면역 측정법에 대한 3 차원 종이 기반 미세 유체 장치의 제작

요약

우리는 구체적 방법은 면역 분석법의 개발에 사용하기위한 입체 종이 기반의 미세 유체 소자를 제작한다. 장치 어셈블리에 대한 우리의 접근 방식은 다층의 종류, 첨가제 제조입니다. 우리는 종이 기반 디바이스의 이러한 유형의 대표적인 결과를 제공하는 샌드위치 면역 분석을 보여준다.

초록

용지가 모세관 현상에 자율적 유체 심지. 소수성 장벽 용지를 패터닝함으로써, 유체의 이동을 제어 할 수 있고, 종이의 층 내에 지시. 또한, 패턴 종이의 여러 층을 적층하는 분석 및 생체 시료 분석법의 개발을 지원할 수있는 정교한 입체 미세 유체 네트워크를 만듭니다. 종이 기반 미세 유체 장치는 사용하기 쉽고, 휴대용, 저렴하고 작동 외부 장비를 필요로하지 않습니다. 그 결과, 그들은 포인트의 케어 진단을위한 플랫폼으로 큰 약속을 잡으십시오. 적절 유틸리티 및 종이 기반 분석 장치의 성능을 평가하기 위해, 적절한 방법은 그의 제조를 재현성 실험 설정에 적합한 배율로 확인하기 위해 개발되어야한다. 이 논문에서, 방법은 종이 기반 면역 분석에 사용할 수있는 일반적인 디바이스 구조에 대하여 설명한다 제조한다. 우리는 첨가제 필림의 양식을 사용g (다층 적층)을 패터닝 용지 패터닝 접착제의 다중 층을 포함하는 장치를 제조 하였다. 인간 융모 성 성선 자극 호르몬 (hCG의)에 대한 면역 이러한 입체 종이 기반의 미세 유체 장치의 적절한 사용을 입증 이외에도, 장치 오류가 발생할 수있는 제조 공정에있어서 오차가 논의된다. 우리는 제한된 리소스 설정을 위해 특별히 설계된 분석 애플리케이션의 개발에 다양한 유틸리티를 찾을 종이 기반 장치를 제조하는이 방법을 기대합니다.

서문

용지 제형 또는 등급의 범위로 조정하고 그 특성을 작용 화 될 수 있고, 모세관 위킹 또는 자율적으로 액체를 수송 할 수 널리 사용할 수있다. 용지가 소수성 물질을 패터닝하는 경우 (예를 들어, 포토 레지스트 ⁽¹⁾ 왁스 또는 ²⁾ 유체의 위킹은 종이의 층 내에서 공간적으로 제어 할 수있다. 예를 들어,인가 된 수성 샘플은 용지 내에 저장된 화학적 및 생화학 시약과 반응 상이한 영역들로 지향 될 수있다. 이들은 종이 기반의 미세 유체 장치는 휴대용 저렴 분석적 분석법 ^{3, 4, 5, 6, 7의} 개발을위한 유용한 플랫폼으로 입증되었다. 종이 기반 미세 유체 장치의 응용 프로그램은 현장 진료 진단을 포함EF "> 8, 환경 오염 물질 ⁹ 모니터링, 위조 의약품 ^(10)의 감지 및 비편 재화 의료 (또는"원격 의료 ") 제한된 자원의 ¹¹ 설정을 선택합니다.

패턴 종이의 여러 층이 인접 층 (즉, 아래 위 또는)에서 친수성 영역이 그 입구 및 출구에 연결 또는 독립 남아있을 수 있습니다 연속 유체 네트워크를 형성하기 위해 연결하는 통합 장치로 조립 될 수있다. ⁽¹²⁾ 각 층은 단일 장치에서 수행되는 시약 및 다중 분석법의 공간 분리를 가능하게하는 고유의 패턴을 포함 할 수있다. 얻어진 삼차원 미세 유체 소자뿐만 아니라 분석 시험 법을 사용하는 액체를 흡상 할 수있다 (예를 들면, 간 기능 ⁽¹³⁾ 및 작은 분자 ^(14)의 전기 화학적 검출을 시험), 그러나 그것은 또한 수 SUP포트 고기능화 다수의 전통적인 접근법 미세 공통 (예, ¹⁵ 및 간단한 기계 ^{밸브 (16)).} 용지가 모세관 작용에 의해 체액을 심지 때문에 중요하게, 이러한 장치는 사용자로부터의 최소한의 노력으로 작동 될 수있다.

