Coltura di cellule di idrogeli ultrasottile Innova elastico come una membrana dello scantinato biomimetici per Dual

Riepilogo

Modelli di cultura doppio strato attuali non consentono per studi funzionali in vitro che imitano microambienti in vivo . Utilizzando polietilene glicole e un metodo di applicazione di modelli di ossido di zinco, questo protocollo descrive lo sviluppo di una membrana basale biomimetici ultrasottile con rigidità sintonizzabile, porosità e composizione biochimica che imita molto attentamente in vivo matrici extracellulari.

Abstract

La membrana dello scantinato è un componente critico di doppii strati cellulari che possono variare in rigidità, composizione, architettura e porosità. Studi in vitro di bilayer endothelial epiteliali hanno tradizionalmente invocata permeabile supporto modelli che permettono la cultura di doppio strato, ma supporti permeabili sono limitati nella loro capacità di replicare la diversità delle membrane dello scantinato umane. Al contrario, modelli di idrogel che richiedono sintesi chimica sono altamente sintonizzabili e consentono le modifiche di sia la rigidità del materiale e la composizione biochimica tramite incorporazione di proteine e peptidi biomimetici. Tuttavia, idrogel tradizionali modelli funzionalità sono limitate perché mancano i pori per contatti cellula-cellula e funzionale in vitro gli studi di migrazione. Inoltre, a causa dello spessore di idrogeli tradizionali, incorporazione dei pori che abbracciano l'intero spessore di idrogeli è stato impegnativo. Nello studio presente, usiamo idrogeli poly-(ethylene-glycol) (PEG) e un metodo di applicazione di modelli di romanzo ossido di zinco per colmare le carenze precedenti di idrogeli biomimetici. Di conseguenza, vi presentiamo un idrogel ultrasottile, scantinato membrana-come che consente la cultura del bilayer cellulare confluente su un'impalcatura personalizzabile con architetture poro variabile, proprietà meccaniche e composizione biochimica.

Introduzione

Extracellulare (ECM) compongono i ponteggi di proteina che supportano il collegamento delle cellule e fungono da barriere tra tipi distinti delle cellule e sono una componente essenziale del complessi tessuti e organi. In contrasto con il tessuto connettivo interstiziale, la membrana basale (BM) è un tipo specializzato di ECM che agisce come una barriera per dividere compartimenti uno da altro. BMs sono circa 100 µm di spessore e quindi permettono una comunicazione diretta e indiretta tra cellule su entrambi i lati. Due esempi comuni di BMs sono BMs vascolare, trovato nella parete microvascolare tra cellule endoteliali e periciti e BMs delle vie respiratorie che si trovano tra le cellule endoteliali ed epiteliali. BMs svolgono un ruolo importante nella regolazione della funzione delle cellule, come polarità cellulare e la migrazione, nella salute e nella malattia. ¹ la composizione, rigidità, architettura e la porosità di BMs varia tra i sistemi dell'organo per facilitare le funzioni fisiologiche distinte. Ad esempio, i pori BM sono critici per il mantenimento della comunicazione della cellula-cellula, diffusione di molecola solubile e per la migrazione delle cellule immunitarie durante l'infiammazione o batteri durante l'infezione. Nelle vie aeree, pori span lo spessore completo del BM, con diametri che vanno da 0,75 a 3,86 µm.²

La natura sottile del BM assicura che anche se i tipi delle cellule sono fisicamente separati uno da altro, la comunicazione intercellulare tramite segnalazione di paracrine e contatto-mediated è conservata. Così, per studiare la malattia umana in vitro, i ricercatori hanno contato sugli inserti porosi supporto permeabile a bilayer cellulare cultura. ³ questi modelli sono stati critici per la comprensione della comunicazione cellulare che svolge un ruolo nella salute e nella malattia. ^{3 , 4 , 5 , 6 , 7} supporto permeabile inserti soddisfano i requisiti di base per la comprensione come segnalazione della cellula-cellula regola processi fisiologici, quali il reclutamento leucocitario e infiltrazione batterica; Tuttavia, gli inserti hanno limitazioni significative e non riescono a imitare un sostegno umano considerando Permeable inserti privi di accordabilità sia meccanica che biochimica e la struttura porosa semplicistica non imitare la struttura fibrosa che crea i pori irregolari tipico di BMs. Di conseguenza, c'è un crescente bisogno di sistemi sintonizzabile che può ricreare la proprietà native di BM che influenzano i processi cellulari.

