イムノアッセイのための3次元紙ベースのマイクロ流体デバイスの作製

要約

我々詳細イムノアッセイの開発で使用するための三次元の紙ベースのマイクロ流体デバイスを製造する方法。装置アセンブリへの我々のアプローチは、多層の種類、添加剤の製造です。我々は、紙ベースのデバイスのこれらの種類の代表的な結果を提供するためのサンドイッチイムノアッセイを示します。

要約

紙は、毛細管現象による自律的に流体を発散します。疎水性の障壁で紙をパターニングすることによって、流体の輸送を制御することができ、紙の層内に向かいます。また、パターン化された紙の複数の層を積層することは、分析および生物分析アッセイの開発を支援することができる洗練された3次元マイクロ流体ネットワークを作成します。紙ベースのマイクロ流体デバイスは使いやすく、ポータブル、安価であり、かつ動作させるために外部機器を必要としません。その結果、彼らは、ポイントオブケア診断のためのプラットフォームとして非常に有望です。適切ユーティリティと紙ベースのデバイスの分析性能を評価するために、適切な方法は、その製造が再現可能な実験室の設定に適したスケールであることを確認するために開発されなければなりません。本稿では、紙ベースの免疫測定法に使用することができる一般的なデバイス構造を作製する方法が記載されています。私たちは、添加剤manufacturinの形式を使用しますG（多層積層体）は、パターン化された紙とパターン化接着剤の複数の層を含むデバイスを作製しました。ヒト絨毛性ゴナドトロピン（hCG）のための免疫測定法を用いてこれらの三次元の紙ベースのマイクロ流体デバイスの適切な使用を示すことに加えて、デバイスの故障をもたらすことができる製造工程における誤差が議論されています。私たちは、限られたリソースの設定のために特別に設計された分析アプリケーションの開発において広範な有用性を見出すであろう紙ベースのデバイスを製造するためのこのアプローチを期待しています。

概要

紙は、製剤または等級の範囲内で広く利用可能で調整するために、そのプロパティを官能化することができ、毛細管現象またはウィッキングによって自律的に流体を輸送することができます。紙は疎水性物質（ 例えば 、フォトレジスト¹またはワックス^2）でパターン化されている場合、流体のウィッキングは、紙の層内に空間的に制御することができます。例えば、印加された水性サンプルは、紙の中に格納された化学的および生化学的な試薬と反応させるために、異なるゾーンの数に向けることができます。これらの紙ベースのマイクロ流体デバイスは、ポータブルで安価な分析アッセイ^{3、4、5、6、7}の開発に有用なプラットフォームであることが実証されています。紙ベースのマイクロ流体デバイスのアプリケーションでは、ポイントオブケア診断を含みますEF "> 8、環境汚染物質のモニタリング^9、偽造医薬品^10、および非局在化医療（またはの検出「限られたリソースの設定¹¹における遠隔医療」）。

パターン化された紙の複数の層は、その入口及び出口連結された、または独立したままにすることができる連続的な流体ネットワークを形成するように接続する親水性ゾーンの隣接層から（ すなわち 、上または下）の集積装置に組み立てることができます。 ¹²各層は単一のデバイス上で実行される試薬及び複数のアッセイの空間的分離を可能にするユニークなパターンを含むことができます。得られた3次元マイクロ流体デバイスだけでなく、分析的アッセイを可能にするために流体をウィッキングすることが可能である（ 例えば 、肝機能は^、13および小分子¹⁴の電気化学的検出をテストし）、それがSUPこともできますポート洗練された機能の数は、従来のマイクロ流体のアプローチに共通する（ 例えば ^、15および簡単な機械^弁16）。紙は、毛管現象によって流体を発散するので重要なことには、これらのデバイスは、ユーザからの最小限の労力で操作することができます。

試薬は、紙ベースのデバイスの三次元構造内に格納することができるので、複雑なプロトコルは、デバイスへの水性サンプルの単一添加にすることができます。最近、我々は、パターン化層を作成するために、ワックス印刷技術を使用して紙ベースのイムノアッセイの開発に使用することができる一般的な3次元デバイスのアーキテクチャを導入しました。積層デバイス数の設計に関連する側面は、層の組成、及び3次元マイクロ流体ネットワーク制御全体のあたりのパターン使用方法に焦点を当てた^17、18これらの研究イムノアッセイのフォーマンス。最終的に、我々は、多重化イムノアッセイ¹⁹の急速な発展を促進するために、これらの設計ルールを使用することができました。本稿では、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（hCG;妊娠ホルモン）のために以前に開発されたイムノアッセイ^17は、我々は、三次元の紙ベースのイムノアッセイの組立及び製造のために開発した戦略を説明するために例として使用されます。したがって、我々は、アセンブリと操作デバイスのではなく、アッセイの開発に焦点を当てます。