시약 종이 기반 장치의 3 차원 구조 내에 저장 될 수 있기 때문에, 복잡한 프로토콜은 장치 수성 샘플의 단일 첨가로 감소 될 수있다. 최근에는 패턴 층을 만드는 왁스 인쇄 기법을 이용하여 종이 기반 면역 분석법의 개발에 사용될 수있는 일반적인 3 차원 디바이스 구조를 도입 하였다. 적층의 장치 번호의 설계 관련 양태에서, 층의 조성, 상기 3 차원 미세 네트워크 제어 당 전체의 패턴을 사용하는 방법에 초점 ^{(17) (18)} 이러한 연구면역 측정법의 formance. 결과적으로, 우리는 면역 다중화 ^(19)의 신속한 개발을 용이하게하기 위해 이러한 디자인 규칙을 사용할 수 있었다. 이 논문에서, 인간 융모 성 성선 자극 호르몬 (hCG의, 임신 호르몬)을위한 이전에 개발 된 면역 ¹⁷ 우리 입체 종이 기반 면역의 조립 및 제조를 위해 개발 한 전략을 설명하기위한 일례로서 사용된다. 따라서, 우리는 디바이스보다는 분석의 개발의 조립 작업에 초점을 맞춘다.

hCG의 호르몬의 하나의 서브 유닛은 다음 샘플 또는 후속 시약의 비특이적 흡착을 제한하는 차단 된 고체 기판 상에 코팅 된 특정 캡쳐 항체를 검출하기 위해 사용되는 형식 인 샌드위치 면역 측정법에서는. 이 기판은 대부분 (효소 결합 면역 분석 또는 ELISA에 대한 예) 폴리스티렌 마이크로 웰 플레이트이다. 샘플은 다음이다우물에 첨가하고, 일정 시간 동안 배양시켰다. 엄격한 세척 후, hCG의 다른 소단위에 특이적인 항체를 첨가하고, 배양 허용된다. 이는 검출 항체가 측정 신호를 생성하기 위해 콜로이드 입자, 효소 또는 형광 물질에 접합 될 수있다. 잘 다시 이전 (예를 들면, 플레이트 리더를 사용하여)을 분석의 결과를 해석로 세척한다. 상업용 키트이 시간 소모적 인 다단계 공정에 의존하지만,이 단계의 모든 사용자에게 최소의 개입 종이 기반 마이크로 유체 장치를 빠르게 수행 할 수있다.

hCG의 면역에 사용 된 장치는 샘플 이외에, 접합체 저장소, 배양, 캡처 씻어 블롯 (도 1)에 사용되는 위에서 아래로, 여섯 활성층을 포함한다. 샘플 또한 층은 질적 여과지에서 이루어집니다. 이 액체 시료의 도입을 용이하게 공액 Laye의 상기 시약을 보호사용자가 환경이나 우발적 인 접촉에서 오염 연구. 공액 층 (질적 여과지)를 면역 대한 발색 시약 (예를 들어, 금 콜로이드 표지 항체)를 보유하고있다. 배양 층 (질적 여과지) 샘플이 다음 층, 포획 층에 도달하기 전에 시약과 분석 물질의 결합을 촉진하는 종이면 내에서 측 방향 이동 할 수있다. 캡처 층 (나일론 막) 재료에 흡착 된 분석에 대한 특정 리간드가 포함되어 있습니다. 분석이 완료된 후,이 층은 완성 된 면역 복합체의 시각화를 가능하게 드러난다. 세척 층 (정성 여과지는) 떨어진 오 층 (두께 크로마토 그래피 용지)에 캡처 층의 얼굴에서 무료 복합체 시약을 포함 초과 액체를 그립니다. ASSEM의 무결성을 유지 영구 접착제의 4 층 : 6 층의 패터닝 장치, 양면 접착 다섯 층에 의해 함께 유지된다채혈 장치와 이동식 접착제의 하나의 층은 포집 층의 면역의 결과를 검사하는 장치의 박리 용이하게한다.