Substrati a base di polimeri sono candidati ideali per lo sviluppo di biomimetic BMs per studiare bilayer cellulare in un contesto che imita più da vicino l'ambiente in vivo . ^{8 , 9 , 10 , 11 , 12} polimeri sono meccanicamente sintonizzabile e possono essere modificati chimicamente per incorporare frammenti peptidici biomimetic. ^{11 , 12 , 13} il polimero bioinerte polietilenglicole (PEG) può essere usato per costruire biomimetici BMs e lavoro recente ha dettagliato la sintesi di gel di acido arginina-glicina-aspartico (RGD) PEG meccanicamente sintonizzabile con reti porosi che supportano la crescita delle cellule e chemiotassi di cellule infiammatorie. ¹⁴ anche se pubblicati basati su PEG substrati forniva un modello più realistico di un ECM umano rispetto a supporti permeabili, molti di questi modelli sono estremamente spesse, con una profondità di circa 775 µm che limita la possibilità di creare culture doppio strato con cellulare contatti. ¹⁴

Qui, presentiamo un protocollo per la creazione di un piolo a base di polimeri mimic BM che supera molte delle limitazioni delle attuali tecnologie di cultura cellulare doppio strato. Abbiamo sviluppato un metodo di templating che incorpora il polimero durante la sintesi e la reticolazione, che viene successivamente e selettivamente rimosso dall'ossido di zinco, un materiale ampiamente usato per la fabbricazione di produzione microcristallina, il polimero di massa risultante. Questo processo genera una rete porosa casuale, che imita la rete di pori interconnessi e tortuoso di BMs umano. Ulteriormente, la porosità può essere modificata cambiando la dimensione e la forma i microcristalli di ossido di zinco tramite la modifica della stechiometria di reazione durante la produzione dell'ago. La tecnica sviluppata qui crea un idrogel ultrasottile che imita lo spessore umano considerando infine, la meccanica, la porosità e la composizione biochimica di questi costrutti BM-come può essere modificata facilmente per generare un microambiente che è più simile a quello visto in vivo.

Protocollo

Si prega di leggere Material Safety Data Sheet (MSDS) di tutti i materiali precedenti per utilizzare e utilizzare precauzioni di sicurezza a tutte le volte.

1. sintesi di ossido di zinco aghi

1. Preparare 250 mL di Zn (NO₃) 0.04 M₂* 6 H₂O soluzione aggiungendo 2,9749 g di nitrato di zinco a 250 mL di acqua.
2. Preparare 150 mL di NaOH M 1 con l'aggiunta di 6 g di NaOH per 150 mL di acqua.
3. Impostare un bagno di olio minerale su una piastra riscaldante con agitatore e immergere un pallone da 500 mL fondo tondo in bagno d'olio a temperatura ambiente.
4. Aggiungere 250 mL di Zn (NO₃)₂* 6 H₂O al pallone e iniziare mescolando la reazione.
5. Aggiungere 150 mL di soluzione di NaOH (un precipitato bianco formeranno brevemente e poi spariscono come le due soluzioni continuano a mescolare). Mescolare per 2 h scoperto.
6. Riscaldare il pallone a 55-60 ° C e continuate a mescolare per 24 h.
7. Spegnete il fuoco e lasciare soluzione raffreddare a temperatura ambiente mescolando.
8. Filtrare la soluzione su un filtro Büchner con un diametro dei pori 11 µm e lasciare per asciugare tutta la notte, scoperti. Quando il filtro di carta non è più bagnato dalla soluzione versata e una polvere bianca si è formata sopra i fori di imbuto, le particelle sono completamente secchi.
9. Raccogliere gli aghi ZnO e preparare per la microscopia elettronica (SEM) per confermare la morfologia aghiforme. Brevemente, montare nastri di carbonio su un albero mozzo del perno e utilizzare una spatola di metallo di striscio gli aghi di ZnO sul nastro di carbonio. Sputter cappotto con iridium 8mm ad una densità di 22,4 g/cm³ e acquisire immagini a 10 kV.