hCGを検出するために使用されるフォーマットであるサンドイッチイムノアッセイにおいて、ホルモンのサブユニットに特異的な捕捉抗体は、サンプルまたは後続の試薬の非特異的吸着を制限するためにブロックされている固体基板上にコーティングされます。この基板は、ほとんどの場合（酵素結合免疫吸着アッセイまたはELISAのために、例えば 、）ポリスチレンマイクロウェルプレートです。次いで、試料をありますウェルに添加し、一定期間インキュベートしました。厳密な洗浄の後、hCGの他のサブユニットに特異的な抗体を加え、インキュベートします。この検出抗体は、測定可能な信号を生成するために、コロイド粒子、酵素、または蛍光団に結合体化され得ます。ウェルを再び前（ 例えば 、プレートリーダーを用いて）アッセイの結果を解釈するために洗浄されます。市販のキットは、この時間のかかる多段階プロセスに依存しているが、これらのステップをすべてのユーザーに最小限の介入で紙ベースのマイクロ流体デバイス内で迅速に行うことができます。

hCGの免疫測定法に使用される装置は、試料添加、共役ストレージ、インキュベーション、捕獲、洗浄、及びブロット（ 図1）に使用される上から下に、6つの活性層を備えます。試料添加層を定性濾紙から作られます。これは、液体試料の導入を容易にし、共役レーに試薬を保護します環境やユーザによる偶然の接触による汚染からR。複合体層（定性濾紙）は、イムノアッセイ用の発色試薬（ 例えば 、金コロイド標識抗体）を保持します。インキュベーション層（定性濾紙）は、サンプルが次の層、捕捉層に到達する前に試薬と検体の結合を促進するために、紙の平面内で横方向に移動することを可能にします。捕獲層（ナイロン膜）が材料に吸着し、分析物に特異的なリガンドが含まれています。分析が完了した後、この層は、完成した免疫複合体の可視化を可能にするために明らかにされます。洗浄層（定性ろ紙）が離れブロット層（厚さのクロマトグラフィー紙）への捕獲層の面から自由に共役試薬を含む過剰の流体を描画します。 ASSEMの完全性を維持する永続的な接着剤4の層：6層装置は、パターン、両面接着の5層によって一緒に保持されています採血装置およびリムーバブル接着剤の1層は、捕捉層にイムノアッセイの結果を検査する装置の剥離を容易にします。

本稿の目的のために、我々は関係の専用の議論を可能にする紙ベースの免疫測定法の代表的な結果を提供するためのhCG（それぞれ0 MIU / mLおよび81 MIU / mLで）のみ陰性および陽性対照サンプルを使用します製造方法及び装置の性能。成功したデバイスを製造する方法を示すことに加えて、我々は、デバイスまたは再生不可能なアッセイ結果の故障につながる可能性がいくつかの製造誤差を強調表示します。この原稿で詳述したプロトコルとの議論は、紙ベースのイムノアッセイを設計・製造されているどのように貴重な洞察を持つ研究者を提供します。私たちは、イムノアッセイに私たちのデモを集中しながら、我々は、本明細書に提示ガイドラインは3-DIMENの製造に広く有用であろうと予想していますsional紙ベースのマイクロ流体デバイス。

プロトコル

紙ベースのマイクロ流体デバイス層の調製

1. グラフィックデザイン・ソフトウェア・プログラムを使用して、紙、ナイロン、および接着剤の層のためのパターンを準備します。 ⁶各層は異なるパターンを有することができます。
   注：パターンは、機能紙ベースの免疫測定法のために必要とされていない位置合わせ穴を含むが、三次元デバイスの再現可能な製造を支援することができます。デバイスがストリップで、または完全なシートとして、個別に組み立てられている場合は、これらの穴の配置が異なります。パターンを設計するために使用されるソフトウェアプログラムは、パターニング技術（ 例えば 、フォトリソグラフィー、ワックス印刷、または切断）の選択に基づいて変化し得ます。 ⁶
2. 70％（v / v）のエタノールおよび水の溶液で作業領域をスプレー。清潔なペーパータオルで作業領域を拭いてください。