이 원고의 목적을 위해, 우리는 hCG의 단지 음성 및 양성 대조 시료 사용 (0 MIU / ㎖ 및 81 MIU 각각 / ㎖)의 관계 전용 논의를 허용하는 지필 면역의 대표적인 결과를 제공 할 제조 방법 및 장치의 성능. 성공적으로 장치를 제조하는 방법을 보여 외에도 장치 또는 재생 불가능한 분석 결과의 오류가 발생할 수있는 여러 제조 에러를 강조. 이 원고에 설명 된 프로토콜과 논의는 종이 기반의 면역 설계 및 제조 방법에 대한 귀중한 통찰력을 가진 연구자를 제공 할 것입니다. 우리가 면역에 대한 우리의 데모를 집중하는 동안, 우리는 여기에 제시된 가이드 라인은 세 DIMEN의 제조에 크게 도움이 될 것으로 예상적인의 미세 유체 장치를 종이 기반.

프로토콜

종이 기반 미세 유체 장치 레이어 1. 준비

1. 그래픽 디자인 소프트웨어 프로그램을 사용하여 종이, 나일론, 및 접착제 층을위한 패턴을 준비한다. ⁶ 각 계층은 다른 패턴을 가질 수있다.
   패턴이 기능적 지필 면역 필요하지 않은 위치 맞춤 구멍을 포함 할 수 있지만, 입체 디바이스의 재생 가능한 제작을 지원 : 참고. 장치가 스트립, 또는 전체 시트로, 개별적으로 조립하는 경우이 구멍의 배치가 달라집니다. 패턴을 설계하는 데 사용되는 소프트웨어 프로그램은 패터닝 기술 (예, 포토 리소그래피, 왁스 인쇄 또는 절단)의 선택에 따라 달라질 수있다. ⁶
2. 70 % (v / v)의 에탄올 및 물의 용액으로 작업 영역 스프레이. 깨끗한 종이 타월로 작업 영역을 닦습니다.

종이 레이어 2. 준비 : 샘플 추가, 복합체 저장, 배양 및 세척 레이어

1. 큰 탁상 종이 커터를 사용하여 정성 여과지의 층을 준비합니다. 고체 잉크 (왁스) 프린터를 사용하여 패턴을 용이하게하기 위해 표준 용지 크기에 용지의 재고 시트를 잘라. 예를 들어, 하나의 460 X 570mm ² 시트는 US Letter 용지 (8.5 X 십일인치 ^2)의 4 장을 만들 수 있습니다. 오염을 최소화하기 위해 항상 깨끗한 장갑 용지를 처리합니다.
2. 프린터 트레이에 크로마토 그래피 종이 낱장 용지를 넣습니다. 이전에 설계 레이어 (그림 1 참조) 인쇄합니다.
   참고 : 패턴이 자동 피드를 사용하여이 시트에 직접 인쇄 할 수 있습니다. 단지 종이 한 장을 용지 걸림을 방지하기 위해 한 번에 인쇄 할 수 있습니다. 모든 레이어를 들어, "강화"인쇄 설정을 사용합니다.

