デュアルのバイオミメティック基底膜として極薄 Porated 弾性ゲルの細胞培養

要約

現在の二層文化モデルは模倣する生体内微小機能の in vitro研究できないようにします。ポリエチレング リコール、酸化亜鉛テンプレート メソッドを使用してこのプロトコル記述する可変剛性、気孔率、体内によく似た成分と、極薄のバイオミメティック基底膜の開発細胞外マトリックス。

要約

基底膜は、剛性、組成、アーキテクチャ、および気孔率で変わることができる細胞膜の重要なコンポーネントです。内皮細胞上皮膜のin vitro研究伝統的二層文化を有効にすると透過性のサポート モデルに依存しているが、透過性のサポート、人間の基底膜の多様性を複製する能力に制限が。対照的に、化学合成を必要とするハイドロゲル モデル高調整可能、素材の剛性とバイオミメティック ペプチッドまたは蛋白質の定款による生化学的組成の両方の変更を可能にします。ただし、従来のハイドロゲル モデルは、細胞間の接触と移民研究機能の in vitroの毛穴がないため機能に制限されます。さらに、伝統的なゲルの厚さによるハイドロゲルの全体の厚さにまたがる毛穴定款は挑戦されています。本研究で我々 は生体模倣ヒドロゲルの以前の欠点に対処するのに poly-(ethylene-glycol) (PEG) ゲルおよび亜鉛酸化物テンプレート メソッドを使用します。その結果、可変間隙のアーキテクチャ、機械的性質、成分とカスタマイズ可能な足場にコンフルエントの細胞膜の文化を可能にする極薄、基底膜のようなハイドロゲルを提案します。

概要

細胞外マトリックス (ECM) は細胞接着をサポートし種類の異なる細胞の間の障壁として機能および複雑な組織や臓器の重要なコンポーネントは、タンパク質の足場を作る。間質結合織と対照をなして基底膜 (BM) は互いから組織のコンパートメントに分割するバリアとして機能する ECM の特殊な型です。BMs は約 100 μ m、厚さ、従ってどちらかの側の細胞間の直接的および間接的な通信を可能にします。BMs の 2 つの一般的な例は、ペリサイトおよび内皮細胞間の血管壁は、血管の BMs と内皮細胞および上皮細胞の間にある気道 BMs です。BMs は役立つ細胞極性や移行などの細胞機能の調節に、健康および病気の重要な役割です。¹構成、剛性、アーキテクチャ、および BMs の気孔率は、異なる生理機能を容易にする器官システムによって異なります。たとえば、BM 毛穴は感染時に炎症や細菌中の免疫細胞の移動、細胞間コミュニケーション、可溶性分子拡散を維持するために重要です。気道で毛穴は直径 0.75 から 3.86 μ m²に至るまでの BM の完全な厚さにまたがる

BM の薄い性質が細胞の種類は、1 つの別から物理的に分離、パラクリンと連絡先を介したシグナルを介した細胞間コミュニケーションが維持されることを保証します。したがって、人間の病気のin vitro での研究に研究者は培養細胞膜に多孔質の透水性サポート挿入に頼ってきました。³これらのモデルは、重要な健康および病気の役割を果たしている細胞のコミュニケーションを理解するためにされています。^3,4,5,6,7透水性サポート挿入白血球動員や細菌浸潤; などの生理学的プロセスを調節する細胞シグナリング方法を理解するための基本的な要件を満たすただし、挿入の重要な制限があります、人間点換気サポートを模倣する失敗挿入機械的および生化学的な可変性がないし、単純な多孔質構造が不規則な毛穴を作成する線維状構造を模倣していませんBMs の典型的です。したがって、細胞プロセスに影響を与える固有の BM プロパティを再作成することができます可変システムの成長の必要性があります。

ポリマー ベースの基板は、バイオミメティック体内環境をもっと密接に模倣するコンテキストで細胞膜を研究する BMs の開発のための理想的な候補です。^8,9,10,11,12ポリマーが機械的に可変、バイオミメティック ペプチド断片.を組み込むこと化学的に変更することができます。^11,12,13不活性ポリマー, ポリエチレング リコール (PEG) バイオミメティック BMs を作成する使用することができます、最近の作品の詳細な細胞の成長をサポートする多孔質ネットワークと機械的に可変のペグ アルギニン-グリシン-アスパラギン酸 (RGD) ゲルの合成・炎症細胞走化性。¹⁴公開ペグ ベースが基板は、透過性のサポートする範囲よりヒトの ECM のより現実的なモデルを提供、これらのモデルの多くは細胞膜の文化を作成する能力を制限する約 775 μ m の深さを持つ、非常に厚い、連絡先。¹⁴