2. aggiunta dello strato di zinco sacrificale su vetrini da microscopio per HCl induce rilascio di PEG

1. Preparare soluzione di acetato di zinco sciogliendo 1,756 g di acetato di zinco in 200 mL di metanolo.
2. Pulire 3 "x 1" vetrini da microscopio semplice con etanolo al 70% e una salvietta USA e getta. Asciugare all'aria per 10 min.
3. Posizionare un bicchiere di 150 mm su una piastra di Petri e preriscaldare a 150-160 ° C.
4. Utilizzando una pipetta di vetro con una lampadina di dispensare, tenere i vetrini con pinzette e cappotto diapositive applicando 5 gocce di acetato di zinco, formando uno strato sottile dislocato sulla diapositiva. Consentire la soluzione in eccesso a gocciolare nuovamente dentro la soluzione di riserva.
5. Porre il vetrino in pre-riscaldato di Petri (150-160 ° C) con il lato rivestito di acetato di zinco rivolto verso l'alto. Lasciare sulla piastra riscaldante per 15 min.
6. Rimuovere il vetrino con le pinzette e lasciarla raffreddare a temperatura ambiente. La diapositiva verrà visualizzata da rivestire con striature bianche.
7. Rimuovere qualsiasi eccesso di zinco che rimane sulle diapositive servendosi di un panno monouso per rimuovere prominente striature bianche. La superficie deve essere uniforme.
8. Esporre i vetrini preparati ai raggi UV della luce in una cappa di biosicurezza per almeno 1 h per garantire la sterilità.
   Attenzione: La luce UV è dannosa per gli occhi e la pelle esposta. Evitare l'esposizione diretta agli occhi o alla pelle e spegnere alimentazione elettrica quando non in uso.

3. preparazione degli isolatori di Silicone

1. Foglio di silicone tagliato in quadrati a meno di 1 "x 1" (Isolatori devono essere in grado di adattarsi in un piatto 6 pozzetti).
2. 8-12 mm fori al centro delle piazze di perforazione con un pugno di biopsia.
3. Isolatori di silicone di autoclave per 20 min a 121,0 ° C e 1,12 kg/cm.

4. preparazione della soluzione di PEG e PEG Gel sintesi

Nota: Funzionalizzazione e polimerizzazione di PEG è stato ampiamente esplorato e dettagliato in precedenza dal nostro laboratorio e altri. ^{8 , 10 , 11 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17}

