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要約

このプロトコル [18F]-2-fluoro-2-deoxy-D-glucose 陽電子放射断層撮影法とコンピューター断層撮影 (18F-FDG PET/CT)、で標的治療 MLN0128 に腫瘍代謝反応を計測するイメージングを活用する方法を解説します。Kra/Lkb1突然変異体マウス肺癌モデルと結合高解像度ex vivoオートラジオグラフィーと定量的組織イメージングします。

要約

高度な腫瘍の最大の特徴は [18F]-2-fluoro-2-deoxy-D-glucose 陽電子放出断層レントゲン写真撮影 (18F-FDG) イメージング容易に測定される好気性解糖系への切り替え。共同KRAS癌遺伝子LKB1腫瘍抑制遺伝子変異は、今回、解糖系の腫瘍の成長をドライブする肺癌で頻繁にイベントです。成長とこれらの腫瘍の代謝を調節する重要な経路選択的触媒 mTOR キナーゼ阻害剤を使用して効果的に対象とすることができますラパマイシン標的 (mTOR) パスウェイの機械論的対象であります。MTOR 阻害剤 MLN0128 は、Kras、Lkb1 共同の突然変異で、KL マウスと呼ばれる腫瘍を有するマウスにおける解糖を抑制します。KL マウスの治療応答18F FDG PET による測定は最初、コンピューター断層撮影 (CT) 画像 MLN0128 の分娩前後。18F-FDG PET/CT を活用し、研究者は目標とされた療法と治療的介入を伴う肺癌の遺伝子組み換えマウス ・ モデル (GEMMs) における糖代謝の動的変化を測定することができます。これは前のヴィヴォオートラジオグラフィーと形態のソフトウェアを使用して定量的免疫組織化学 (qIHC) 分析が続きます。QIHC を使用することで、検出と次治療として明確な腫瘍病態の評価バイオ マーカー プロファイルの異なる変化の定量化。定量的組織に pet のカップリングは、代謝と治療反応生体内で病気のマウスモデルで識別する効果的な戦略です。

概要

私たちの研究は調査と癌肝キナーゼ B1 の突然変異 (LKB1、別名 STK11) をターゲットに焦点を当てて突然変異癌1。LKB1 は成長と代謝の調節につながる AMP キナーゼ (AMPK) の活性化を介して mTOR 複雑な 1 (mTORC1) を抑圧するマスターの腫瘍のサプレッサーです。したがって、LKB1 の喪失は、気ままな mTORC1 活性化、通称 Warburg 効果2,3,4解糖系代謝表現型 HIF1 α 結果の活性化に します。LKB1 不活化突然変異は、事前に処分のまれな家族性癌症候群ポイツ-ジェガーズ症候群 (PJS として) 過誤5として知られている消化管の良性のポリープの開発によって特徴付けられることが知られているの開発に直接つながる,6,7します。 さらに、LKB1 頻繁共同変異発癌 KRAS 今回と積極的なひと肺腫瘍8,9の結果と。

Lkb1 関連疾患は容易にマウスでモデル化されます。マウスにおける Lkb1 のヘテロ接合体の不活化は、過誤 PJS10、11,12,13を正確にモデリングの開発に します。また、正確にマウスでモデル化されて容易に Lkb1 遺伝子変異は、肺、皮膚、膵臓、乳房14のがん表現型を要約します。Lkb1 の発癌 KrasG12D対立遺伝子およびシュミレーション削除の Cre リコンビナーゼを介する活性化を用いた遺伝子改変マウスの肺組織の Kra/Lkb1 の共同の突然変異の結果積極的なおよび転移性肺腫瘍15 の形成 ,16。KraG12D; のキャラクタリゼーションLkb1-/-マウスから分離した (KL) 肺腫瘍を示していますこれらの腫瘍は高 mTORC1 活性化がある、高い解糖系、糖および乳酸塩の両方の直接代謝物の測定を使用してまたは、[18F] の消費を測定-2-フッ素-2-デオキシ-D-グルコース (18F-FDG) コンピューター断層撮影 (CT) 17陽電子放射断層撮影 (PET) による。LKB1 変異型腫瘍の活性化 mTORC1 ハイパー-は、これらの癌を治療する mTOR の両方のアロステリックと触媒キナーゼ阻害剤のテストの明確な根拠を提供します。

