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  • Résumé
  • Résumé
  • Introduction
  • Protocole
  • Résultats
  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Les modèles actuels de culture bicouche ne permettent pas des études fonctionnelles in vitro qui imitent en vivo microenvironnements. À l’aide de polyéthylène glycol et une méthode de création de modèles d’oxyde de zinc, ce protocole décrit le développement d’une membrane de sous-sol biomimétique ultra-mince avec rigidité ajustable, la porosité et la composition biochimique qui imite étroitement en vivo matrices extracellulaires.

Résumé

La membrane basale est un élément essentiel des bicouches cellulaires qui peut varier dans la rigidité, la composition, architecture et porosité. Études in vitro des bicouches endothéliales épithéliaux comptent traditionnellement sur des modèles de soutien perméables qui permettent la culture de bicouche, mais les supports perméables sont limités dans leur capacité à reproduire la diversité des humains des membranes basales. En revanche, hydrogel modèles nécessitant une synthèse chimique sont hautement accordables et permettent des modifications de la rigidité du matériau et la composition biochimique par incorporation de protéines ou de peptides biomimétiques. Cependant, les modèles traditionnels d’hydrogel sont limitées à fonctionnalité parce qu’ils manquent de pores pour contacts cellule-cellule et fonctionnelle in vitro les études de la migration. En outre, en raison de l’épaisseur des hydrogels traditionnelles, incorporation des pores qui s’étendent sur toute l’épaisseur des hydrogels a été difficile. Dans la présente étude, nous utilisons des hydrogels poly-(ethylene-glycol) (PEG) et une méthode de création de modèles de roman d’oxyde de zinc à combler les lacunes antérieures des hydrogels biomimétique. Par conséquent, nous présentons un hydrogel ultramince, membrane basale-like qui permet la culture de bicouches cellulaires confluentes sur un échafaud personnalisable avec pore variable architectures, propriétés mécaniques et composition biochimique.

Introduction

Les matrices extracellulaires (ECM) composent les échafaudages de protéine qui soutiennent la fixation des cellules et servent de barrières entre les types cellulaires distincts et constituent une composante essentielle du complexes tissus et organes. Contrairement au tissu conjonctif interstitiel, la membrane basale (BM) est un type spécialisé de ECM qui agit comme une barrière pour diviser les compartiments tissulaires de l’un de l’autre. BMs environ 100 µm d’épaisseur et donc permettant une communication directe et indirecte entre les cellules de chaque côté. Deux exemples courants de BMs sont vasculaires BMs, trouvées dans la paroi microvasculaire entre les péricytes et les cellules endothéliales et BMs des voies aériennes qui sont trouvent entre les cellules endothéliales et épithéliales. BMs jouent un rôle important dans la régulation de la fonction des cellules, telles que la polarité cellulaire et migration, sain ou malade. 1 la composition, rigidité, architecture et porosité du BMs varie de systèmes d’organes pour faciliter les fonctions physiologiques distinctes. Par exemple, BM pores sont essentiels pour le maintien de la cellule-cellule communication, diffusion de la molécule soluble et pour la migration des cellules immunitaires au cours de l’inflammation ou des bactéries lors de l’infection. Dans les voies respiratoires, pores couvrent la pleine épaisseur de la BM, d’un diamètre allant de 0,75 à 3,86 µm.2

La nature mince de la BM assure que même si les types de cellules sont physiquement séparés l’un de l’autre, la communication intercellulaire via paracrine et contact-signalisation médiée par est préservée. Ainsi, pour étudier les maladies humaines in vitro, les chercheurs comptent sur insertions de support perméable poreux à doubles couches cellulaires de la culture. 3 ces modèles ont été essentiels pour la compréhension de la communication cellulaire qui joue un rôle dans la santé et la maladie. 3 , 4 , 5 , 6 , 7 support perméable insertions satisfont les exigences de base pour comprendre comment cellule-cellule signalisation régule les processus physiologiques, tels que le recrutement des leucocytes et infiltration bactérienne ; Toutefois, les foyers ont des limitations importantes et ne parviennent pas à imiter un soutien humain de BM. perméable insertions manquent d’accordabilité mécanique et biochimique et la structure poreuse simpliste n’imite pas la structure fibreuse qui crée les pores irréguliers typique de BMs. Par conséquent, il y a un besoin croissant pour les systèmes accordables peut recréer les propriétés natives de BM qui influent sur les processus cellulaires.