1. Combinare il peptide di adesivo cellulare RGD con acriloil-PEG-NHS in bicarbonato di sodio di 50 mM (pH 8.5) con un rapporto molare 1:1 per abilitare la funzionalizzazione del terminus amminico del peptide con la frazione di acrilato, una reazione biochimica che è stato tradotto caratterizzata per rendimenti superiori al 85% di efficienza. ¹⁷
2. Preparare foto-iniziatore con 2,2-dimetossi-2-phenylacetophenone con 1-vinil-2-pirrolidone, ad una concentrazione di 300 mg/mL.
3. In separate provette da 1,5 mL, pesare quanto segue: 20 mg di ZnO aghi e 12,5 mg di PEG-DA 2,5 mg di PEG-RGD.
4. Sospendere 20 mg di ZnO aghi in 270 µ l di soluzione al 10% FBS/PBS; vortice di mescolare (circa 15 s).
5. Brevemente (< 1 s) girare la soluzione in una benchtop mini centrifuga per portare qualsiasi aggregazione di ZnO alla base del tubo.
6. Raccogliere 250 µ l dalla parte superiore della soluzione ZnO, per garantire che gli aggregati restano nella parte inferiore del tubo. Combinare con PEG-DA e PEG-RGD per creare una soluzione di PEG con circa 2,5 millimetri RGD. Vortice di mescolare (circa 15 s).
7. Aggiungere 2 µ l di acetofenone/n-vinilpirrolidone foto-iniziatore e vortexare brevemente per mescolare (circa 5 s).
8. Aggiungere 20 µ l di soluzione polimerica lungo il centro delle diapositive ZnO rivestito.
9. Abbassare lentamente una seconda diapositiva sulla parte superiore, con il volto di rivestimento di ZnO giù (la soluzione di PEG dovrebbe essere tra due strati di ZnO rivestito). Se si tenta di prevenire la formazione di bolle d'aria. Spostare le diapositive lateralmente lungo l'asse maggiore per consentire eventuali bolle a fuggire e a diffondere la soluzione di un sottile strato. Coprono la maggior parte del vetrino con la soluzione di polimero. Creare una leggera sporgenza con la slitta superiore per assicurare che le diapositive possono essere tirate a parte nei passaggi successivi.
10. Crosslink le diapositive sotto una lampada nm UV 365 (circa 10 mW/cm²) per 15 min.

5. rilascio di PEG gel da lastre di vetro

1. Applicare pressione la diapositiva strapiombante e manualmente tirare che le due diapositive apart a un ritmo lento nell'ordine evitare screpolature le diapositive. Consentire i gel ad asciugare per almeno 5 min, o durante la notte.
2. Porre il vetrino in un bicchiere di 25mm sterile capsula di Petri e delicatamente versare la soluzione di HCl 1 M sulla diapositiva, utilizzando solo abbastanza per coprire il vetrino (circa 10-20 mL). Scuotere delicatamente la capsula di Petri; il gel dovrebbe cominciare a sollevare la diapositiva come l'HCl si dissolve il rivestimento di zinco sacrificale e aghi. Una volta che il gel è libero dalla diapositiva, versare l'HCl nella soluzione di riserva.
3. Risciacquare il gel versando delicatamente circa 25 mL di PBS 1X in di Petri fino a quando la diapositiva e gel sono sommerso.

Versare con cura di PBS in un contenitore per rifiuti.

Delicatamente versare circa 25 mL di PBS 1X di Petri fino a quando il gel è fluttuante nella soluzione.

Con una pinzetta, estrarre l'isolatore del silicone sotto il gel delicatamente e sollevare il gel su di esso.

Trasferire l'isolatore e il gel in un piatto di 6 pozzetti riempito con PBS 1X sterile.

Ripetere questo processo finché tutti i gel sono stati rimossi dalle diapositive e sono immersi in PBS. Esporre i gel preparati alla luce UV in una cappa di biosicurezza per almeno 1 h per garantire la sterilità.

