono consultarsi con i loro supervisori e medici per quanto riguarda la vaccinazione prima di iniziare il lavoro con IAV.

1. dechorionate manualmente embrioni il giorno dell'esperimento utilizzando # 5 pinze. Fare attenzione a rimuovere e euthanize embrioni che sono stati feriti nel processo a 200 mg / ml di soluzione Tricaine.
2. preparazione of IAV per microiniezione
   NOTA: I ceppi che hanno dimostrato di infettare embrioni di zebrafish sono l'influenza A / PR / 8/34 (H1N1) (APR8), l'influenza A X-31 A / Aichi / 68 (H3N2) (X-31), e il reporter fluorescente ceppo di influenza NS1-GFP ^33. Dettagli sulla APR8 e X-31, e altri ceppi, si possono trovare presso il database Influenza Research
   1. Propagare il ceppo NS1-GFP di IAV in uova di gallina embrionate come descritto in precedenza ^{34, 35.} Raccogliere, un'aliquota, e titolare del liquido allantoico contenente IAV, e conservare a -80 ° C. Pre-titolati APR8 e X-31 virus possono essere acquistati in commercio.
      1. Poco prima infezione, rapidamente scongelare un'aliquota IAV nelle mani guantate e poi rapidamente mettere in ghiaccio per ridurre la perdita di titolo.
   2. diluizione virale
      1. Se si utilizza il APR8 o X-31 virus, diluire a 3,3 x 10 ⁶ uova dose infettiva 50% (DIU50) / ml in sterili, ghiacciata PBS supplemENTED con 0,25% di rosso fenolo (per aiutare nella visualizzazione) in una cappa a flusso laminare. Allo stesso tempo impostare un controllo contenente PBS sterile con il 0,25% rosso fenolo.
      2. Se si utilizza NS1-GFP ceppo ^33, diluire a ~ 1,5 x 10 ² formando la placca unità (PFU) per NL in sterile, ghiacciata PBS contenente 0,25% rosso fenolo (per aiutare nella visualizzazione) in una cappa a flusso laminare. Allo stesso tempo impostare un controllo contenente liquido allantoico da uova di gallina infette diluiti come il virus in PBS sterile con lo 0,25% rosso fenolo.
      3. Mantenere IAV sul ghiaccio fino al momento dell'uso.
   3. soluzione virus pipetta in aghi microiniezione utilizzando punte microloader appena prima dell'uso. Inserire l'ago microiniezione nel supporto adeguato dell'apparato di iniezione (ad es MPPI-3 sistema di iniezione a pressione).
   4. Durante la visualizzazione al microscopio stereo, clip delicatamente la punta dell'ago microiniezione con taglienti, sterilizzato # 5 pinze.
      NOTA: E 'raccoded che la punta microiniezione essere ritagliato a poco a poco.
   5. Premere il pedale del sistema di iniezione pressione e iniettare in una goccia di olio microscopio immersione in un vetrino micrometrico di calibrazione. Misurare il diametro della goccia. Calcolare il volume della goccia usando l'equazione V = 4 / 3πr ^3, dove V è il volume in nl ed r è il raggio in micron.
      NOTA: Se il diametro calo è troppo piccolo, vetro supplementare può essere tagliato o impostazioni di pressione e di sincronizzazione può essere regolata. Se il diametro di goccia è troppo grande, impostazioni di pressione e di temporizzazione possono essere regolati.
   6. Regolare impostazioni di pressione e di temporizzazione sull'iniettore pressione e / o Reclip la punta dell'ago fino a quando il volume di iniezione desiderato si ottiene (tipicamente 1-3 nl). impostazioni di pressione tra 20 e 30 impostazioni psi e durata degli impulsi tra 40 e 80 msec sono tipici. Regolare la contropressione in modo che contrasta pressione capillare, ma non perde IAV (pressione di rete pari a zero).
3. Allineare embrioni per iniezione
   1. Anestetizzare gli embrioni dechorionated a 200 mg / ml Tricaine.
   2. Una volta che il movimento cessa, trasferire 10-20 embrioni ad una piastra di agarosio al 2% (preparata nella sezione 2.3) con una pipetta di plastica. Utilizzare pipetta di plastica per rimuovere il liquido in eccesso.
   3. Allineare delicatamente embrioni per la microiniezione con un capillare fuoco lucido e vetro borosilicato sigillato. Utilizzando un microscopio stereo, embrioni delicatamente orientare in modo che il condotto di Cuvier o la vena posteriore cardinale è in linea con l'ago microiniezione (Figura 1A).
4. IAV microiniezione
   1. inserire delicatamente l'ago microiniezione nel condotto di Cuvier o la vena posteriore cardinale. Premere pedale per iniettare il volume desiderato di IAV nel sistema circolatorio dell'embrione (Figura 1A). Gli embrioni possono essere iniettati più di una volta, se necessario.
      NOTA: Il bolo iniezione deve essere travolti nella circolazione e distribbuite in tutto il corpo. Se il volume di iniezione raccoglie al sito di iniezione, rimuovere embrione da esperimento e Eutanasia.
   2. Ripetere iniezioni su diversi embrioni con la soluzione di controllo specifica per il ceppo di virus scelti. Per APR8 e X-31, utilizzare il controllo di cui al punto 3.2.2.1; per la NS1-GFP, utilizzare il controllo di cui al punto 3.2.2.2.
5. Trasferimento degli embrioni a piastre di Petri etichettati contenenti acqua uovo sterile e posto in incubatori a 33 ° C.
   NOTA: Infected embrioni devono essere coltivate a 33 ° C per sostenere la replicazione virale maggiore. Inoltre, l'incubazione a 33 ° C imita più da vicino la temperatura del tratto respiratorio superiore umana, che è in stretto contatto con temperature più basse in ambiente esterno ed è dove si verificano infezioni IAV. Gli embrioni possono ambientarsi ad un ampio intervallo di temperature ^34.

