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Resumo

Modelos de cultura BICAMADA atuais não permitem para estudos funcionais em vitro que imitam o microambiente que na vivo . Usando o glicol de polietileno e um método de modelagem de óxido de zinco, este protocolo descreve o desenvolvimento de uma membrana basal de biomimetic ultrafinos com rigidez sintonizável, porosidade e composição bioquímica que imita pròxima na vivo matrizes extracelulares.

Resumo

A membrana basal é um componente crítico do bilayers celulares que pode variar em porosidade, composição, arquitetura e rigidez. Estudos in vitro de epitélio endotelial-bilayers têm tradicionalmente invocado suporte permeável modelos que permitem a cultura da bicamada, mas suporta permeável é limitadas em sua capacidade de replicar a diversidade das membranas de porão humanas. Em contraste, modelos de hidrogel que requerem síntese química são altamente sintonizáveis e permitam modificações de rigidez do material e a composição bioquímica através de incorporação de péptidos biomimetic ou proteínas. No entanto, modelos de hidrogel tradicional são limitados na funcionalidade, porque lhes falta poros para contatos de celular e funcional em vitro estudos de migração. Além disso, devido a espessura de hidrogel tradicional, incorporação de poros que se estendem por toda espessura do hidrogel tem sido um desafio. No presente estudo, nós usamos hidrogel de poly-(ethylene-glycol) (PEG) e um método de modelagem de romance de óxido de zinco para abordar as deficiências anteriores de hidrogel biomimético. Como resultado, nós apresentamos um hidrogel ultrafino, membrana basal-like que permite a cultura de bilayers celulares confluentes em um andaime personalizável com arquiteturas de poro variável, propriedades mecânicas e composição bioquímica.

Introdução

Matrizes extracelulares (ECM) compõem os andaimes de proteína que suportam ligação de célula e servem como barreiras entre tipos de células distintas e são uma componente essencial do complexos tecidos e órgãos. Em contraste com o tecido conjuntivo intersticial, a membrana basal (BM) é um tipo especializado de ECM que age como uma barreira para dividir compartimentos de tecido de um outro. BMs são aproximadamente 100 µm de espessura e, portanto, permitam a comunicação direta e indireta entre as células em ambos os lados. Dois exemplos comuns de BMs são vasculares BMs, encontradas na parede microvascular entre pericitos e células endoteliais e BMs das vias aéreas que são encontradas entre as células endoteliais e epiteliais. BMs servem um papel importante na regulação da função celular, tais como polaridade celular e migração, na saúde e na doença. 1 a composição, rigidez, arquitetura e porosidade da BMs varia entre os sistemas do órgão para facilitar as funções fisiológicas distintas. Por exemplo, BM poros são essenciais para manter a comunicação célula-célula, difusão da molécula solúvel e para a migração de células do sistema imunológico durante inflamação ou bactérias durante a infecção. Nas vias aéreas, poros abrangem a totalidade da espessura da BM, com diâmetros variando de 0,75 a 3,86 µm.2

A natureza fina da BM assegura que apesar de tipos de células são fisicamente separados um do outro, comunicação intercelular via parácrina e contato-mediada por sinalização é preservada. Assim, para estudar doenças humanas in vitro, os pesquisadores têm contado com inserções de suporte poroso permeável para bilayers celular de cultura. 3 esses modelos têm sido fundamentais para a compreensão da comunicação celular que desempenha um papel na saúde e na doença. 3 , 4 , 5 , 6 , 7 suporte permeável inserções satisfazem os requisitos básicos para a compreensão de como sinalização celular regula processos fisiológicos, tais como o recrutamento de leucócitos e infiltração bacteriana; no entanto, as inserções têm limitações significativas e não conseguem imitar um apoio humano de BM. permeável inserções faltam pré-definido mecânico e bioquímico, e a estrutura porosa simplista não imitam a estrutura fibrosa que cria os poros irregulares típico da BMs. Portanto, há uma necessidade crescente de sistemas ajustáveis que pode recriar as BM as propriedades nativas que influenciam os processos celulares.