現在の細胞膜培養技術の制約の多くを克服するペグのポリマー ベース BM 模倣を作成するためのプロトコルを紹介します。ポリマーの合成と架橋は、その後、選択的にから削除中に酸化亜鉛微結晶生産の製造に広く使用された材料を組み込んだテンプレート メソッドを開発している、結果として得られるバルク高分子。このプロセスは、人間の BMs の蛇行と相互接続の細孔ネットワークを模倣したランダム多孔性ネットワークを生成します。さらに、気孔率はサイズと針生産時に反応の化学量論の変更を介して酸化亜鉛微結晶の形状を変更することによって変更できます。ここで開発した技術は人間の点最後に、力学、気孔率、厚さを模した超薄ハイドロゲルを作成し、これらの BM のような構造の生化学的組成はほとんどは微小環境を生成する簡単に変更できます。その見られる生体内に似ています。

プロトコル

回使用し、すべての安全上の注意を使用する前すべての材料の材料安全データ シート (MSDS) をお読みください。

1. 酸化亜鉛針の合成

1. 0.04 M Zn (₃)₂の 250 ml * 6 H₂O ソリューション硝酸亜鉛の 2.9749 g を 250 mL の水に追加することによって。
2. 6 g の水酸化ナトリウムを 150 mL の水に追加することによって 1 M NaOH の 150 mL を準備します。
3. 攪拌器、ホット プレートに鉱物油浴を設定し、常温で油浴に 500 mL の丸底フラスコを水没します。
4. 亜鉛 (₃)₂の 250 mL を追加 * 6 H₂O、フラスコに反応を攪拌を開始。
5. 150 mL の NaOH 溶液 (白色沈殿物が簡単に形成および 2 つのソリューションがミックスするのにつれ消えてしまう) を追加します。発見 2 時間攪拌します。
6. 55-60 ° C に、フラスコの熱し、24 h の攪拌を続行します。
7. 熱をオフし、ソリューションを撹拌しながら室温に冷却します。
8. 11 μ m の細孔を Büchner 漏斗にソリューションをフィルター、乾燥させて一晩、覆いを取られました。フィルター ペーパーが注がれたソリューションから濡れているもはや漏斗穴上に白い粉が形成されたと、粒子は完全に乾燥させます。
9. ZnO 針を収集し、針のような形態を確認する走査電子顕微鏡 (SEM) の準備します。簡単に、ピン スタブにカーボン テープをマウントし、ZnO 針をカーボン テープを中傷する金属のヘラを使用します。22.4 g/cm³の密度で 8 mm イリジウム コートをスパッタし、10 に画像を取得する kV。

2 HCl の顕微鏡のスライド犠牲亜鉛層の添加による PEG のリリース

1. メタノール 200 mL に酢酸亜鉛の 1.756 g 溶解して酢酸亜鉛溶液を準備します。
2. 70% のエタノールと使い捨てワイプ 3"× 1" プレーン顕微鏡スライドをきれいに。乾いた空気で 10 分間乾燥させて。
3. 150 mm ガラス ホット プレート上にペトリ皿を置くし、150-160 ° C に予熱
4. ピペット電球ガラス ピペットを使用して、酢酸亜鉛、スライド上に分散した薄層を形成の 5 滴を適用することでピンセットとコートのスライドとスライド ガラスを保持します。原液を滴下させる余分なソリューションを許可します。
5. 亜鉛アセテート コーティング面を上に向けて事前に加熱されたペトリ皿 (150-160 ° C) にスライドを配置します。15 分ホット プレートに残します。
6. ピンセットでスライドを削除し、室温に冷却します。白の縞を持つコーティングするスライドが表示されます。
7. 使い捨て可能なワイプを使用して顕著な白い縞を削除するスライドの残りは任意の余分な亜鉛を削除します。表面を均一にする必要があります。
8. 公開、無菌性を確保するため、少なくとも 1 時間のためのバイオ セーフティ フードの光の紫外線に準備されたスライド。
   注意: 紫外光は目に有害であるし、肌を露出しました。目や皮膚への直接露出を避けるため、使用していないときに電気供給をオフにします。