나일론 막 계층 3. 준비 : 캡처 레이어

1. 탁상 종이 커터를 사용하여 시트 (7.5 X 십인치 ^2)에 나일론 막의 주식 롤을 잘라. 나일론 처리에 큰 관심을 가지고멤브레인 무결성을 유지하고 추출을 방지합니다. 나일론 막은 수분에 민감한만큼, 데시 케이 터 캐비닛에 사용하지 않는 재료를 보관합니다.
   참고 : 컷 시트는 US Letter 용지보다 좁은입니다. 나일론 막은 얇고 약하기 때문에, 직접 프린터에 의해 처리 지원을 필요로 할 수 없다. 자세한 사항은 아래에 설명되어 있습니다.
2. 왁스 프린터를 사용하여 복사 종이 위에 포획 층 패턴을 인쇄하고이를 나일론 멤브레인의 위치 결정을위한 가이드 역할을하는 광 박스 테이프. 광 박스는 여러 층의 정렬을 돕는다.
3. 복사 용지의 이전에 인쇄 된 용지에 복사 용지의 클린 시트를 놓습니다. 빛 상자에 종이의 깨끗한 시트 테이프가 아닌 테이프 두 장의 함께 할.
4. 복사 용지의 깨끗한 부분에 나일론 막의 낱장 용지를 놓습니다. 막 복사 용지의 맨 아래 층의 인쇄 영역을 다루고 있는지 확인합니다. 깨끗한 시트 나일론 막을의 네 변을 테이프종이를 복사합니다.
   참고 : 인쇄 (예를 들어, 용지 걸림이나 왁스의 요철 인쇄)에 문제가되지 않도록 나일론 멤브레인이 평평하고 매끄러운 있는지 확인하십시오. 왁스 나일론 막을 복사 용지에 부착 된 테이프 상에 인쇄 될 수있다. 이 경우 인해 테이프 범위에 나일론이 불완전하게 패터닝 영역은 폐기해야합니다. 미래 제제, 나일론 막 대형 조각이 인쇄 오류를 방지 할 수있다.
5. 수동 급지 프린터 트레이에 (여기에 부착 된 복사 용지에서 지원) 나일론 막 한 장을 넣습니다. 한 번에 나일론 막의 한 장을 인쇄 할 수 있습니다.
   참고 :이 패턴 화되지 않는 오점 층에 요구되는 준비 단계는 없습니다.

4. 인쇄 층에 소수성 장벽을 만들기

1. 테이프 중력 대류 오븐에 배치 되어도 상기와 층 아래 가열 아크릴 프레임 상에 인쇄 층. 에 테이프 나일론 막 유지왁스 후까지 복사 용지의지지 시트가 용융되고, 소수성 장벽이 형성된다.
   주 : 아크릴 프레임이 1/2 맞춤형 레이저 절단 된 부분이다. ". 디바이스의 개수에 따라 두께의 아크릴 수지 2 개의 프레임 사이즈가 사용 된 제조되는 작은 프레임의 바깥 테두리 (11) 5/8 조치" X 2 3/4 ", 프레임의 내부 구멍 (10)이 측정 3/8"× 1 3/4 7/8 × 8 ", 및 상기 내부를". 큰 프레임의 바깥 테두리 (11)를 측정 5/8 " 프레임의 구멍 10 1/4 "X 7 7/8". 개방, 내부 공간도 용지의 전체 두께를 통해 왁스의 용융을 가능하게 측정합니다.
2. 왁스 용지의 두께에 용융 될 때까지 30 초 동안 150 ℃ 오븐에서 층을 놓는다. 왁스는 그것을 뒤집 및 설계 결함 확인하여 용지의 두께를 침투했음을 확인합니다.
   주 : 강제 공기 오븐 또는 핫 플레이트는 고체 왁스 잉크를 용융하는데 사용될 수있다. 녹는 시간또는 온도는 가열 방식에 따라 달라질 수 있습니다.
3. 아크릴 프레임에서 용지 및 나일론 막을 제거합니다. 또한, 복사 용지의지지 시트에서 나일론 막을 제거합니다.

접착층 (5)의 제조

1. 설계 파일을 이용하여 로봇 나이프 플로터를 사용하여 접착 필름의 패턴 양면 판 이전 (단계 1.1)을 준비 하였다. 왁스 라이너의 시트를 사용하여 노출 된 접착 표면을 보호합니다.
   주 : 양면 접착제가 샘플이 연속적인 유체 통로로 층을 통과 할 수 있도록 구멍을 패터닝한다. 왁스 라이너 용이 접착제 제거, 절단 중에 오염 및 인열로부터 보호하는 역할을한다. 레이저 커터 또는 프레스도 접착 필름의 패턴 층에 사용될 수있다 죽는다.