Baseado em polímero substratos são candidatos ideais para o desenvolvimento de biomimetic BMs para estudar bilayers celulares em um contexto que imita mais de perto o ambiente na vivo . 8 , 9 , 10 , 11 , 12 polímeros são mecanicamente ajustáveis e podem ser quimicamente modificados para incorporar fragmentos de peptídeo biomimético. 11 , 12 , 13 o bioinert polímero polietileno glicol (PEG) pode ser usado para construir biomimetic BMs e recente trabalho detalhou a síntese de géis de arginina-glicina-aspartato (RGD) PEG mecanicamente ajustáveis com redes porosas que suportam o crescimento celular e quimiotaxia de células inflamatórias. 14 embora publicado baseado em PEG substratos forneceu um modelo mais realista de um humano ECM que suporta permeável, muitos desses modelos são extremamente grossos, com uma profundidade de aproximadamente 775 µm que limita a capacidade de criar culturas BICAMADA com celular contatos. 14

Aqui, apresentamos um protocolo para a criação de um mímico BM baseado em polímero PEG que supera muitas das limitações das atuais tecnologias de cultura celular BICAMADA. Nós desenvolvemos um método de modelagem que incorpora o polímero durante a síntese e reticulação, que é posteriormente e seletivamente removida do óxido de zinco, um material amplamente usado para o fabrico de produção microcristalina, o polímero de massa resultante. Este processo gera uma aleatória rede porosa, imitando a rede de poros interconectados e tortuoso da BMs humanas. Além disso, a porosidade pode ser alterada, alterando o tamanho e a forma dos microcristais de óxido de zinco através de modificação da estequiometria da reação durante a produção de agulha. A técnica desenvolvida aqui cria um hidrogel ultrafino que imita a espessura do BM. humano por último, a mecânica, a porosidade e a composição bioquímica dessas construções BM-como facilmente pode ser alterada para gerar um microambiente que é mais semelhante ao que vimos na vivo.

Protocolo

Leia Material segurança folha de dados (MSDS) de todos os materiais anteriores usar e usar as precauções de segurança em todos os tempos.

1. síntese de agulhas de óxido de zinco

  1. Preparar 250 mL de um 0,04 M Zn (NO3)2* solução de 6 H2O, adicionando 2,9749 g de nitrato de zinco para 250 mL de água.
  2. Prepare 150 mL de 1 M de NaOH adicionando 6 g de NaOH para 150 mL de água.
  3. Configurar um banho de óleo mineral em um prato quente com agitador e mergulhe num balão de fundo redondo de 500 mL do banho de óleo à temperatura ambiente.
  4. Adicionar 250 mL de Zn (NO3)2* 6 H2O no balão e começar a agitar a reação.
  5. Adicione 150 mL de solução de NaOH (um precipitado branco irá formar brevemente e depois desaparecem como as duas soluções continuam a misturar). Agitar durante 2 h a descoberto.
  6. Aquecer o balão até 55-60 ° C e continue mexendo por 24 h.
  7. Desligue o fogo e deixar a solução arrefecer à temperatura ambiente, agitando.
  8. Filtrar a solução em um funil de Büchner com um tamanho de poro de 11 µm e deixar para secar durante a noite, descoberto. Quando o papel de filtro não está mais molhado da solução derramada e formou-se um pó branco sobre os orifícios do funil, as partículas são totalmente secas.
  9. Recolher as agulhas de ZnO e prepare-se para microscopia eletrônica (SEM) para confirmar a morfologia de agulha. Brevemente, fita de carbono para um esboço de pino de montar e usar uma espátula de metal para manchar as agulhas de ZnO para a fita de carbono. Salpicar o casaco com irídio de 8 mm, com uma densidade de 22,4 g/cm3 e adquirir imagens em 10 kV.

2. adição de camada de zinco Sacrificial em corrediças do microscópio para HCl induzidas pelo lançamento do PEG

  1. Prepare a solução de acetato de zinco, dissolvendo 1,756 g de acetato de zinco em 200 mL de metanol.
  2. Limpar 3 "x 1" corrediças do microscópio simples com 70% de etanol e uma limpeza descartável. Deixe secar por 10 min.
  3. Coloque um copo de 150 mm placa de Petri em uma chapa quente e pré-aqueça a 150-160 ° C.
  4. Usando uma pipeta de vidro com um bulbo de pipeta, mantenha as lâminas de vidro com uma pinça e casaco slides aplicando-se 5 gotas de acetato de zinco, formando uma camada fina, dispersada no slide. Deixe a solução em excesso gotejar volta em solução-mãe.
  5. Coloque o slide na prato de Petri (150-160 ° C) pré-aquecido com a zinco acetato revestido virados para cima. Deixe a placa por 15 min.
  6. Retirar a lâmina com uma pinça e deixe-a esfriar a temperatura ambiente. O slide irá aparecer para ser revestido com listras brancas.
  7. Retire qualquer excesso zinco que é remanescente nos slides usando uma limpeza descartável para remover manchas brancas proeminentes. A superfície deve ser uniforme.
  8. Expor os slides preparados para UV luz em uma capa de biossegurança para pelo menos 1 h garantir a esterilidade.
    Atenção: A luz UV é prejudicial aos olhos e expostos a pele. Evite exposição direta à pele ou olhos e desligue a alimentação eléctrica quando não estiver usando.