紙層の調製：試料添加、共役ストレージ、インキュベーション、および洗浄レイヤー

1. 大型卓上ペーパーカッターを用いて定性ろ紙の層を準備します。固体インク（ワックス）プリンタを使用してパターン形成を容易にするために、標準の用紙サイズに用紙のストックシートをカット。例えば、単一の460 X 570ミリメートル²シートは、USレター用紙（8.5×11インチ^2）の4枚を作ることができます。汚染を最小限に抑えるために、すべての回で清潔な手袋をした紙を扱います。
2. プリンタトレイにクロマトグラフィー紙のカット紙をセットします。印刷以前に設計された層（ 図1を参照）。
   注：パターンは、自動送りを使用して、このシート上に直接印刷することができます。唯一の一枚の紙は、紙詰まりを避けるために、一度に印刷する必要があります。全ての層については、「拡張」の印刷設定を使用します。

ナイロン膜層の調製：キャプチャー・レイヤ

1. ^（2 7.5×10インチ）卓上ペーパーカッターを使用してシート状にナイロン膜のストックロールをカットします。ナイロンの取り扱いに細心の注意を払いますその完全性を維持し、リッピングから保護するための膜。ナイロン膜は水分に敏感であるため、デシケーターキャビネット内の任意の未使用の材料を保管してください。
   注：カットシートは、USレター用紙よりも狭いです。ナイロン膜は薄くて壊れやすいので、直接プリンタで処理され、サポートを必要とすることはできません。詳細は後述します。
2. ワックスのプリンタを使用して、コピー紙の上に捕獲層パターンを印刷し、それをナイロン膜の位置決めのためのガイドとして機能するライトボックスにテープで固定します。ライトボックスは、複数の層の位置合わせを助けます。
3. コピー用紙の先に印刷されたシート上にコピー紙のクリーンシートを置きます。ライトボックスに紙のクリーンシート、テープではなく、テープ2枚一緒に行います。
4. コピー用紙のクリーン片上にナイロン膜のカットシートを配置します。膜は、コピー用紙の最下層の印刷領域をカバーしていることを確認してください。テープクリーンシートにナイロン膜の四方コピー用紙の。
   注：印刷（ 例えば 、紙詰まりやワックスの印字ムラ）に問題がないように、ナイロン膜が平滑であることを確認します。ワックスは、ナイロン膜は、コピー用紙に付着されたテープに印刷することができます。この問題が発生した場合、ナイロンが不完全に起因するテープ・カバレッジにパターン化された領域は破棄されるべきです。将来の調製のために、ナイロン膜のより大きな片をこの印刷エラーを回避するために使用することができます。
5. 手差しプリンタートレイに（それに固定されたコピー用紙でサポートされている）ナイロン膜のシートをロードします。一度にナイロン膜の一枚だけを印刷します。
   注：それはパターン化されていないようブロット層のために必要な一切の調製工程は、ありません。

4.印刷層における疎水性の障壁を作成します

1. 重力対流オーブン内に置いたときにテープ層の上下に均一な加熱のためにアクリルフレームに層を印刷しました。にテープで留めナイロン膜を保ちますワックスが溶融され、疎水性の障壁を形成した後まで、コピー紙の支持体シート。
   注：アクリルフレームは1/2のカスタムメイド、レーザー切断片である」。。厚手のアクリルプラスチック製造されるデバイスの数に応じて、2つのフレームサイズを使用したより小さなフレームの外枠は11 5/8を測定します」 ×2 3/4×1 3/4 "、およびフレームの内側の穴が10 3/8を測定する" "×8 7/8」。大きなフレームの外側の境界線は11 5/8を測定し」、および内部フレームの穴は "×7 7/8" 10 1/4を測定します。オープン、内部空間があっても、紙の厚さ全体にわたってワックスの融解を可能にします。
2. ワックスは、紙の厚さに溶けるまで30秒間150℃のオーブンでレイヤーを配置します。ワックスはそれを裏返し、設計の欠陥をチェックすることによって、紙の厚さに浸透していることを確認してください。
   注：強制空気炉またはホットプレートは、固体ワックスインクを溶融するのに使用することができます。融解回または温度が加熱方法に依存して変化し得ます。
3. アクリルフレームから紙やナイロン膜を削除します。また、コピー用紙の支持シートからナイロン膜を除去します。

接着剤層の5準備

1. 以前に（ステップ1.1）を調製した設計ファイルを使用してロボットナイフプロッタを使用して接着フィルムのパターン両面シート、。ワックスライナーのシートを使用して、任意の露出した接着剤の表面を保護します。
   注：両面接着は、サンプルが連続流体経路などの層を通って流れることを可能にする穴でパターン化されるべきです。ワックスライナーが容易に接着剤から除去し、切断中の汚染および引き裂きから保護する働きをします。レーザーカッター、又はダイプレスはまた、接着フィルムのパターン層に使用することができます。

