無機ヒ素で、広い範囲の食品行列水素化物発生 - 原子吸光法を使用して分析します。

要約

幅広い食品行列中無機態ヒ素を決定する分析法の有用性が示されています。メソッドは、水素化物発生原子吸光法による無機ヒ素の最終決定とクロロホルムへの抽出選択で構成されています。

要約

欧州食品安全機関 (EFSA) で食事を介して無機ヒ素に音暴露評価をサポートするために各種食品におけるヒ素の種の分布についての情報がある必要があります食品中のヒ素の科学的な意見を強調しました。生成されます。共同試験で検証済みメソッドは、さまざまな食品のマトリックス、カバー穀物、キノコ、海洋由来 (合計 31 サンプル) 食品中無機態ヒ素を決定するために適用されています。メソッドは、選択的に濃塩酸でタンパク質の消化後クロロホルムに抽出された iAs の流れ注入水素化物生成原子吸光法による検出に基づいています。メソッドは、10 μ g/kg、乾燥重量大量食品行列の中の無機ヒ素の定量を許可の定量化の限界によって特徴付けられます。これにより得られた結果のパフォーマンスの点数についてメソッドとは異なるいくつかの検定試験研究所で報告された提供情報です。議論の方法で満足のいく結果の割合は他の分析手法とその結果のより高いです。

概要

委員会規則 (EC) 1881/2006 設定最大レベル汚染食品¹ 0.10 μ g/l の米の特定の無機ヒ素 (iAs) いくつかの米商品の 2016 年 1 月最大レベルに含まれているので、幼児や子供のための食糧の生産、非パーボイルド精白米 (磨かれたか白い米) 0.25 μ g/L パーボイルド ライスと玄米と米ワッフルの 0.30 μ g/L の 0.20 μ g/L は米ウェーハ、せんべい、餅です。この更新プログラム欧州法規の食品中の汚染物質の欧州食品安全機関 (EFSA)²の食品中のヒ素に関する科学的意見に従ったのだと推定した平均値と高消費者の iAs に食事を介して露出ヨーロッパはそのようないくつかの消費者は、iAs への慢性露出は肺、皮膚、膀胱、皮膚病変の癌を引き起こすことを念頭に危険をもたらすことができることです。締結のヨーロッパの人口³、2014 年公開中無機態ヒ素の食事暴露 EFSA の科学的なレポートよりも、他の穀物製品を iAs にすべての年齢層の消費者のための食事療法の主要な貢献者に、米と、米、牛乳、乳製品、飲料水にも大きく貢献 iAs の摂取量、幼児と乳児の主要な貢献者をされている牛乳や乳製品の製品。

2010 年に飼料や食品、EURL-HM の重金属に対する欧州連合参照実験室実行能力テスト、IMEP-107 米の有無にかかわらず十分な精度でイネの iAs を決定することができたデモで iAs の決定のため、解析メソッドは、⁴を使用します。

食品中の iAs の定量分析手法検証済み。中国は、最初の国の法律で最大レベルのため導入する iAs イネです。法の実装を可能にするには、標準的な方法は「abio 砒素」⁵をと呼ばれる規格もの決定ための 2003 年に掲載されました。2008 年に公開された標準化 (CEN) のためのヨーロッパ委員会標準化された方法、海藻⁶で iAs の定量のための EN 15517:2008。2 つの方法は、iAs からのみアルシンを生成する最適化された条件の使用に基づいています。ヒ素の水素化物を生成することも他のヒ素種から iAs 政教分離の方法は必要ありません。原子蛍光⁵水素化物生成原子吸光法、HG 原子吸光法⁶最終決定が行われます。ただし、他のヒ素化合物の干渉に苦しむことがなくヒ素の水素化物を生成する厳密な条件を設定することは困難だし、これらの 2 つの方法で得られた IMEP-112 (PT EURL HM 主催) で報告された藻類のすべての iAs 質量分数、不十分な⁷としてスコア化しました。有機ひ素種、アルキルヒ (MMA)、ジメチルアルシン酸 (DMA)、藻類のサンプルで現在の arsenosugars なども揮発性の水素化物を生成することができますおよび iAs^{8 の結果に肯定的なバイアスにつながるの定量における干渉する可能性}.