3. シリコーン アイソレータの作製

1. 正方形よりも小さい 1"× 1" にカット シリコン シート (アイソレータは 6 よく皿に収めることができるである必要があります)。
2. 生検パンチで正方形の中心に 8-12 mm の穴をパンチします。
3. 20 分間のオートクレーブ シリコーン絶縁 121.0 ° C および 1.12 kg/cm で。

4. PEG 溶液及びゲル合成のペグの準備

注: 機能化・重合 PEG の検討されている広範囲と前述の研究室や他の人によって。^{8,10,11,13,14,15,16,17}

1. RGD 細胞接着ペプチドを組み合わせてアクリロイル-ペグ-NHS 50 mM 炭酸水素ナトリウム (pH 8.5) のアクリル部分は、以前にされている生化学的反応とペプチドのアミン末端官能基化を有効にする 1:1 のモル比で効率 85% 以上を生成するために特徴付けられます。¹⁷
2. 300 mg/mL の濃度で 1-ビニル-2-ピロリドンと 2, 2-ジメトキシ-2-phenylacetophenone の混合光開始剤を準備します。
3. 1.5 mL チューブを別個で、以下重量を量り: ZnO 針 20 mg、ペグ-DA の 12.5 mg と 2.5 mg ペグ RGD の。
4. 270 μ 10 %fbs/PBS 溶液で酸化亜鉛針の 20 mg を中断します。ミックスする渦 (約 15 秒)。
5. 簡単に (< 1 s) スピン チューブのベースに、ZnO 凝集体を持ってベンチトップ ミニ遠心分離機のソリューション。
6. 集計をチューブの底におく、ZnO ソリューションの上から 250 μ L を収集します。約 2.5 mm RGD 止め釘の解決を作成するペグ DA とペグ RGD と組み合わせます。ミックスする渦 (約 15 秒)。
7. アセトフェノン/n ‐ ビニルピロリドン写真ハブと簡単にミックスする渦の 2 μ L を追加 (約 5 秒)。
8. ZnO コーティング スライドの中央に沿って高分子溶液 20 μ L を追加します。
9. ZnO コーティング面を上の 2 番目のスライドをゆっくりと下げるダウン (止め釘の解決は 2 つの ZnO 被覆層の間する必要があります)。空気の泡の形成を防止しようとします。任意の気泡を脱出し、薄い層にソリューションを普及するように主要な軸に沿って横にスライドを移動します。ポリマー溶液を使用してスライドの大部分をカバーします。後の手順でスライドを引き離すにことができることを確保するため一番上のスライドとわずかなオーバー ハングを作成します。
10. 架橋 15 分 365 nm の紫外線ランプ (約 10 mW/cm²) の下でスライド。

5. ペグのリリースがスライド ガラスからゲルします。

1. 張り出したスライドと手動でスライドを割ることを避ける 2 つのスライドを順番にゆっくりとしたペースで離れてプルに圧力を適用されます。少なくとも 5 分間乾燥一晩ゲルを許可します。
2. 滅菌 25 ミリメートルのガラス シャーレにスライドを配置し、優しくスライド (約 10-20 mL) をカバーする十分なだけを使用してスライドに 1 M 塩酸溶液を注ぐ。シャーレ; がみ合うゲルは、HCl 溶解亜鉛コーティングや針、スライドを持ち上げますが開始されます。ゲルはスライドから無料で、一度は、原液に HCl を注ぐ。
3. スライドとゲルが水中に沈むまでゆっくりペトリ皿に約 25 mL の 1x PBS を注ぐことによって、ジェルを洗い流してください。

慎重に PBS を廃棄物の容器に注ぐ。

ゲルがソリューションに浮かんでいるまで優しくペトリ皿に約 25 mL の 1x PBS を注ぐ。

ピンセットを使用して、慎重にゲルの下シリコーン アイソレータを引き出して、それにゲルを持ち上げます。

滅菌 1x PBS でいっぱい 6 よく皿にアイソレータとゲルを転送します。

すべてのゲルのスライドから削除されており、PBS につかってまでこのプロセスを繰り返します。無菌性を確保するため、少なくとも 1 時間のためのバイオ セーフティ フードに UV ライトに準備ができてゲルを公開します。