접착제와 장치 레이어 6. 백업

1. 70 % (v / v)의 에탄올 및 물의 용액으로 라이트 박스 스프레이. 깨끗한 종이 t으로 닦아owel.
2. 테이프 인쇄 된면이 아래로 라이트 박스에 접착제로 백업 할 필요가 종이 또는 나일론 막의 패턴 층.
3. 박리 한 접착제의 패턴 화 된 시트의 보호 라이너 측 종이 또는 나일론 막 층에 부착. 패턴의 적절한 정렬을 보장하기 위해 빛의 상자를 사용합니다. 함께 누릅니다. 보호 슬립에 부분적으로 조립 된 장치를 놓습니다.
   참고 : 보호 슬립들이 라미네이터 롤러에 접촉하지 않도록 보장함으로써 오염이나 손상으로부터 기기를 보호 적층 필름 후원의 접힌 부분입니다.
4. 완전히 인접 층에서 공기의 주머니를 제거, 함께 접착 종이를 눌러 자동 라미네이터를 통해 생성 된 2 층 어셈블리를 전달합니다.
   주 : 상기 장치의 층들 사이에 공기 주머니 장치 무결성 및 누수시킴으로써 재현성 흡상을 방해 할 수있다.

복합체 L 7. 치료이전 장치 조립에 면역 측정법 용 시약에 이어

1. 처리 될 친수성 영역이 프레임에 접촉 현탁되지 않도록 아크릴 프레임 상 테이프 복합 층.
2. 접합체 층의 친수성 영역 1X 인산 완충 생리 식염수 (PBS)에 100 ㎎ / ㎖ 소 혈청 알부민 (BSA), 2.5 μL를 추가한다. 이 2 분 후 5 분 동안 65 ° C에서 실온에서 건조하도록 허용합니다.
   참고 :이 볼륨이 논문의 영역을 적시기에 충분하다. BSA 용액 용지 및 시약은 샘플에서 재수 때 나노 입자의 방출을 용이하게하는 건조 공정 중에 콜로이드 성 나노 입자의 응집을 방지 할 수 있습니다.
3. 안티 - β-hCG의 항체에 결합 5 OD 콜로이드 금 나노 입자의 5 μl를 추가하고, 건조 과정을 반복합니다.
   주 : 콜로이드 금 나노 입자의 농도의 단위는 종종 abso 의해 측정 된 광학 밀도 (OD)로 표현되는λ = 540 nm에서 rbance. 어떤 처리는 10 절에서 장치 조립하기 전에 심지 패드 필요하지 않습니다.

면역 측정법에 대한 이전 장치의 조립에 시약과 측면 채널 8. 치료

1. 처리 될 친수성 영역이 프레임에 접촉 현탁되지 않도록 아크릴 프레임 상 측면 테이프 채널 층.
2. 블로킹 제의 10 μL를 추가 (5 ㎎ / ㎖ 무 지방 우유, 0.1 % (v / v)로 1X PBS에 트윈 20) 좌우 채널을 처리한다. 동일한 건조 공정 (실온에서 2 분, 5 분 후, 65 ° C) 공액 층으로 반복한다.

이전 장치 조립에 면역 측정법 용 시약과 캡처 계층 9. 치료

1. 처리 될 친수성 영역이 프레임에 접촉 현탁되지 않도록 아크릴 프레임 상 테이프 포획 층.
2. 1 ㎎ / ㎖ 안티 α-hCG의 항체의 5 μL로 포집 층을 치료하고 허용샘플은 65 ° C에서 8 분간이어서 2 분 동안 실온에서 건조한다.
3. 차단제의 2 μL를 추가 (5 ㎎ / ㎖ 무 지방 우유 0.1 % (v / v)의 1X PBS의 트윈 20). 캡처 층의 건조 과정을 반복합니다.
   참고 :이 금액은 너무 많은 차단제를 사용할 때 일어날 수있는 나일론 멤브레인의 기공을 폐색없이 서류 코트에 적합합니다.