4. localizzato, vescica natatoria IAV infezione a Tg (mpx: mCherry) transgenici Zebrafish (5 giorni dopo la fecondazione)

1. Preparazione di IAV per microiniezione
   1. Diluire la tensione e la soluzione di controllo dell'iniezione NS1-GFP come descritto nella sezione 3.2.
   2. Preparare aghi come descritto nella sezione 2.2.
   3. Allineare Tg (mpx: mCherry) ³⁵ larve contenente vesciche natatorie gonfiati come descritto nel paragrafo 3.3 con la seguente eccezione. Allineate larve in modo tale che l'ago può forare la vescica natatoria e il virus può essere depositato nel posteriore della vescica natatoria, come precedentemente descritto ³⁶ (Figura 2A).
2. IAV microiniezione
   1. Inserire delicatamente l'ago microiniezione nella vescica natatoria e iniettare il volume desiderato (ad esempio 5 nl) verso la parte posteriore della struttura (Figura 2A).
      NOTA: Il bolo iniezione deve raccogliere verso il posteriore e bolla d'aria della vescica natatoria dovrebbe be spostato in avanti. espressione GFP dovrebbe iniziare ad essere osservato dopo l'iniezione 3 ore.
   2. Ripetere l'iniezione con soluzione di controllo specifica per il ceppo di virus scelti, come descritto nella sezione 3.4.2.
3. Trasferimento larve di piastre di Petri contenenti acqua uovo sterile e posto in incubatori a 33 ° C.

5. Il trattamento farmaco antivirale

NOTA: Il protocollo di seguito descrive il trattamento Zanamivir precedentemente mostrato in Gabor et al. ^19. Questo protocollo può essere modificato per lo screening altri farmaci antivirali e ha il potenziale per essere modificato per lo screening più composti in un piatto ben 96, formato ad alta produttività.