接着剤でデバイス層の6バッキング

1. 70％（v / v）のエタノールおよび水の溶液でライトボックスを吹き付けます。きれいな紙トンで拭きますowel。
2. テープ印刷面を下にしてライトボックスに接着剤で裏打ちする必要があり、紙またはナイロン膜のパターン層。
3. 接着剤のパターンシートから保護ライナーの剥離片側と紙またはナイロン膜の層にそれを貼り付けます。パターンの適切な位置合わせを確実にするために、光ボックスを使用します。一緒に押します。保護スリップに部分的に組み立てられた装置を配置します。
   注：保護スリップは、彼らがラミネータローラーに接触しないことを確実にすることによって、汚れや破損からデバイスを保護するラミネートフィルムバッキングの折り返し部分です。
4. 隣接層からの空気のいずれかのポケットを除去して、完全に一緒に接着剤と紙を押して、自動ラミネーターを通して得られた二層接合体を渡します。
   注：デバイスの層の間のエアポケットが漏れを引き起こすことによって、デバイスの整合性と発散性に優れた再現性を妨害することができます。

コンジュゲートLの7治療前装置アセンブリへの免疫アッセイのための試薬とのアヤ

1. 親水性ゾーンが治療されるようなアクリルフレームにテープ複合体層は、フレームとの接触中に懸濁していません。
2. 複合体層上の親水性領域に1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で100 mg / mlウシ血清アルブミン（BSA）2.5μLを加えます。それは2分間室温で乾燥した後、5分間65℃にすることを可能にします。
   注：このボリュームは、紙のゾーンを濡らすことだけで十分です。 BSA溶液は、紙や試薬がサンプルによって再水和されたときにナノ粒子の放出を容易にする、乾燥工程中に、コロイド状ナノ粒子の凝集を防止するのに役立ちます。
3. 抗β-hCGの抗体に結合した5 ODコロイド金ナノ粒子の5μlを添加し、乾燥工程を繰り返します。
   注：コロイド状金ナノ粒子の濃度の単位はしばしばabsoにより測定される光学密度（OD）として表されますλ= 540 nmでrbance。いいえ処理はセクション10内のデバイスの組み立て前ウィックパッドのために必要とされません。

イムノアッセイ用の試薬と横方向チャンネルの8治療装置アセンブリの前に

1. 親水性ゾーンが治療されるようなアクリルフレームにテープの横方向チャネル層は、フレームとの接触中に懸濁していません。
2. エージェントブロッキングを10μl加える（5 mg / mlで無脂肪乳および0.1％の（v / v）の1×PBS中にTween 20）で横方向のチャネルを処理します。共役層として（5分間65℃で、次いで室温で2分と）同じ乾燥工程を繰り返します。

免疫アッセイのための試薬で捕獲層の9治療装置アセンブリの前に

1. 親水性ゾーンが治療されるようなアクリルフレームにテープ捕獲層は、フレームとの接触中に懸濁していません。
2. 1mg / mlの抗α-hCGの抗体の5μLで捕獲層を扱い、その後許可試料を65℃で8分間、続いて2分間室温で乾燥させます。
3. ブロッキング剤の2μLを加える（5 mg / mlで無脂肪乳および0.1％（v / v）を1×PBS中のTween 20）。捕獲層のための乾燥工程を繰り返します。
   注：この量が多すぎるブロッキング剤を使用する場合に発生する可能性ナイロン膜の細孔を閉塞することなく紙、コートに適切です。

三次元の紙ベースのマイクロ流体デバイスの10議会

1. ライトボックスに洗浄層をテープ（印刷面が上向きに）。位置合わせ穴を使用する場合、手持ち穴パンチツールを使用して、次の層から取り除きます。
2. 接着剤を露出させるために捕獲層の裏面に保護フィルムを取り外します。ガイドとして位置合わせ穴を使用して洗浄層の上方捕獲層を合わせます。 2つの層を一緒に押します。デバイスへの汚染や損傷を最小限にするために親水ゾーンに触れないようにしてください。ピンセットassembを支援するために使用することができますLY。
3. 接着剤を露出させるためにインキュベーション層の裏面に保護フィルムを取り外します。捕獲層の上にインキュベーション層を合わせ、それらを一緒に押します。すべてのアクティブな層が組み立てられるまで、このようにレイヤーを追加し続けます。
4. 保護スリップに部分的に組み立てられた装置を置き、しっかりとラミネーターを使用して層を一緒に貼り付けます。
5. 洗浄層の裏面に保護フィルムを取り外し、デバイスの底部にブロット層を貼り付けます。繰り返し積層工程10.4三次元の紙ベースのマイクロ流体デバイスの組み立てを完了する。切り取りストリップまたはハサミを用いて完全に組み立てられた装置のシートからデバイスの数を所望します。
   注：デバイスの完全なシート装置のストリップ、または単一のデバイスは、同様の手法を用いて調製することができます。