Substrats à base de polymères sont des candidats idéaux pour le développement de la biomimétique BMs pour étudier des bicouches cellulaires dans un contexte qui imite mieux l’environnement in vivo . 8 , 9 , 10 , 11 , 12 polymères sont mécaniquement accordables et peuvent être chimiquement modifiés afin d’incorporer des fragments de peptide biomimétique. 11 , 12 , 13 le bioinert polymère polyéthylène glycol (PEG) peut être utilisé pour construire biomimétique BMs et travaux récents a détaillé la synthèse des gels d’arginine-glycine-aspartique (RGD) PEG mécaniquement accordables avec réseaux poreux qui soutiennent la croissance des cellules et chimiotactisme des cellules inflammatoires. 14 bien que publié axée sur le PEG substrats a fourni un modèle plus réaliste d’un ECM humaine que supports perméables, beaucoup de ces modèles sont très épais, avec une profondeur d’environ 775 µm qui limite la possibilité de créer des cultures bicouche avec cellule-cellule contacts. 14

Nous présentons ici un protocole pour la création d’un imitateur BM-à base de polymère PEG qui dépasse de beaucoup les limites des technologies actuelles de la culture du bicouche cellulaire. Nous avons développé une méthode de création de modèles qui incorpore d’oxyde de zinc, un matériau utilisé pour la fabrication de production microcristalline, le polymère au cours de la synthèse et la réticulation, qui est par la suite et sélectivement supprimée de la polymère résultant de vrac. Ce processus génère un réseau poreux aléatoire, imitant le réseau de pores interconnectés et tortueux de BMs humaines. En outre, la porosité peut être modifiée en changeant la taille et la forme de l’oxyde de zinc de microcristaux par une modification de la stoechiométrie de la réaction au cours de la production de l’aiguille. La technique développée ici crée un hydrogel ultra-mince qui imite l’épaisseur humaine BM. Enfin, la mécanique, la porosité et la composition biochimique de ces constructions comme BM peut facilement être modifiée pour générer un micro-environnement qui est la plus semblable à celui vu en vivo.

Protocole

S’il vous plaît lire matériel fiche signalétique (FS) de tous les documents préalables pour utiliser utiliser les mesures de sécurité à tous les temps.

1. synthèse des aiguilles de l’oxyde de Zinc

  1. Préparer 250 mL de Zn (NO3) 0,04 M2* solution2O 6 H en ajoutant 2,9749 g de nitrate de zinc à 250 mL d’eau.
  2. Préparer 150 mL de 1 NaOH M en ajoutant 6 g de NaOH à 150 mL d’eau.
  3. Mettre en place un bain d’huile minérale sur une plaque chauffante avec agitateur et submerger un ballon à fond rond de 500 mL dans le bain d’huile à la température ambiante.
  4. Ajouter 250 mL de Zn (NO3)2* 6 H2O au ballon et commencent à remuer la réaction.
  5. Ajouter 150 mL de solution de NaOH (un précipité blanc se forment brièvement et puis disparaissent et continuent de mélanger les deux solutions). Remuez pendant 2 h à découvert.
  6. Chauffer le ballon à 55-60 ° C et continuer à remuer pendant 24 h.
  7. Eteignez le feu et laisser la solution refroidir à température ambiante tout en remuant.
  8. Filtrer la solution sur un entonnoir Büchner avec une taille de pore de 11 µm et laisser pour sécher une nuit ou plus, non couvert. Lorsque le filtre en papier n’est plus humide de la solution coulée et une poudre blanche s’est formé sur les trous de l’entonnoir, les particules sont complètement desséchées.
  9. Recueillir des aiguilles de ZnO et se préparer pour la microscopie électronique (MEB) pour confirmer la morphologie aciculaires. Brièvement, bande de carbone sur une fusée de broche de monter et utiliser une spatule métallique pour salir les aiguilles de ZnO sur la cassette de carbone. Bredouiller manteau avec iridium de 8 mm avec une densité de 22,4 g/cm3 et d’acquérir des images à 10 kV.