1. A 3 ore dopo l'infezione, sostituire l'acqua uovo di NS1-GFP e pesce di controllo-infettati con acqua uovo sterile contenente 0, 16,7 o 33,3 ng / ml Zanamivir.
   NOTA: Queste concentrazioni sono state scelte in modo da tentare di replicare i livelli fisiologici raggiunti FOamministrazione llowing di Zanamivir nei pazienti umani (100, 200, o 600 mg, IV, due volte al giorno o 10 mg per via inalatoria, due volte al giorno). Le concentrazioni sieriche nei pazienti umani variava 9,83-45,3 ng / ml ^36.
2. Nel corso di 5 giorni, cambiare l'acqua uovo ogni 12 ore e sostituire con acqua uovo sterile contenente la giusta quantità di Zanamivir.
3. Traccia corso di infezione.
   1. Anestetizzare zebrafish a 200 mg / ml Tricaine. Monitorare l'espressione GFP al microscopio a fluorescenza stereo per osservare visivamente differenze nei modelli di infezione tra i pesci IAV-infetti e di controllo e tra i pesci immersi nelle diverse concentrazioni di farmaci.
   2. Traccia morbilità e mortalità nel corso di 5 giorni.
      1. Registra osservazioni circa le dinamiche di infezione legati alla patologia della malattia, compresi i segni di letargia e prove di edema, differenze di pigmentazione, oculare e deformità cranio-facciali, e lordosi. patologia delle malattietipicamente diventa evidente nel controllo pesci infetti in post-iniezione 24-48, a seconda della quantità di virus iniettato. Raccogliere le immagini post-iniezione 24 ore.
      2. Ogni 24 ore per 5 giorni dopo l'infezione, registrare il numero di larve morte, morbosa, e sano. La morte è definito dall'assenza di un battito cardiaco discernibile. Tracciare i dati, se lo desideri. Ad esempio, i dati di scena come un grafico a barre in pila, con percentuali di pesci sani, morbosa, o morto tracciati sul l'asse y e il gruppo di trattamento sul l'asse x. ¹⁹
         NOTA: Le mortalità possono essere segnati da stime di sopravvivenza di Kaplan-Meier. A seconda dell'applicazione, può essere opportuno sviluppare approcci alternativi per la morbilità pesce di punteggio, tra cui una matrice di punteggio che può quantificare i livelli di morbilità in base alle suddette caratteristiche patologiche osservate.
      3. Consultare uno statistico di applicare le analisi statistiche appropriate.

6. la migrazione dei neutrofili

NOTA: Il protocollo di seguito descrive un metodo per il monitoraggio della migrazione dei neutrofili alla vescica natatoria a seguito di una localizzata, epiteliale infezione IAV. I metodi descritti possono essere modificati per verificare gli effetti di manipolazioni genetiche e chimiche. Usando questa tecnica, sarà possibile caratterizzare i meccanismi sottostanti comportamento neutrofili durante un'infezione IAV.

1. Montaggio Zebrafish per l'imaging
   1. Anestetizzare le larve di essere ripreso in 200 mg / ml Tricaine.
   2. Trasferire un individuo Tg (mpx: mCherry) larva che è stato infettato con NS1-GFP ad un pozzo di un 24 ben, piatto fondo di vetro in una piccola goccia d'acqua uovo (~ 50-100 ml). Ripetere con altri pesci IAV-infetto e di controllo.
   3. Lentamente aggiungere 1% mezzi di montaggio degli embrioni agarosio a ciascuna (sezione 2.5) e, facendo attenzione a non introdurre bolle di grandi dimensioni.
      1. Regolare delicatamente la posizione della larva modo che è montato su un lato.Goody e Henry ³⁷ descrivono come fare le sonde che funzionano bene in questa applicazione utilizzando perni di insetti che sono montati nei capillari di vetro borosilicato con filamenti e superglued a posto.
   4. Una volta che l'agarosio si indurisce, riempire delicatamente i singoli pozzi con acqua uovo contenente 200 mg / ml Tricaine.
   5. Con un microscopio confocale, cattura az serie pila di immagini campo chiaro e fluorescenza utilizzando un obiettivo 20X incentrata sulla vescica natatoria.
      1. Impostare i limiti superiore ed inferiore in modo che catturano tutti visibilmente osservabile fluorescenza verde e rosso.
      2. catturare immagini a 2.0 msec / pixel con passaggi che sono ≤ 4 micron. Aumentare il tempo per pixel e di ridurre la distanza tra i passaggi (ad esempio 0,5-1,0 micron) aumenta la risoluzione dell'immagine e la qualità.
      3. Generare una immagine bidimensionale unendo strati.
      4. Confrontare il numero di neutrofili MPX-mCherry-positive presenti in le vesciche natatorie di IAV-infetti e di controllo a iniezione zebrafish.