最近、CEN は、新標準法、高速液体クロマトグラフィー-ICP-MS⁹を使用して海洋と植物由来の食品中の iAs の定量のための EN 16802:2016 を出版しました。計測器の種類をすべてではない所が完備、特に開発研究所インフラが未発達な国で高価なストレートな方法が必要な。

2012 年に CEN 標準化法マイクロ波抽出後 HG 原子吸光法による飼料原料中の iAs の定量と固相抽出 (SPE) は、iAs のオフライン分離 EN 16278:2012¹⁰。フィード内の iAs の分析に適合することが証明されてこのメソッドが EFSA によるとヨーロッパ³の主な食事要因と思われる非海洋由来食品の iAs を決定に必要な感度を欠いています。ただし、同じグループ開発および EN 16278:2012 を検証するテストし正常に適用し、シーフードと共同試験^11,12米の iAs を決定するための方法を検証します。

代替食品行列の iAs のクロロホルムとさらに HG-原子吸光定量に iAs の選択的抽出定量法は、共同試験¹³共同研究センター (JRC) によってを最近検証されました。メソッドの選択性は直接 HG-原子吸光法より、HPLC ICP-MS など洗練された計測器の使用を必要としない実装が容易です。本稿では、幅広い食品行列で iAs を決定するこのメソッドを使用しての可能性: 野菜、穀物、きのこ、海洋起源の食べ物が評価されています。さらに、EURL HM といくつかの行列をカバー JRC 主催検定試験でメソッドを使用する研究室の性能を説明しています。

プロトコル

注: 使用されるすべての材料を 10% (v/m) HNO ₃ 付きの染し、少なくとも 2 回脱イオン水で洗浄する必要があります

。

1 加水分解

1. 正確に重量を量る ca. 凍結乾燥のサンプルの 1 g に 0.5 (または新鮮な試料 など の同等の量 1 に 4 g) 50 mL ポリプロピレン製遠心管ねじ時価ベースの株主の
。
2. 4.1 mL の脱イオン水を追加します
。
3. 撹拌機サンプルが完全にウェットになるまで約 5 分の機械的シェーカーと
。
4. 追加 18.4 mL の濃塩酸 (HCl) 37 %m/v は以下の
5. 15 分の機械的シェーカーと撹拌機
6. 12-15 時間休ませて (例えば一晩).

2。抽出

1. 48 %m/v とヒドラジン硫酸 1 mL に臭化水素 (HBr) は以下の 2 mL を追加 (N ₂ H ₆ など ₄) 加水分解サンプルのソリューション (15 mg/mL).
2. 30 振る機械的シェーカー s.
3. クロロホルム (CHCl ₃) 10 mL を追加します
。
4. 機械的シェーカーで 5 分間振る
。
5. 800 x g. で 5 分間遠心
6. クロロホルム相 (低い相) を別の 50 mL ポリプロピレン製遠心管にピペットします
。
7. は再び残り酸フェーズにクロロホルム 10 mL を追加し、抽出を繰り返します。最後に約 20 mL のクロロホルムの収集されました。酸の相からのクロス汚染を避けるために注意してください
。

3。クロロホルム段階のクリーンアップ

1. 遠心分離機 800 x で 5 分間のプールされたクロロホルム段階 g。2 つのフェーズの明確な分離を達成するために必要な場合、速度や遠心分離の時間を増やされるかもしれません
。
2. は、1 mL ピペットとクロロホルムの残りすべての酸相残基を削除します。この手順は重要です。サンプル内のすべての他のヒ素の種が酸の段階であるためクロロホルム段階で残りすべて酸相残基が過大評価の iAs 結果につながます
。
3. クロロホルム段階で現在残りの固体または酸の相残留物を除去し、50 mL ポリプロピレン製遠心管にクロロホルム相を収集する疎水性 PTFE 膜 (直径 25 mm) を通してフィルター
。

4。溶媒抽出-逆

1. 1 の追加 10 mL ろ過ステップの後戻ってクロロホルム段階から iAs を抽出する M HCl 収集します
。
2. 機械的シェーカーで 5 分間振る
。
3. 800 x g. で 5 分間遠心
4. 酸の相 (上相) をピペットし、(例えば パイレックス) 鉱化作用の 250 mL ガラス製ビーカーに注ぐ
。
5. 逆抽出を繰り返し、収集された HCl フェーズを結合します
。