2. Ajout de la couche de Zinc sacrificielle sur lames de Microscope pour HCl induit la libération de PEG

  1. Préparer la solution d’acétate de zinc en dissolvant 1,756 g d’acétate de zinc dans 200 mL de méthanol.
  2. Nettoyer 3 "x 1" plain lames avec l’éthanol à 70 % et une lingette jetable. Laisser sécher à l’air pendant 10 min.
  3. Placer un verre de 150 mm sur une plaque chauffante de Pétri et préchauffer à 150-160 ° C.
  4. À l’aide d’une pipette de verre avec une ampoule de pipette, tenir les lames de verre avec des pincettes et manteau diapositives par appliquer 5 gouttes d’acétate de zinc, formant une couche mince dispersée sur la diapositive. Permettent l’excédent de solution au goutte à goutte en solution mère.
  5. Placer la lame dans la boîte de Pétri préchauffé (150-160 ° C) avec le côté d’acétate enduit zinc vers le haut. Laisser sur la plaque chauffante pendant 15 min.
  6. Supprimer la diapositive avec des pincettes et laisser refroidir à température ambiante. La diapositive s’affiche à peindre avec des stries blanches.
  7. Enlever tout excès zinc qui est restant sur les diapositives à l’aide d’une lingette jetable pour enlever des stries blanches. La surface doit être homogène.
  8. Exposer le les lames préparées aux UV lumière sous une hotte de sécurité biologique pendant au moins 1 h assurer la stérilité.
    ATTENTION : La lumière UV est nocif pour les yeux et la peau exposée. Éviter l’exposition directe à la peau ou les yeux et s’éteindra alimentation électrique quand ne pas utiliser.

3. préparation des isolateurs de Silicone

  1. Feuille de silicone coupées en carrés de moins de 1 "x 1" (isolateurs doivent pouvoir se glisser dans un plat de 6 puits).
  2. Percer des trous de 8 à 12 mm dans le Centre des carrés avec un poinçon de biopsie.
  3. Isolateurs de silicone autoclave pendant 20 min à 121,0 ° C et 1,12 kg/cm.

4. préparation de la solution de PEG et synthèse de Gel PEG

Remarque : Fonctionnalisation et polymérisation de PEG a été abondamment exploré et décrite par notre laboratoire et d’autres. 8 , 10 , 11 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17

  1. Combiner le peptide RGD cellule adhésive avec acryloyl-PEG-NHS au bicarbonate de sodium de 50 mM (pH 8,5) dans un rapport molaire de 1:1 pour permettre la fonctionnalisation du terminus aminé du peptide avec la portion de l’acrylate d’éthyle, une réaction biochimique qui a été précédemment caractérisé à rendement supérieur à 85 % d’efficacité. 17
  2. Préparer photo-initiateur en mélangeant 2, 2-diméthoxy-2-phenylacetophenone avec la 1-Vinyl-2-pyrrolidone à une concentration de 300 mg/mL.
  3. En séparez les tubes de 1,5 mL, peser ce qui suit : 2,5 mg de PEG-RGD 20 mg d’aiguilles de ZnO et 12,5 mg de PEG-DA.
  4. Suspendre les 20 mg de ZnO aiguilles 270 µL de solution de 10 % FBS/PBS ; Vortex à mélanger (environ 15 s).
  5. Brièvement (< 1 s) tourner la solution dans une centrifugeuse de paillasse mini de porter n’importe quel agrégat de ZnO à la base du tube.
  6. Prélever 250 µL du haut de la solution de ZnO, afin que les agrégats restent au fond du tube. Combiner avec PEG-DA et PEG-RGD pour créer une solution de PEG avec environ 2,5 mM RGD. Vortex à mélanger (environ 15 s).
  7. Ajouter 2 µL de l’acétophénone/n-vinyl pyrrolidone photo-initiateur et vortexer brièvement pour mélanger (environ 5 s).
  8. Ajouter 20 µL de la solution de polymère le long du Centre des diapositives ZnO enduit.
  9. Abaissez lentement une deuxième diapositive sur le dessus, avec le visage enduit de ZnO (la solution de PEG devrait être entre deux couches d’enduit de ZnO) en bas. Essayez d’éviter la formation de bulles d’air. Déplacer les diapositives latéralement le long de l’axe principal pour permettre les bulles s’échapper et à se répandre la solution d’une fine couche. Couvrir la majorité de la diapositive avec la solution de polymère. Créer un léger surplomb avec la glissière supérieure pour s’assurer que les diapositives peuvent être tirés à part dans les étapes ultérieures.
  10. Crosslink les diapositives sous une lampe à 365 nm UV (environ 10 mW/cm2) pendant 15 min.