10. 조립 3 차원 종이 기반 미세 유체 장치

1. 광 박스에 제층을 테이프 (인쇄 된면이 위쪽으로 향하도록). 맞춤 구멍을 사용하는 경우, 휴대용 홀 천공 도구를 사용하여 다음 층에서 제거.
2. 접착제를 노출 캡처 층의 뒷면에 보호 필름을 제거합니다. 가이드로 맞춤 구멍을 이용하여 세정 층 위에 포획 층을 맞추고. 함께 두 층을 누릅니다. 장치에 오염 또는 손상을 최소화하기 위해 친수성 영역을 만지지 마십시오. 핀셋 assemb을 돕기 위해 사용될 수있다LY.
3. 접착제를 노출 배양 층의 뒷면에 보호 필름을 제거합니다. 캡처 층 위의 배양 층을 맞추고 함께 키를 누릅니다. 모든 활성 층이 조립 될 때까지 이러한 방식으로 레이어를 계속 추가합니다.
4. 보호 슬립에 부분적으로 조립 된 장치를 놓고 단단히 함께 라미네이터를 사용하여 레이어를 부착합니다.
5. 세정 층의이면에 보호 필름을 제거하고, 장치의 하부에 오 부착 층. 반복 적층 단계 10.4 입체 종이 기반의 미세 유동 장치의 조립을 완료한다. 조각이나 가위를 사용하여 완전히 조립 된 장치의 시트에서 장치를 잘라 원하는 번호.
   주 : 장치 전체 시트 장치의 스트립, 또는 하나의 장치는 유사한 방법을 사용하여 제조 될 수있다.

11. 종이 기반의 면역 수행

1. 장치 위에 친수성 영역 시료 20 μL를 추가 (즉, t그는) 층을 샘플.
2. 다음, 장치에 완전히 심지 (1 배 인산 완충 식염수에 0.05 % v / V를 트윈 20) 세척 버퍼의 15 μl를 추가 샘플 기다립니다. 세척 완충액의 첫번째 분취 량을 디바이스에 완전히 악인 후 세척 완충액의 제 15 μL 분취를 추가한다.
   주 : 세척 완충액 액체 방울이 용지의 표면에 메 니스 커스를 보여주는, 사라진 장치에 완전히 부정한 갖는다. 세척 완충액 번째 분취 완전히 장치 들어간 경우 분석은 완료된다.
3. 상기 분석의 결과를 나타내 포획 층을 노출 핀셋을 사용하여 장치의 상위 3 층을 벗겨.
   1. 질적 색의 유무를 관찰하여 시험 결과를 해석한다. 대안 적으로, 결과를 정량화하고 내 강도 분포의 특징을 바탕 스캐너 사용의 화상 처리 소프트웨어 또는 알고리즘을 사용하여 이미지 판독 층검출 영역. ⁽²⁰⁾

결과

입체 종이 기반 미세 유체 장치에서 재현 분석 성능을 얻기 장치 사이의 일관성을 보장하는 제조 방법에 의존한다. 이 목적을 향해, 우리는 제조 공정 및 재료를 고려 번호를 확인했으며, 종이 기반 면역 시연의 맥락에서 여기에 논의한다. 우리는 종이 기반의 미세 유동 장치 (도 2A) 내의 소수성 장벽을 형성하기 위해 왁스 인쇄 법을 사용한다. ^이...

토론

재현 가능한 제조 전략을 식별하는 분석 발달의 필수 성분이다. ^{22 우리} 입체 종이 기반의 미세 유체 소자를 제작 순차 층별 접근법을 사용한다. (ⅰ) 다수의 물질에 대한 방법을 수정하지 않고 하나의 장치 구조에 혼입 될 수있다 : 종이 ^(23)의 한면에서, 다층 장치를 제조하는 접거나 접기 기법을 적용 이러한 방법과는 ^{대조적으로, 24} ?...

자료

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