5。鉱化作用をサンプル

注: この手順により、iAs の質量割合が近くにある、または定量下限値以下の試料中前濃度と干渉の除去と研究所で頻繁に省略するとHG 原子吸光法ではなく最終決定の ICP-MS でこのプロトコルを使用する

。

1. 中断 20 g の硝酸マグネシウム [Mg (₃) ₂ 6 H ₂ O] と 100 mL の脱イオン水で酸化マグネシウム (MgO) の 2 g。この懸濁液 2.5 mL をガラスのビーカーに追加します。沈殿物を避けるためにそれを追加しながら、懸濁液を振る
。
2. の少なくとも 65% の集中の HNO ₃ の追加 10 mL m/v 任意の予測を回避する砂湯 (またはサーマル プレート) に減圧乾固します。サンプルが完全に乾いたことを確認し、ガラス ビーカーの上に時計を置いて結露が形成されないことを確認してください
。
3. 時計眼鏡ビーカーをカバー 150 ° C を超えない初期温まっフル炉にそれらを置くし、425 ± 12 h 425 ° C で維持を 50 ° C/h の速度で 25 ° C に温度を徐々 に大ききます。この手順は重要です。任意の予測温度上昇率を厳密に実装する必要がないようにします
。
4. 部屋の温度に冷却する灰を許可します
。
5. は、0.5 mL の脱イオン水に灰をウェットし、6 m 塩酸 5 mL を追加し、追加します。ガラス製ビーカーの壁からすべての灰を回復する注意してください。揺れに応じて完全に、灰を分解します
。
6. 前 5 g、ヨウ化カリウム (KI)、および脱イオン水 100 mL 中のアスコルビン酸 5 g に溶解したエージェントを減らす 5 mL を追加し、ヒ素に iAs の定量的な削減を達成するために 30 分を待つ
。
7. フィルターを刈り取る数 1 紙や相当ソリューション 50 mL ポリプロピレン製遠心管の収集.6 M 塩酸収集洗浄液体 25 mL のチューブし、償いを 6 M 塩酸で最終巻で 2 回ガラス ビーカーを洗い
   注: 閉じる] またはメソッド (0.010 mg/kg の定量下限値以下にサンプルで iAs 濃度を予想するとき、それどころか、高、無機化手順 5.5 5.7 必要がありますを使用して変更 テーブル 1、定量下限を提供するボリュームまたは。再溶存態および予備還元サンプルが 4 ° C で 24 時間安定しています。全体分析プロセスの少なくとも 2 つの試薬ブランクを使用必要があります
。

6。校正

注: 定量化目的範囲 0.5 - 3 価砒素の外部校正曲線を使用して、10 μ g/l. を使用調整を構築する 1000 mg/L ヒ酸市販認定標準液その後希釈を適用する曲線

。

1. 10 mg/L に 100 mL のメスフラスコに 1,000 mg/L 標準溶液 1 mL を分注、6 M 塩酸でマークを入力しヒ素標準溶液を準備します
。
2. 10 mg/l の 100 mL のメスフラスコにヒ素標準溶液 1 mL を分注、6 M 塩酸でマークを入力し 0.1 mg/L のヒ素標準溶液を準備します
。
3. 25 μ g/L ヒ素標準液 0.1 mg/L の 100 mL のメスフラスコにヒ素標準溶液の 25 mL を分注、6 M 塩酸でマークに充填を準備します
。
4. は次のように濃度の検量線を準備: ピペット 25 μ g/l のヒ素標準溶液 50 mL メスフラスコに 表 2 に指定されたボリューム、各メスフラスコであらかじめ還元溶液 10 mL を追加、30 分待ってその後、6 M 塩酸でマークを入力します。彼らは縦横上記される他のボリュームが適しています
。
5. は次のように空白の校正を準備: 10 mL のピペット 6 M 塩酸と事前削減ソリューション 50 mL のメスフラスコに 10 mL。30 分および 6 メートルが付いている印にし、塗りつぶしを待つ
6. 使用 QC1、品質管理として 表 2 の QC2 としてマーク基準: QC1 により低濃度レベルで定量化が正しく、QC2、確実に応答がで大幅な変動がないと、高濃度で安定していること時間
。