6. semina cellulare bilayer

1. Prepararsi la semina di cellule A549. Brevemente, sciacquare un pallone da² 75 cm con 5 mL di PBS 1X, aggiungere 3 mL di 0,25% tripsina-EDTA e lasciare riposare per 2-3 min a 37 ° C.
   1. Meccanicamente agitare la beuta, placare la reazione con il mezzo di Eagle per volta di 3ml Dulbecco con 10% fetale bovino del siero e l'1% penicillina-streptomicina e raccogliere in una beuta da 15 mL. Sciacquare con un ulteriore 4 mL di completa di Dulbecco per volta Eagle Media e raccogliere nello stesso conico. Girare le cellule a 475 x g per 6 min.
2. Mentre le cellule ruotano verso il basso, aggiungere una piccola goccia di Medium di Eagle di Dulbecco completa per volta a ciascun pozzetto di una piastra a 6 pozzetti. Utilizzare una pinzetta per trasferire gli isolatori di silicone con il gel nella nuova piastra 6-pozzetti, tale che il gel sta riposando sul drop dei media. Ora che i gel sono distribuite in uno strato sottile, verificare che non ci sono grandi fori visibili ad occhio. Questo dovrebbe essere fatto immediatamente prima della semina delle cellule per evitare secchezza e screpolature dei gel.
3. Risospendere le cellule in un mezzo di Eagle per volta di Dulbecco con 10% fetale bovino del siero e l'1% penicillina-streptomicina ad una concentrazione di 6 x 10⁵ cellule/mL. Aggiungere la cella sospensione goccia saggio al centro del gel, cercando di mantenere un menisco in zona perforato fuori della membrana in silicone. Consentire alle cellule di aderire per 4 h.
4. Dopo 4 h, aggiungere 0,5 mL di terreno completo per l'aquila di Dulbecco per volta nel pozzetto e incubare per una notte a 37 ° C per consentire un'adesione completa.
5. Il giorno seguente, preparare HUVECs per la semina delle cellule.
   1. Sciacquare un pallone da² 75 cm con 5 mL di 1X PBS, aggiungere 3 mL di 0,25% tripsina-EDTA e lasciare riposare per 2-3 min a 37 ° C.
   2. Meccanicamente agitare la beuta, placare la reazione con 3ml M199 media con 20% di siero fetale bovino, 1% di penicillina-streptomicina e supplemento di crescita dell'1% e raccogliere in un conico da 15 mL.
   3. Sciacquare con 4 mL di M199 multimediale completo e raccogliere nello stesso conico. Girare le cellule a 475 x g per 6 min.
6. Mentre le cellule ruotano verso il basso, aggiungere una piccola goccia di completa medium 199 in ciascun pozzetto in una nuova piastra 6 pozzetti. Posto un nuovo isolatore in silicone nel pozzo con la goccia di media nel centro del silicone.
7. Con una pinzetta, capovolgere attentamente l'isolatore in silicone gel PEG con cellule A549 sull'isolatore di supporto nella nuova piastra 6 pozzetti.
8. Risospendere HUVECs ad una concentrazione di 6 x 10⁵ cellule/mL e aggiungere la sospensione delle cellule al centro della goccia del gel capovolte saggio, cercando di mantenere un menisco sul gel all'interno della zona perforata fuori della membrana in silicone. Consentire alle cellule di aderire per 2 h.
9. Dopo 2 h, delicatamente aggiungere 2 mL di M199 completa per i media in ciascun pozzetto.

7. immunofluorescenza

1. Con attenzione rimuovere supporti dai gel con una pipetta manuale e aggiungere circa 500 µ l di paraformaldeide al 4% (PFA) al centro del gel dove le cellule sono seminate. Lasciate riposare per 30 min a temperatura ambiente.
   Attenzione: PFA è un prodotto chimico tossico; indossare una protezione e assicurare la gestione viene effettuata in una cappa di sicurezza biologica.
2. Rimuovere il PFA delicatamente e aggiungere circa 500 µ l di 2% BSA in PBS per ogni gel. Lasciate riposare per 1 ora a temperatura ambiente.
3. Rimuovere con cautela la BSA. Preparare gli anticorpi primari ad una diluizione di 1: 100 in 2% BSA in PBS e aggiungere 500 µ l per ogni gel. Lasciate riposare per 1 ora a temperatura ambiente. Sciacquare delicatamente con 500 µ l di PBS 1X.
   1. Ripetere lo stesso processo con gli anticorpi secondari. Utilizzare i seguenti anticorpi: 1) anti-umano CD144 (VE-caderina) clone 16B1; 2) anti-umano CD324 (E-caderina) clone 6714; 3) anti-umani CD31 clone (PECAM-1) C-20; 4) anti-A549; 5) anti-topo FITC; 6) anti-capra Alexa Fluor 647. Per visualizzare F-actina, aggiungere 500 µ l di falloidina (10 µ g/mL in PBS) per 20 min.
4. Rimuovere gli anticorpi secondari o falloidina delicatamente e aggiungere 500 µ l di DAPI (0,1 µ g/mL) per 20 min. rimuovere con attenzione la soluzione DAPI e delicatamente aggiungere 1,5 mL di PBS 1X in ciascun pozzetto in modo che i gel sono in sospensione.
   1. Utilizzando pinzette e silicone isolatori, trasferire un gel per una lastra di vetro. Eseguire questa operazione per ogni gel immediatamente prima di formazione immagine e sostituire il gel nella soluzione di PBS dopo formazione immagine.
   2. In alternativa, montare gel utilizzando un mezzo di montaggio DAPI. Sigillare bene i campioni con smalto, acquisire immagini entro 2 giorni per evitare secchezza e screpolature del gel. Fare riferimento alla tabella 1 per la risoluzione dei problemi.