6. 細胞膜の播種

1. A549 細胞の播種を備えます。簡単に言えば、5 mL の 1x PBS で 75 cm²フラスコを洗い流し、0.25% の 3 mL を加えるトリプシン-EDTA と 37 ° C で 2 〜 3 分に座ってみましょう
   1. 機械的にフラスコを扇動、10% 胎仔ウシ血清および 1% ペニシリン-ストレプトマイシン、3 mL ダルベッコ変更イーグル媒体との反応を抑制し、15 mL の三角フラスコに収集します。完全なダルベッコ変更イーグル メディアの追加 4 mL で洗い、同じ円錐形にまとめます。6 分の 475 x g でセルをスピンします。
2. セルを回転している中、6 ウェル プレートの各ウェルに完全なダルベッコ変更イーグル中の小滴を追加します。ゲルはメディアのドロップの休憩など、新しい 6 ウェル プレートにゲルにシリコーン アイソレータを転送するのにピンセットを使用します。今では、ゲルは、薄層に広がっている、目に見えない大きな穴がないことを確認します。これは直前の細胞播種乾燥ゲルの割れを避けるためにされるべきであります。
3. 10% 胎児牛血清および 1% ペニシリン-ストレプトマイシン 6 × 10⁵セル/mL の濃度でダルベッコ変更イーグル培地で細胞を再懸濁します。パンチで抜いたシリコン膜部のメニスカスを維持しようとして、ゲルの中央に賢明な細胞懸濁液の滴を加えます。4 h の付着する細胞を許可します。
4. 4 h 後もダルベッコ変更イーグル完了の中の 0.5 mL を追加し、可能にする、完全密着の 37 ° C で一晩インキュベートします。、
5. 次の日に備える細胞播種 Huvec。
   1. 5 ml の 1x PBS の 75 cm²フラスコを洗い流し、0.25% の 3 mL を加えてトリプシン-EDTA と 37 ° C で 2 〜 3 分に座ってみましょう
   2. 機械的にフラスコを扇動、3 mL 20% 牛胎児血清、1% ペニシリン-ストレプトマイシン、1% の成長サプリメントと M199 メディアとの反応を抑制し、15 mL の円錐形に収集します。
   3. M199 完全なメディアの 4 mL で洗い、同じ円錐形にまとめます。6 分の 475 x g でセルをスピンします。
6. 下セルを回転している間は、新しい 6 ウェル プレートの各ウェルに完全培地 199 の小滴を追加します。シリコーンのセンターでメディアのドロップによく新しいシリコーン アイソレータを配置します。
7. 新しい 6 ウェル プレートのアイソレータに A549 細胞を PEG ゲルを支えるシリコーン アイソレータを反転慎重にピンセットを使用します。
8. 6 × 10⁵セル/mL の濃度で比較を再懸濁します、シリコン膜の打ち抜き領域内のゲルのメニスカスを維持しようとして、賢明な反転ゲル ドロップの中央に細胞懸濁液を追加します。2 h の付着する細胞を許可します。
9. 2 時間後優しく M199 完全なメディアの 2 mL を各ウェルに追加します。

7. 蛍光抗体法

1. 慎重に手動ピペットとゲルからメディアを削除し、セルのシード、ゲルの中央に 4% パラホルムアルデヒド (PFA) の約 500 μ L を追加します。室温で 30 分間座ってみましょう。
   注意: PFA は有毒な化学薬品;保護具を着用し、生物学的安全キャビネットで処理を行うようにします。
2. 慎重に PFA を削除し、PBS で 2 %bsa の約 500 μ L をゲルに追加します。室温で 1 時間放置します。
3. BSA を慎重に取り外します。Pbs は、2 %bsa で 1: 100 希釈で一次抗体を準備、500 μ L をゲルに追加します。室温で 1 時間放置します。500 μ L の 1x PBS で優しくすすぎます。
   1. 二次抗体と同じプロセスを繰り返します。以下の抗体: 1) 抗ひと CD144 (VE カドヘリン) クローン 16B1;2) 抗ひと CD324 (E-カドヘリン) クローン 6714;3) 抗ひと CD31 (PECAM-1) クローン C-20;4) アンチ A549;5) 抗マウス FITC;6) Alexa Fluor 647 の反やぎ。F-アクチンを可視化、ファロイジン 500 μ L を追加 (PBS で 10 μ g/mL) 20 分。
4. 慎重に二次抗体またはファロイジンを削除し、DAPI を 500 μ l 添加 (0.1 μ g/mL) 20 分の DAPI ソリューションを慎重に取り外し、ゲルが懸濁液で優しく各ウェルに 1.5 mL の 1x PBS を追加。
   1. ピンセットやシリコーン絶縁を使用して、スライド ガラスに 1 つのゲルを転送します。イメージング、直前にゲルのとイメージング後 PBS ソリューションにゲルを交換します。
   2. また、DAPI マウント媒体を使用してゲルをマウントします。シールもマニキュアとサンプル、乾燥とゲルの割れを防ぐために 2 日以内の画像を取得します。トラブルシューティングには、表 1 を参照してください。