3. preparação de isoladores de Silicone

  1. Folha de silicone corte em quadrados a menos de 1 "x 1" (isoladores devem ser capazes de caber em um prato bem-6).
  2. Fazem furos de 8 a 12 mm no centro dos quadrados com um soco de biópsia.
  3. Isoladores de silicone autoclave por 20 min a 121,0 ° C e 1,12 kg/cm.

4. preparação da solução-PEG PEG-Gel de síntese

Nota: Functionalization e polimerização do PEG foi extensivamente explorada e detalhado anteriormente pelo nosso laboratório e outros. 8 , 10 , 11 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17

  1. Combinar o peptide adesivo RGD celular com acryloyl-PEG-NHS em 50mm de bicarbonato de sódio (pH 8,5) em uma proporção molar de 1:1 para habilitar functionalization de terminal amina do peptide com a fracção de acrilato, uma reação bioquímica que tenha sido previamente caracterizada para rendimento superior a 85% de eficiência. 17
  2. Prepare o foto-iniciador misturando 2,2-dimetoxi-2-phenylacetophenone com 1-vinil-2-pirrolidona na concentração de 300 mg/mL.
  3. Em separar os tubos de 1,5 mL, pesar o seguinte: 20 mg de agulhas de ZnO, 12,5 mg de PEG-DA e 2,5 mg de PEG-RGD.
  4. Suspender a 20 mg de ZnO agulhas em 270 µ l de solução FBS/PBS 10%; vórtice para misturar (aproximadamente 15 s).
  5. Brevemente (< 1 s) girar a solução em uma centrífuga de bancada mini para trazer qualquer ZnO agregados à base do tubo.
  6. Recolha 250 µ l da parte superior da solução de ZnO, para garantir que os agregados permaneçam no fundo do tubo. Combine com PEG-DA e PEG-RGD para criar uma solução de PEG, com aproximadamente 2,5 mM RGD. Vórtice para misturar (aproximadamente 15 s).
  7. Adicionar 2 µ l de acetofenona/n-vinil pirrolidona foto-iniciador e vórtice brevemente para misturar (aproximadamente 5 s).
  8. Adicione 20 µ l da solução de polímero ao longo do centro dos slides ZnO revestido.
  9. Abaixe-se lentamente um segundo slide no topo, com o rosto de revestimento de ZnO para baixo (a solução de PEG deve estar entre duas camadas de ZnO revestido). Tente evitar a formação de quaisquer bolhas de ar. Mova os slides lateralmente ao longo do eixo maior para permitir que quaisquer bolhas para escapar e espalhar a solução para uma camada fina. Cobrir a maioria do slide com a solução de polímero. Crie uma ligeira saliência com a corrediça superior para garantir que os slides podem ser separados em etapas posteriores.
  10. Crosslink os slides sob uma lâmpada de nanômetro UV 365 (aproximadamente 10 mW/cm2) por 15 min.

5. lançamento do PEG geles de lâminas de vidro

  1. Aplique pressão para o slide pendendo sobre e puxe que os dois slides separados em um ritmo lento, a fim evitar rachar os slides manualmente. Permitir que os geles secar durante pelo menos 5 min, ou durante a noite.
  2. Coloque o slide em um vidro estéril 25 mm placa de Petri e delicadamente despeje a solução de HCl 1 M para o slide, usando apenas o suficiente para cobrir o slide (aproximadamente 10-20 mL). Agitar suavemente a placa de Petri; o gel deve começar a levantar-se fora do slide como o HCl dissolve o revestimento de zinco sacrificial e agulhas. Uma vez que o gel é livre do slide, despeje o HCl volta a solução-mãe.
  3. Lave o gel derramando suavemente cerca de 25 mL de 1X PBS na prato de Petri até o slide e o gel são submergidas.
Com cuidado, despeje fora PBS em um recipiente de resíduos.
  • Delicadamente despeje aproximadamente 25 mL de 1X PBS a prato de Petri até que o gel está flutuando na solução.
  • Usando uma pinça, cuidadosamente deslize do isolador de silicone em gel e erga-gel para isso.
  • Transferi o isolador e o gel num prato cheio de PBS estéril 1 x 6-poços.
  • Repita este processo até que todos os géis foram retirados os slides e estão todos em PBS. Expor os géis preparados à luz UV em uma capa de biossegurança para pelo menos 1 h garantir a esterilidade.