紙ベースのイムノアッセイを実行する11

1. デバイスの上に親水ゾーンに20μlのサンプルを追加します（ つまり 、トン彼は）層をサンプリングします。
2. その後、装置内に完全に芯（1×リン酸緩衝生理食塩水で0.05％（v / v）のTween 20）で洗浄緩衝液15μLを追加するために、サンプルを待ちます。洗浄バッファーの最初のアリコートを装置内に完全に吸い上げた後、洗浄緩衝液の第二の15μlのアリコートを追加します。
   注：洗浄緩衝液は、液滴が紙の表面にはメニスカスを示さない、消えてしまったデバイスに完全に邪悪されています。洗浄緩衝液の第二のアリコートを完全に装置に入ったときにアッセイが完了する。
3. アッセイの結果を明らかにするために、捕捉層を露出させるためにピンセットを使用してデバイスの三トップ層をはがし。
   1. 色の有無を観察することにより、定性的アッセイの結果を解釈します。あるいは、結果を定量化し、範囲内の強度の分布を特徴付けるために、デスクトップスキャナ用画像処理ソフトウェア又はアルゴリズムを用いて画像再生層検出ゾーン。 ²⁰

結果

3次元の紙ベースのマイクロ流体デバイスで再現可能なアッセイ性能を得ることは、デバイス間の一貫性を保証する製造方法に依存しています。この目標に向かって、我々は、製造プロセスおよび材料の考慮事項の数を特定しており、紙ベースのイムノアッセイを実証するのコンテキストでそれらをここで議論します。私たちは、紙ベースのマイクロ流体デバイス（ <...

ディスカッション

再現可能な製造戦略を識別することはアッセイ開発の必須成分です。 ^22は、我々は3次元の紙ベースのマイクロ流体デバイスを製造するために、順次、層ごとのアプローチを使用します。 （ⅰ）複数の材料がする方法に変更することなく、単一のデバイス・アーキテクチャに組み込むことができます：紙²³の単一のシートから多層デバイスを製造するための...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Illustrator CC	Adobe		to design patterns for layers of paper and adhesive
Xerox ColorQube 8580 printer	Amazon	B00R92C9DI	to print wax patterns onto layers of paper and Nylon
Isotemp General Purpose Heating and Drying Oven	Fisher Scientific	15-103-0509	to melt wax into paper
Artograph LightTracer	Amazon	B000KNHRH6	to assist with alignment of layers
Apache AL13P laminator	Amazon	B00AXHSZU2	to laminate layers together
Graphtec CE6000 Cutting Plotter	Graphtec America	CE6000-40	to pattern adhesive films
Swingline paper cutter	Amazon	B0006VNY4C	to cut paper or devices
Epson Perfection V500 photo scanner	Amazon	B000VG4AY0	to scan images of readout layer
economy plier-action hole punch	McMaster-Carr	3488A9	to remove alignment holes
Whatman chromatogrpahy paper, Grade 4	Sigma Aldrich	WHA1004917
Fisherbrand chromatography paper (thick)	Fisher Scientific	05-714-4	to function as blot layer
Immunodyne ABC (0.45 µm pore size )	Pall Corporation	NBCHI3R	to function as material for capture layer
removable/permanent adhesive-double faced liner	FLEXcon	DF021621	to facilitate peeling
permanent adhesive-double faced liner	FLEXcon	DF051521
wax liner	FLEXcon	FLEXMARK 80 D/F PFW LINER	to assist with patterning adhesive
acrylic sheet	McMaster-Carr	8560K266	to fabricate frame
self-adhesive sheets	Fellowes	CRC52215	to use as protective slip
absolute ethanol	VWR	89125-172	to sanitize work area
bovine serum albumin	AMRESCO	0332
Sekisui Diagnostics OSOM hCG Urine Controls	Fisher Scientific	22-071-066	to use as positive and negative samples
anti-β-hCG monoclonal antibody colloidal gold conjugate (clone 1)	Arista Biologicals	CGBCG-0701	to treat conjugate layer
goat anti-α-hCG antibody	Arista Biologicals	ABACG-0500	to treat capture layer
10X phosphate buffered saline	Fisher Scientific	BP3991
Oxoid skim milk powder	Thermo Scientific	OXLP0031B
Tween 20	AMRESCO	M147