5. libération de PEG gelées de lames de verre

  1. Appliquer une pression au surplomb diapositive et tirez que les deux glissières apart à un rythme lent afin de ne pas fendre les diapositives manuellement. Laissez les gels sécher pendant au moins 5 minutes, ou jusqu’au lendemain.
  2. Placez la lame dans un verre stérile 25 mm boîte de Pétri et verser doucement la solution de HCl 1 M sur le toboggan, en utilisant juste assez pour couvrir la diapositive (environ 10 à 20 mL). Balançant doucement la boîte de Pétri ; le gel devrait commencer à soulever hors de la diapositive comme le HCl dissout le zingage sacrificiel et les aiguilles. Une fois que le gel est exempt de la diapositive, reversez le HCl dans la solution mère.
  3. Rincer le gel en le versant doucement environ 25 mL de PBS 1 x dans la boîte de Pétri jusqu'à ce que la lame et le gel sont submergées.
Décanter soigneusement PBS dans un conteneur à déchets.
  • Verser environ 25 mL de PBS 1 x dans la boîte de Pétri doucement jusqu'à ce que le gel est flottant dans la solution.
  • À l’aide de pinces à épiler, faites coulisser soigneusement l’isolateur de silicone sous le gel et lever le gel sur elle.
  • Transférer l’isolateur et le gel dans une boite de 6 puits remplie avec du PBS stérile 1 x.
  • Répétez ce processus jusqu'à ce que tous les gels ont été retirés de la glisse et sont tremper dans du PBS. Exposer les gels préparés à la lumière UV dans une hotte de sécurité biologique pendant au moins 1 h assurer la stérilité.