    • 6. semeadura Bilayers celular

    1. Prepare A549 células para semeadura. Brevemente, lavar um balão de2 75cm com 5 mL de 1X PBS, adicionar 3 mL de 0,25% Trypsin-EDTA e deixe descansar por 2-3 min a 37 ° C.
      1. Agitar o frasco mecanicamente, saciar a reação com meio de 3ml Dulbecco Eagle modificado com 10% fetal bovino soro e 1% penicilina-estreptomicina e recolher num erlenmeyer de 15 mL. Enxágue com um adicional 4 mL de modificado águia mídia de Dulbecco completa e coletar na mesma cónica. Gire as células a 475 x g, durante 6 min.
    2. Enquanto as células estão girando para baixo, adicione uma pequena gota de meio de Eagle modificado de Dulbecco completa a cada poço de uma placa de 6. Use uma pinça para transferir os isoladores de silicone com os geles para a nova placa 6, tal que o gel está descansando sobre a entrega de mídia. Agora que os geles são espalhados em uma camada fina, verificar para garantir que não existem sem grandes buracos visíveis a olho. Isso deve ser feito imediatamente antes da célula semeadura para evitar a secagem e rachando os géis.
    3. Ressuspender as células em meio Eagle modificado de Dulbecco com 10% fetal bovino soro e 1% penicilina-estreptomicina na concentração de 6 x 105 células/mL. Adicione a gota de suspensão de célula sábio ao centro do gel, tentando manter um menisco na área perfurada para fora da membrana do silicone. Permitem que as células aderir por 4h.
    4. Após 4 h, adicionar 0,5 mL de meio completo do águia de Dulbecco modificado para o bem e incubar durante uma noite a 37 ° C, para permitir uma aderência completa.
    5. No dia seguinte, prepare HX para semeadura de célula.
      1. Lavar um balão de2 75cm com 5 mL de 1X PBS, adicionar 3 mL de 0,25% Trypsin-EDTA e deixe descansar por 2-3 min a 37 ° C.
      2. Agitar o frasco mecanicamente, saciar a reação com 3 mL M199 mídia com suplemento de crescimento de 1%, 1% penicilina-estreptomicina e 20% de soro fetal bovino e coletar em um cônico de 15 mL.
      3. Lavar com 4 mL de mídia completa M199 e coletar na mesma cónica. Gire as células a 475 x g, durante 6 min.
    6. Enquanto as células estão girando para baixo, adicione uma pequena gota de meio completo 199 a cada poço em uma nova placa de 6. Coloque um novo isolador de silicone no poço com a queda de mídia no centro do silicone.
    7. Usando uma pinça, cuidadosamente vire o isolador de silicone gel PEG com A549 células para o isolador de apoio na nova placa de 6.
    8. Resuspenda HX numa concentração de 6 x 105 células/mL e adicionar a suspensão de células para o centro da gota sábio, tentando manter um menisco no gel dentro da área perfurada para fora da membrana do silicone gel capotou. Permitem que as células aderir por 2 h.
    9. Após 2 h, delicadamente adicione 2 mL de mídia completa M199 a cada poço.

    7. imunofluorescência

    1. Cuidadosamente, remova a mídia de géis com uma pipeta manual e adicionar aproximadamente 500 µ l de paraformaldeído 4% (PFA) para o centro do gel, onde as células são semeadas. Deixe descansar por 30 min à temperatura ambiente.
      Cuidado: PFA é um produto químico tóxico; usar proteção e certifique-se de manipulação é feita em uma câmara de segurança biológica.
    2. Cuidadosamente remova o PFA e adicionar cerca de 500 µ l de 2% BSA em PBS a cada gel. Deixe descansar por 1h à temperatura ambiente.
    3. Remova cuidadosamente a BSA. Preparar os anticorpos primários numa diluição de 1: 100 em 2% BSA em PBS e adicione 500 µ l de cada gel. Deixe descansar por 1h à temperatura ambiente. Lave suavemente com 500 µ l de PBS 1x.
      1. Repita o mesmo processo com os anticorpos secundários. Utilizar os seguintes anticorpos: 1) anti-humano CD144 (VE-caderina) clone 16B1; 2) anti-humanos CD324 (E-caderina) clone 6714; 3) anti-humano CD31 clone (PECAM-1) C-20; 4) anti-A549; 5) anti-rato FITC; 6) anticabra Alexa Fluor 647. Para visualizar a F-Actina, adicionar 500 µ l de faloidina (10 µ g/mL de PBS) por 20 min.
    4. Cuidadosamente remover anticorpos secundários ou faloidina e adicione 500 µ l de DAPI (0,1 µ g/mL) por 20 min. Retire cuidadosamente a solução DAPI e delicadamente, adicione 1,5 mL de 1X PBS a cada poço, para que os geles são em suspensão.
      1. Usando pinças e silicone isoladores, transferi um gel para uma lâmina de vidro. Fazer isso para cada gel imediatamente antes da imagem latente e substituir géis em solução de PBS depois da imagem latente.
      2. Alternativamente, monte o gel usando um meio de montagem de DAPI. Selar bem as amostras com os esmaltes, adquirir imagens dentro de 2 dias para impedir a secagem e rachaduras do gel. Consulte a tabela 1 para solução de problemas.