7。定量

検出および定量目的、インストゥルメンタル、次の自動サンプラー、フロー注入水素化物生成システム、電気温水石英セル装備

1. 使用原子吸収分光法表 3 に記載されている FI HG 原子吸光法による iAs の定量化のための条件です
。

8。定量化

1. iA を計算次の方程式を使用して試料を分析した (で表された mg/kg) で s 質量の割合:
   
   場所:
   C _x: (μ g/L)、抽出物中の濃度校正曲線から計算
   C _BI: 濃度試薬ブランク サンプル (μ g/L)、較正曲線から推定
   v: 最終的なサンプルの無機化ステップ (5.7)、通常 V = 25 mL 量
   w: サンプル (重量グラム) の

結果

スペイン語の様々 な市場から購入したいくつかの食料品で iAs の質量分率を決定する方法を適用しました。一連の異なるマトリックスのためのこの方法で得られた結果は、EFSA の³のヨーロッパの人口の無機ヒ素の食事暴露を評価するレポートで使用されているカテゴリを下記の表 4に分類される、公式コントロール研究所 (OCL) によって報告されるデータの単位。表 4の結果は、本法された検証済み¹³共同試験中に計算される別の食品カテゴリの ± 3 つ複製再現性標準偏差 (S_R) の平均を表します。表 4に示す結果は、他の以前に発行されたような行列^11,12,14とよく一致。

特定の関連性の上限は¹食品中の汚染物質のヨーロッパの法律に含まれているために米の種類で iAs の得られた結果が。OCLs³の所見に一致して、白米の玄米と、最低の取得中最高値。最高レベル海雑草ヒジキア ・ ヒジキEFSA のレポートで示されるようにいくつかの当局によって消費をお勧めされているが見つかりました。

EURL HM と JRC 主催 PTs に参加した所のパフォーマンスと iAs の決定のためのこのメソッドを使用、他の方法を用いて研究室の性能と比較されています。IAs の他のヒ素の種 (全体の 25%) からの分離前に基づく高速液体クロマトグラフィー-ICP-MS (評価結果の約 50%) と HG 原子吸光法の他のメソッドのほとんどの図 1。他のアプローチ (評価結果の約 15%) を使用、電熱 (ETAAS)、蛍光検出と ICP 原子発光分光分析法 (ICP-AES) をおよび水素化物発生なしを結合に基づいていた、共に評価されます。「他の方法」の名前で個々 の数字と任意の統計的有意性数が少なすぎるので。

評価メソッドを使用している研究所のいくつかは元のプロトコルをいくつかのバリエーションを導入し、FI HG 原子吸光法の代わりに ICP-MS を使用します。頻繁にそれらの研究所乾式灰化手順 (プロトコルの手順 5) を適用していない、1 M HCl 相に導入された ICP-MS。評価ポイント カバー様々 な行列: 米^15,16小麦、ほうれん草、藻類¹⁷とチョコレート¹⁸。

研究所のパフォーマンスは、z スコアとして表現されました。

どこ：
x_ラボは PT の参加者によって報告された測定結果
X_refは、割り当てられた値 (研究所のベンチマークを使用) です。本稿の内で配られるすべての PTs で割り当てられた値は、さまざまな分析方法を使用して iAs 解析の分野で専門家の研究所のグループによって設立されました。
Σ は、能力評価、解析部の芸術の状態を考慮した PT プロバイダーによって固定の標準偏差です。本稿で PTs で σ は、米およびムギの割り当てられている値の 15%、22% 藻類、ほうれん草やチョコレートの 25% だった。

Z スコアの解釈は、ISO 17043:2010¹⁹に従って行われます。
| スコア |≤ 2 満足 (S) パフォーマンス
2 < | スコア |< 3 の疑問 (Q) パフォーマンス
| スコア |≥ 3 (U) パフォーマンスが低下

上記で説明した方法で得られた結果の 70-5 パーセント満足のいく z スコアを得た。藻類の iAs の質量分率の決定どおり、海洋起源の行列におけるヒ素種の複雑な分布を考慮して挑戦することに判明しました。このメソッドを使用して、藻類の iAs の IMEP 112 で報告された 3 つの値のうち 2 つは不満足な z スコアを得た。同じ難易度は、他の方法で得られた結果の間で観察されました。評価法により得られた結果の 85% が満足、その藻類では、iAs の報告結果を除きます。