    • 6. semis cellule bicouches

    1. Préparer les cellules A549 pour l’amorçage. En bref, une fiole de2 75 cm avec 5 mL de PBS 1 x de rinçage, ajouter 3 mL de 0,25 % trypsine-EDTA et laissez reposer pendant 2-3 min à 37 ° C.
      1. Mécaniquement agiter la fiole, étancher la réaction avec le milieu Eagle de la modification de 3 mL Dulbecco avec 10 % fœtale bovine sérique et 1 % la pénicilline-streptomycine et recueillir dans une fiole conique de 15 mL. Rincer avec une autre 4 mL de médias de Eagle modifié de Dulbecco complet et recueillir dans le même conique. Faire tourner les cellules à 475 x g pendant 6 min.
    2. Tandis que les cellules se tournent vers le bas, ajouter une petite goutte de milieu d’Eagle modifié de Dulbecco complète dans chaque puits d’une plaque de 6 puits. Utiliser des pinces pour transférer les isolateurs de silicone avec les gels dans la nouvelle plaque 6 puits, tels que le gel se repose sur la chute des médias. Maintenant que les gels sont répartis en une fine couche, vérifiez qu’il n’y a pas de gros trous visibles à le œil. Cela devrait être fait immédiatement avant la cellule semis afin d’éviter le séchage et la fissuration des gels.
    3. Remettre en suspension les cellules dans un milieu Eagle de la modification de Dulbecco avec 10 % fœtale bovine sérique et 1 % la pénicilline-streptomycine à une concentration de 6 x 105 cellules/mL. Ajouter la goutte de suspension cellulaire sage vers le centre du gel, essayant de maintenir un ménisque dans la région a poinçonné dehors de la membrane de silicone. Permettre aux cellules d’adhérer pendant 4 h.
    4. Après 4 h, ajouter 0,5 mL de milieu complet de Dulbecco Modified Eagle dans le puits et incuber une nuit à 37 ° C pour permettre une adhésion complète.
    5. Le lendemain, préparer des HUVECs pour l’ensemencement de la cellule.
      1. Rincer un ballon de2 75 cm avec 5 mL de solution 1 PBS X, ajouter 3 mL de 0,25 % trypsine-EDTA et laissez reposer pendant 2-3 min à 37 ° C.
      2. Mécaniquement agiter la fiole, étancher la réaction avec 3 mL M199 médias avec sérum de veau fœtal 20 %, 1 % la pénicilline-streptomycine et supplément de croissance de 1 % et recueillir dans un 15 mL conique.
      3. Rincer avec 4 mL de M199 multimédia complet et recueillir dans le même conique. Faire tourner les cellules à 475 x g pendant 6 min.
    6. Tandis que les cellules se tournent vers le bas, ajouter une petite goutte de milieu complet 199 dans chaque puits en une nouvelle plaque 6 puits. Placer un nouvel isolateur de silicone dans le puits avec la chute des médias au centre de la silicone.
    7. À l’aide de pinces à épiler, mettez soigneusement l’isolateur de silicone supportant le gel PEG avec cellules A549 sur l’isolateur dans la nouvelle plaque 6 puits.
    8. Resuspendre HUVECs à une concentration de 6 x 105 cellules/mL et ajouter la suspension cellulaire au centre de la goutte de gel flipped sage, essayant de maintenir un ménisque sur le gel dans la zone a poinçonné dehors de la membrane de silicone. Permettre aux cellules d’adhérer pendant 2 h.
    9. Après 2 h, doucement ajouter 2 mL de M199 médias complète dans chaque puits.

    7. immunofluorescence

    1. Retirez délicatement médias de gels avec une pipette manuelle et ajouter environ 500 µL de paraformaldéhyde à 4 % (PFA) au centre du gel où les cellules sont ensemencées. Laisser reposer 30 min à température ambiante.
      ATTENTION : PFA est un produit chimique toxique ; Portez une protection et d’assurer la gestion s’effectue dans une armoire de sécurité biologique.
    2. Retirez la PFA soigneusement et ajouter environ 500 µL de 2 % de BSA dans du PBS à chaque gel. Laisser reposer 1 h à température ambiante.
    3. Retirez soigneusement les BSA. Préparer des anticorps primaires à une dilution de 1/100 à 2 % de BSA dans du PBS et ajouter 500 µL à chaque gel. Laisser reposer 1 h à température ambiante. Rincer doucement avec 500 µL de PBS 1 x.
      1. Répétez le même processus avec l’anticorps secondaires. Utilisez la suite anticorps : 1) anti-humain CD144 (VE-cadhérine) clone 16 b 1 ; 2) anti-humain CD324 (E-cadhérine) clone 6714 ; 3) anti-humain CD31 clone (PECAM-1) C-20 ; 4) anti-A549 ; 5) anti-souris FITC ; 6) anti-chèvre Alexa Fluor 647. Pour visualiser l’actine F, ajouter 500 µL de phalloïdine (10 µg/mL dans du PBS) pendant 20 min.
    4. Délicatement enlever les anticorps secondaires ou la phalloïdine et ajouter 500 µL de DAPI (0,1 µg/mL) pendant 20 min. Retirez soigneusement la solution DAPI et doucement ajouter 1,5 mL de PBS 1 x dans chaque puits pour que les gels sont en suspension.
      1. À l’aide de pincettes et silicone isolateurs, transférer un gel dans une lame de verre. Procéder ainsi pour chaque gel immédiatement avant l’imagerie et remplacer les gels en solution de PBS après l’imagerie.
      2. Vous pouvez également monter gels à l’aide d’un support de montage DAPI. Scellez bien les échantillons avec vernis à ongles, acquérir des images en 2 jours pour empêcher le séchage et la fissuration du gel. Référer au tableau 1 pour le dépannage.