    Resultados

    PEG-RGD hidrogel formaram-se pela imprensa a solução de polímero entre duas camadas de óxido de zinco sacrificial e criação de modelos de poros com agulhas de óxido de zinco. Óxido de zinco sacrificial componentes foram removidos então com ácido clorídrico, gerando ultrafinos PEG hidrogel com poros contínuos (Figura 1). A morfologia das agulhas de óxido de zinco foi confirmada pela microscopia eletrônica (SEM), e o comprimento médio e largura e...

    Discussão

    O protocolo detalhado aqui nos permitiu criar um hidrogel PEG ajustável para servir como um andaime biomimetic BM. Especificamente, por diferentes pesos moleculares de PEG, estratégias de conjugação de peptídeo e estruturas microcristalina de óxido de zinco ou concentrações, o módulo de elasticidade, propriedades bioquímicas e estrutura porosa do hidrogel podem ser modificado, respectivamente. O andaime PEG ultrafino apresenta uma maior densidade de poros e menor diâmetro dos poros seja mais mimético das cara...

    Divulgações

    Os autores não têm nada para divulgar.

    Agradecimentos

    Os autores gostaria de agradecer a Prof Paul Van Tassel e Prof Chinedum Osuji conversas pensativas e expertise de ciência dos materiais. Financiamento para este trabalho foi fornecido pelo novo prêmio de iniciativa Dubinsky e institutos nacionais de saúde NIBIB BRPR01 EB16629-01A1.

    Materiais

    NameCompanyCatalog NumberComments
    1M Hydrogel Chloride (HCl)EMDHX0603-75 2.5LSterile. Use in fume hood with eye protection and gloves.
    1X PBSGibco14040-133 500 mLNone
    Zinc Nitrate Hexahydrate (Zn(NO3)2•6H2O)Sigma-Aldrich228737-500gUse with eye protection and gloves.
    Sodium Hydroxide (NaOH)Macron Chemicals278408-500gUse with eye protection and gloves.
    Zinc Acetate Dihydrate ((CH3O2)2Zn2+•2H2O)Fisher ScientificAC45180010 1 kgUse with eye protection and gloves.
    Methanol (CH3OH)J.T. Baker9070-05 4LUse in fume hood with eye protection and gloves.
    VWR Life Science Seradigm Premium Grade FBSVWR97068-085Sterile filter. 5 mL FBS in 45 mL PBS
    Mineral oilCVS PLD-B280BNone
    Round bottom flaskChemGlassN/A
    ThermometerN/A
    Stir barN/A
    Plain precleaned microscope slides 3"x1"x1" mm thickThermo Scientific420-004TSpray with ethanol and let dry prior to use.
    Glass pasteur pipetsN/A
    1 mL rubber bulbsN/A
    Plastic 100 mm petri dishesN/A
    Sterile forcepsN/A
    Silicone isolators0.8 mm thick
    Polydimethylsiloxane (PDMS) punchesN/A
    Glass bottlesN/A
    6 well platesCellstar657 160N/A
    Filter PaperWhatman8519N/A
    Stirrer-hot plateVWR Dya-Dual12620-970Use with eye protection and gloves.
    2,2-Dimethoxy-2-phenylacetophenone (C6H5COC(OCH3)2C6H5Sigma-Aldrich24650-42-8Use with eye protection and gloves.
    1-Vinyl-2-pyrrolidone (C6H9NO)AldrichUse with eye protection and gloves.
    Polyethylene Glycol 10,000 (H(OCH2CH2)10,000OH)Fluka81280-1kgUse with eye protection and gloves.
    RGDSLife Tein180190Use with eye protection and gloves.
    Blak-Ray long wave UV lampUVPModel B 100APN/A
    Eppendorf tubesUSA Scientific1615-5500N/A

    Referências

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