図 1:の性能比較 (z スコアとして表される) 研究所に参加 PTs (IMEP 107、IMEP 112、EURL HM 20 物質 PT 43) 本稿で説明した方法とその他一般的応用方法の。S: 満足、q: 疑わしいと u: 不十分です。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

	予想される iAs 質量分率 0.010 mg/kg よりも低い	予想される iAs 質量分率 覆われているものよりも高い 検量線で
灰 (mL) を再溶解するために使用 6 mol L-1 HCL ボリューム	2	10
事前低減剤量 (mL)	2	10
最終巻 (mL)	10	50

表 1: プロトコル分析サンプルの非常に低いまたは非常に高いヒ素濃度が予想される場合の変更。

濃度、 較正曲線 (μ g/L)	因数 (mL)
0.5	1
1	2 (QC1)
2.5	5
5	10 (QC2)
7.5	15
10	20
ヒ素の校正標準のすべてのソリューションは、各校正前にたてに作成しなければなりません。

表 2:50 mL 最終巻で濃度の検量線を作成する 25 μ g/L のヒ素標準溶液から取られるべき因数。

fo:keep-together.within-ページ =「1」fo:keep-と-next.within-ページ「常に」= > フローインジェクション
水素化物生成 ·        ループ サンプル: (最終事前削減ソリューションの溶解量は 25 mL から異なる合わせられる) に 0.5 mL。 ·        還元剤: 0.2% (w/v) NaBH₄ 0.05% (w/v) 水酸化ナトリウム;5 mL/分の流量。 ·        塩酸 10% (v/v)、10 mL/分の流量。 ·        キャリアガス: アルゴン、100 mL/分の流量。 原子吸光
分光器 ·        : 波長 193.7 nm ·        スペクトル帯域通過: 0.7 nm ·        無電極放電ランプ システム 2 ·        現在のランプの設定: 400 mA ·        セルの温度: 900 ° C

テーブル 3:IAs に使用楽器の条件 HG 原子吸光法による定量化します。

食品		私-(μ g/kg の新鮮な重量) として
穀物と穀物ベースの製品
米	ホワイト	113 ± 18
		73 ± 12
		56 ± 9
	ブラウン	197 ± 32
		125 ± 20
		275 ± 44
	パーボイルド	134 ± 21
		159 ± 25
	ウェーハ	162 ± 26
		127 ± 20
野菜・野菜製品
乾燥キノコ	ヤマドリタケ	174 ± 10
	Galocybe gambosa	74 ± 4
	Marasmius oreades	104 ± 6
	Cantharellus 繁殖縄張獲得行動	16 ± 1
	シイタケ菌床	96 ± 6
海の雑草	ヒジキア ・ ヒジキ	97000 ± 14550
		44943 ± 6742
	フーカス	288 ± 43
		433 ± 65
魚や他の魚介類
魚の肉	灰色のボラ	53 ± 12
		21 ± 5
	ヨーロッパのウナギ	72 ± 16
		42 ± 9
	ザリガニ	33 ± 7
		20 ± 4
	マグロ	11 ± 2
		5 ± 1
軟体動物	ハマグリ	243 ± 54
		133 ± 29
	ムール貝	32 ± 32
		139 ± 31

表 4: 記述手法の異なるマトリックスの範囲のための結果

ディスカッション

記述のプロトコルの重要なステップは、あらゆる酸段階クロロホルム段階で残りの残基、結果につながる過大評価 iAs サンプル内のすべての他のヒ素の種が酸であるのでクロロホルム段階 (ステップ 3.2) のクリーンアップ相。これは特定の関連性のヒ素質量分率、サンプルで現在のほとんどを占める可能性があります有機種の茄多の存在のための海洋の試料を分析する際です。疎水性 PTFE (3.3) 膜の使用は、非常に重要です。IAs のクロロホルムへの抽出中にエマルジョンを形成する場合、遠心分離 (3.1) の速度を増やすことができます。その他従来のエマルジョンを排除するためにも適用できます。もう一つの重要なステップは、鉱化作用 (ステップ 5.3) です。温度上昇率は、厳密に制御されていない否定的なバイアスにつながる iAs 回復を減らすだろうとアナリストに危ないことができる予測を避けるために実行されなければなりません。