Risultati

Qui, vengono forniti dati che dimostrano come infezioni sistemiche IAV in zebrafish può essere utilizzato per testare l'efficacia dei farmaci (Figura 1A). Embrioni a 48 ore post-fertilizzazione sono iniettati con APR8 (figure 1C, 1F), X-31 (figure 1D, 1G), o NS1-GFP (Figure 1H-1I) attraverso il condotto di Cuvier di avviare una infezione virale. Un altro coorte di embrioni a 48 ore post-fertilizzazione sono stati in...

Discussione

Per massimizzare i benefici ottenuti dall'utilizzo di un piccolo animale di modellare interazioni ospite-patogeno umano, è importante per inquadrare domande di ricerca e ipotesi di test che capitalizzare i vantaggi intrinseci del sistema modello. Come modello per l'infezione IAV umana, il pesce zebra ha diversi punti di forza, tra cui ad alta fecondità, chiarezza ottica, subordinazione al vaglio di farmaci, e la disponibilità di linee transgeniche che etichetta le cellule immunitarie come neutrofili. Il zebra...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Instant Ocean	Spectrum Brands	SS15-10
100 mm x 25 mm sterile disposable Petri dishes	VWR	89107-632
Transfer pipettes	Fisherbrand	13-711-7M
Tricaine-S (MS-222)	Western Chemical
Borosilicate glass capillary with filament	Sutter Instrument	BF120-69-10
Flaming/Brown micropipette puller	Sutter Instrument	P-97
Agarose	Lonza	50004
Zanamivir	AK Scientific	G939
Dumont #5 forceps	Electron Microscopy Sciences	72700-D
Microloader tips	Eppendorf	930001007
Microscope immersion oil	Olympus	IMMOIL-F30CC
Microscope stage calibration slide	AmScope	MR095
MPPI-3 pressure injector	Applied Scientific Instrumentation
Stereo microscope	Olympus	SZ61
Back pressure unit	Applied Scientific Instrumentation	BPU
Micropipette holder kit	Applied Scientific Instrumentation	MPIP
Foot switch	Applied Scientific Instrumentation	FSW
Micromanipulator	Applied Scientific Instrumentation	MM33
Magnetic base	Applied Scientific Instrumentation	Magnetic Base
Phenol red	Sigma-Aldrich	P-4758
Low temperature incubator	VWR	2020
SteREO Discovery.V12	Zeiss
Illuminator	Zeiss	HXP 200C
Cold light source	Zeiss	CL6000 LED
Glass-bottom multiwell plate, 24 well	Mattek	P24G-0-13-F
Confocal microscope	Olympus	IX-81 with FV-1000 laser scanning confocal system
Fluoview software	Olympus
Prism v6	GraphPad
Influenza A/PR/8/34 (H1N1) virus	Charles River	490710
Influenza A X-31, A/Aichi/68 (H3N2)	Charles River	490715
Influenza NS1-GFP			Referenced in Manicassamy et al. 2010
Tg(mpx:mCherry)			Referenced in Lam et al. 2013