    Résultats

    PEG-RGD hydrogels ont été formés en intercalant la solution de polymère entre deux couches d’oxyde de zinc sacrificiel et création de modèles de pore avec des aiguilles de l’oxyde de zinc. Oxyde de zinc sacrificiel composants ont ensuite été déposées par l’acide chlorhydrique, générant ultraminces PEG hydrogels avec pores continues (Figure 1). La morphologie des aiguilles de l’oxyde de zinc a été confirmée par microscopie électronique ...

    Discussion

    Le protocole détaillé ici nous a permis de créer un hydrogel PEG accordable pour servir un échafaudage biomimétique BM. Plus précisément, de différents poids moléculaires de PEG, stratégies de peptide de conjugaison et oxyde de zinc structures microcristallines ou concentrations, le module d’élasticité, propriétés biochimiques et une structure poreuse des hydrogels peuvent être modifiés, respectivement. L’échafaudage de PEG ultramince dispose d’une plus grande densité de pores et un plus petit dia...

    Déclarations de divulgation

    Les auteurs n’ont rien à divulguer.

    Remerciements

    Les auteurs aimeraient remercier Prof. Paul Van Tassel et Prof. Chinedum Osuji pour leurs conversations réfléchies et l’expertise de la science des matériaux. Ce travail a été financé par le Dubinsky nouvelle Initiative Award et les instituts nationaux de santé NIBIB BRPR01 EB16629-01 a 1.

    matériels

    NameCompanyCatalog NumberComments
    1M Hydrogel Chloride (HCl)EMDHX0603-75 2.5LSterile. Use in fume hood with eye protection and gloves.
    1X PBSGibco14040-133 500 mLNone
    Zinc Nitrate Hexahydrate (Zn(NO3)2•6H2O)Sigma-Aldrich228737-500gUse with eye protection and gloves.
    Sodium Hydroxide (NaOH)Macron Chemicals278408-500gUse with eye protection and gloves.
    Zinc Acetate Dihydrate ((CH3O2)2Zn2+•2H2O)Fisher ScientificAC45180010 1 kgUse with eye protection and gloves.
    Methanol (CH3OH)J.T. Baker9070-05 4LUse in fume hood with eye protection and gloves.
    VWR Life Science Seradigm Premium Grade FBSVWR97068-085Sterile filter. 5 mL FBS in 45 mL PBS
    Mineral oilCVS PLD-B280BNone
    Round bottom flaskChemGlassN/A
    ThermometerN/A
    Stir barN/A
    Plain precleaned microscope slides 3"x1"x1" mm thickThermo Scientific420-004TSpray with ethanol and let dry prior to use.
    Glass pasteur pipetsN/A
    1 mL rubber bulbsN/A
    Plastic 100 mm petri dishesN/A
    Sterile forcepsN/A
    Silicone isolators0.8 mm thick
    Polydimethylsiloxane (PDMS) punchesN/A
    Glass bottlesN/A
    6 well platesCellstar657 160N/A
    Filter PaperWhatman8519N/A
    Stirrer-hot plateVWR Dya-Dual12620-970Use with eye protection and gloves.
    2,2-Dimethoxy-2-phenylacetophenone (C6H5COC(OCH3)2C6H5Sigma-Aldrich24650-42-8Use with eye protection and gloves.
    1-Vinyl-2-pyrrolidone (C6H9NO)AldrichUse with eye protection and gloves.
    Polyethylene Glycol 10,000 (H(OCH2CH2)10,000OH)Fluka81280-1kgUse with eye protection and gloves.
    RGDSLife Tein180190Use with eye protection and gloves.
    Blak-Ray long wave UV lampUVPModel B 100APN/A
    Eppendorf tubesUSA Scientific1615-5500N/A

    Références

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    Réimpressions et Autorisations

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