Risultati

PEG-RGD idrogeli formarono sandwiching la soluzione di polimero tra due strati di ossido di zinco sacrificale e creazione di modelli di poro con aghi di ossido di zinco. Ossido di zinco sacrificale componenti allora sono state rimosse con acido cloridrico, generando ultrasottile PEG idrogel con pori continui (Figura 1). La morfologia degli aghi di ossido di zinco è stata confermata da microscopia elettronica (SEM), e la media lunghezza e larghezza sono stati...

Discussione

Il protocollo dettagliato qui ci ha permesso di creare un idrogel di PEG sintonizzabile per servire come uno scaffold biomimetici BM. In particolare, di diversi pesi molecolari di PEG, strategie di Coniugazione del peptide e strutture microcristallina di ossido di zinco o concentrazioni, il modulo elastico, proprietà biochimiche e la struttura porosa nel caso degli idrogeli sono modificabili, rispettivamente. L'impalcatura di PEG ultrasottile offre una maggiore densità dei pori e un diametro dei pori più piccolo che ?...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1M Hydrogel Chloride (HCl)	EMD	HX0603-75 2.5L	Sterile. Use in fume hood with eye protection and gloves.
1X PBS	Gibco	14040-133 500 mL	None
Zinc Nitrate Hexahydrate (Zn(NO3)2•6H2O)	Sigma-Aldrich	228737-500g	Use with eye protection and gloves.
Sodium Hydroxide (NaOH)	Macron Chemicals	278408-500g	Use with eye protection and gloves.
Zinc Acetate Dihydrate ((CH3O2)2Zn2+•2H2O)	Fisher Scientific	AC45180010 1 kg	Use with eye protection and gloves.
Methanol (CH3OH)	J.T. Baker	9070-05 4L	Use in fume hood with eye protection and gloves.
VWR Life Science Seradigm Premium Grade FBS	VWR	97068-085	Sterile filter. 5 mL FBS in 45 mL PBS
Mineral oil	CVS	PLD-B280B	None
Round bottom flask	ChemGlass		N/A
Thermometer			N/A
Stir bar			N/A
Plain precleaned microscope slides 3"x1"x1" mm thick	Thermo Scientific	420-004T	Spray with ethanol and let dry prior to use.
Glass pasteur pipets			N/A
1 mL rubber bulbs			N/A
Plastic 100 mm petri dishes			N/A
Sterile forceps			N/A
Silicone isolators			0.8 mm thick
Polydimethylsiloxane (PDMS) punches			N/A
Glass bottles			N/A
6 well plates	Cellstar	657 160	N/A
Filter Paper	Whatman	8519	N/A
Stirrer-hot plate	VWR Dya-Dual	12620-970	Use with eye protection and gloves.
2,2-Dimethoxy-2-phenylacetophenone (C6H5COC(OCH3)2C6H5	Sigma-Aldrich	24650-42-8	Use with eye protection and gloves.
1-Vinyl-2-pyrrolidone (C6H9NO)	Aldrich		Use with eye protection and gloves.
Polyethylene Glycol 10,000 (H(OCH2CH2)10,000OH)	Fluka	81280-1kg	Use with eye protection and gloves.
RGDS	Life Tein	180190	Use with eye protection and gloves.
Blak-Ray long wave UV lamp	UVP	Model B 100AP	N/A
Eppendorf tubes	USA Scientific	1615-5500	N/A