前述の通りいくつか研究所は FI HG 原子吸光法ではなく ICP-MS を用いた評価法を使用しています。乾式灰化ステップ (ステップ 5 プロトコルでは) このような場合不要、ICP-MS に 1 M HCl フェーズを導入できます。HG-原子吸光法の場合、高い検出限界のため前濃度ステップも可能な干渉を排除が必要です。

本稿で説明した方法で得られた結果の割合と結果報告、藻類、高速液体クロマトグラフィー-ICP-MS に匹敵する HG 原子吸光法よりも高い。後者の手法 (HG 原子吸光法) は広く利用可能な複雑なヒ素種分布パターンと食料品を中心に、有機ヒ素の種からの干渉に傾向があります。満足のいく結果の最も低い割合を特徴付ける「他の方法」で得られたものが、いくつかの分析方法、結果、図 1の少量で表されるそれらの各 1 つをカバーして心の中で保管しなければなりません。本稿で紹介した方法より洗練された/高価な高速液体クロマトグラフィー-ICP-MS、まだ複雑なマトリックスでも同様の性能によって特徴付けられるに代わるものです。よく質の高いオペレーターと高価な赤外線-構造高速液体クロマトグラフィー-ICP-MS などのハイフネーションされた技術の使用が必要です。本稿で紹介した方法は、基本的な分析化学の訓練をアナリストが実装できます。

メソッドに関連付けられているいくつかの主要な欠点があります。他のヒ素の種からともサブ ppm レベルまで事前集中 iAs に iAs を分離するいくつかの手順を従う必要がありますので時間がかかるです。クロロホルムの使用を意味します。彼らが否定的な健康への影響のため、実験室での塩素化合物の使用を避ける傾向があります。それにもかかわらず、良い研究所プラクティスが保たれるヒューム フードのサンプルが処理される場合、それらの負の影響を避けることができます。総合格闘技は、iAs の定量における干渉します。総合格闘技が存在、藻類、魚や他の魚介類などできるサンプルを分析する際に念頭に保たれなければなりません。ただし、兵務庁は通常、iAs の結果に関連付けられた不確実性で覆われているが少量で存在します。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Deionised water	Any available		18.2 MΩ cm
Concentrated hydrochloric acid (HCl).	Any available		Not less than 37 % m/v, c(HCl) = 12 mol/L, with a density of approx. ρ (HCl) 1.15 g/L
Concentrated nitric acid (HNO3)	Any available		Not less that 65 % m/v, c(HNO3) = 14 mol/L, with a densitiy of approx. ρ 1.38 g/L
Chloroform	Any available		Harmful by inhalation and if swallowed. Irritating to skin. Wear suitable protective clothing and gloves.
Hydrogen bromide (HBr)	Any available		Not less than 48 % m/v
Hydrazine sulphate (N2H6SO4)	Any available		Harmful if swallowed. Causes burns. May cause cancer.
Magnesium nitrate hexahydrate [Mg(NO3)6H2O]	Any available
Magnesium oxide (MgO)	Any available
Potassium iodide (KI)	Any available
Ascorbic acid (C6H8O6)	Any available
Sodium hydroxide (NaOH)	Any available
Sodium borohydride (NaBH4)	Any available
Arsenic (V) standard solution	Any available		1,000 mg/L Use certified standard solutions commercially available
Centrifuge	Any available
Mechanical shaker	Any available
Sand bath	Any available
Muffle furnace	Any available
Polypropylene centrifuge (PC) tubes	Any available		50 mL with screw cap
Syringe filters with hydrophobic PTFE membrane	Any available		25 mm diameter
Pyrex glass beaker	Any available		Tall form 250 mL, capable of withstanding 500 °C
Watch glasses	Any available
Volumetric flasks	Any available		10, 25, 100 or 200, Class A.
Plastic funnels	Any available
Whatman n° 1 paper or equivalent	Any available
Atomic absorption spectrometer equipped with a flow injection system (FI-AAS)	Any available