結果

ペグ RGD ヒドロゲルは、2 つの犠牲酸化亜鉛層間高分子溶液を挟むと酸化亜鉛の針で毛穴テンプレートの作成によって形成されました。いけにえの亜鉛酸化物は塩酸、連続気孔 (図 1) と極薄のペグ ゲルを生成し取り外しました。酸化亜鉛針の形態を走査型電子顕微鏡 (SEM)、確認したし、それぞれ 3.92 ± 0.089 μ m および 0.43 ± 0.02 μ m にする平均の?...

ディスカッション

ここで詳細なプロトコルをバイオミメティック BM 足場として機能する可変ペグ ハイドロゲルを作成できました。具体的には、さまざまな PEG 分子量、ペプチドの活用戦略と酸化亜鉛微結晶構造や濃度、弾性率、生化学的性質と、ヒドロゲルの細孔構造変更できます、それぞれ。極薄のペグ足場は高い気孔密度と基底膜標準透過性のサポート モデル (表 2) と比較して体内で...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1M Hydrogel Chloride (HCl)	EMD	HX0603-75 2.5L	Sterile. Use in fume hood with eye protection and gloves.
1X PBS	Gibco	14040-133 500 mL	None
Zinc Nitrate Hexahydrate (Zn(NO3)2•6H2O)	Sigma-Aldrich	228737-500g	Use with eye protection and gloves.
Sodium Hydroxide (NaOH)	Macron Chemicals	278408-500g	Use with eye protection and gloves.
Zinc Acetate Dihydrate ((CH3O2)2Zn2+•2H2O)	Fisher Scientific	AC45180010 1 kg	Use with eye protection and gloves.
Methanol (CH3OH)	J.T. Baker	9070-05 4L	Use in fume hood with eye protection and gloves.
VWR Life Science Seradigm Premium Grade FBS	VWR	97068-085	Sterile filter. 5 mL FBS in 45 mL PBS
Mineral oil	CVS	PLD-B280B	None
Round bottom flask	ChemGlass		N/A
Thermometer			N/A
Stir bar			N/A
Plain precleaned microscope slides 3"x1"x1" mm thick	Thermo Scientific	420-004T	Spray with ethanol and let dry prior to use.
Glass pasteur pipets			N/A
1 mL rubber bulbs			N/A
Plastic 100 mm petri dishes			N/A
Sterile forceps			N/A
Silicone isolators			0.8 mm thick
Polydimethylsiloxane (PDMS) punches			N/A
Glass bottles			N/A
6 well plates	Cellstar	657 160	N/A
Filter Paper	Whatman	8519	N/A
Stirrer-hot plate	VWR Dya-Dual	12620-970	Use with eye protection and gloves.
2,2-Dimethoxy-2-phenylacetophenone (C6H5COC(OCH3)2C6H5	Sigma-Aldrich	24650-42-8	Use with eye protection and gloves.
1-Vinyl-2-pyrrolidone (C6H9NO)	Aldrich		Use with eye protection and gloves.
Polyethylene Glycol 10,000 (H(OCH2CH2)10,000OH)	Fluka	81280-1kg	Use with eye protection and gloves.
RGDS	Life Tein	180190	Use with eye protection and gloves.
Blak-Ray long wave UV lamp	UVP	Model B 100AP	N/A
Eppendorf tubes	USA Scientific	1615-5500	N/A