以前の研究ではアロステリック mTORC1 阻害剤ラパマイシン (ラパ) が正常に3PJS のトランスジェニック マウス モデル+/- Lkb1を使用して胃腸の (GI) 腫瘍の糖代謝変化と成長を抑制を示した。ラパ現在腎細胞癌の治療に単剤療法として承認されたが、非小細胞肺癌の18,,1920に限られた有効性を示した。ラパ アロステリック mTORC1 阻害剤は、mTOR の複合体 1 と 2 のより多くがほぼ完全に抑制を提供する次世代 mTOR 触媒キナーゼ阻害剤の開発によって改善されることがあります (mTORC1 と mTORC2、それぞれ)21。MLN0128 などの薬は、前臨床試験で早期臨床試験22,23今されて評価されます。当研究室の最近の研究は、MLN0128、ひと肺腫瘍細胞株における強力な mTOR 阻害剤と体内の肺がん15,16KL GEMMs で実証。MLN0128 は、これらのマウスの24の肺腫瘍成長とグルコース代謝を抑制しました。

本研究で我々 は条件付きでアクティブ化された Lox 停止-Lox 遺伝子G12D遺伝子15,25による肺癌のよ特徴付けられたアデノ ウイルス Cre 誘発マウス モデルの活用します。これらの KrasG12Dマウスはマウス floxed 遺伝子 Lkb1 と交差した KrasG12D; を生成する (Lkb1L/L)Lkb1L/L (KL) マウス16。アデノや Cre リコンビナーゼを発現レンチ ウイルスの鼻腔内配送、次 KL マウスは 4 週間後の腫瘍誘導早期病変を開発します。6 週間、腫瘍より悪性、積極的な腫瘍の表現型肺癌例の典型的な腺腫様腫瘍から KL マウス変更され、8-10 週によって、マウスは 100% 浸透度16,26フランク癌を開発します。

両方の PET/CT イメージングおよび定量的免疫組織化学を活用すると、以下の配信の腫瘍で治療の応答と同様、分子および代謝応答を決定する標的療法 MLN012817,など26,27。ここで説明した18F-FDG を活用した実験的プロトコルは MLN0128 ターゲット療法に対する代謝反応を計測するイメージングします。MTOR 阻害する分子応答の測定だけでなく、腫瘍の負担と腫瘍組織の定量化により pet 定量組織学とを結合できます。

プロトコル

プロトコルで説明したすべての手順は、動物介護施設によって承認されているし、使用委員会 (IACUC) カリフォルニア大学ロサンゼルス校。

1 18F PET と CT の撮像。

注意: は、放射能を取り扱う際に保護具を使用します。放射能を処理するときすべての該当する規制手順に従います。

  1. 37 ° C 1 時間18F-FDG 注射18F-FDG の褐色脂肪の消費を削減する前に暖かいベッドのイメージを作成するマウスとケージを配置します。
    注: は、 18F-FDG の心筋の消費を減らすことができます 4 16 h のためマウスを絶食します。
  2. マウスの重量を量る、重量を記録します。
  3. 0.5 - 37 ° C で維持麻酔チャンバーを用いた 2-3 分 2l/分で酸素の 2-3% イソフルランを使用してマウスを麻酔します。そのマウスはつま先; をつまんで麻酔されていることを確認します。反応ができなくなります、マウスが麻酔されているかどうかを観察。麻酔中は乾燥を防ぐために目に眼軟膏を適用します。
  4. 18F-FDG (109 分放射性半減期) を調整崩壊修正注入濃度 70-75 µCi/100 μ L の滅菌生理食塩水で希釈します。
    注: 最適なスキャナー用 PET 装置製造元の推奨18F 用量に従ってください。
  5. 28 G 針でインスリン注射器と 70-75 µCi を描き、線量校正器を用いた放射能線量を測定、測定と時刻を記録します。鉛シリンジ ホルダーに注射器を配置します。
    注: 各用量の18F-FDG 放射能の量、製造元のプロトコルによると、セシウム 137 などの標準物質に対して校正されている線量キャリブレータで測定します。読書の時間も減衰補正を決定するために記録されます。
  6. マウスの尾の先端を刺すし、glucometer してマウスの血糖値を測定します。
  7. 温かいガーゼで 1-2 分の尾は、暖かい水に浸して。注入直前に尾静脈を拡張する 70% イソプロパノールと尾を拭いてください。ボーラス注入を介して外側尾静脈し、注射の時間を記録の18F-FDG (注射器でボリューム全体) の 100 μ L を管理します。線量校正器を使用して注射器で残りの線量を測定し、測定と時刻を記録します。
    注記: 注射器に残っているプローブのいくつかの量があります。注射器注射が投与されている後注射器・針の中に閉じ込め線量の減少量のためルアー ロック経由で針に接続されている以上インスリン注射器の使用お勧めします。
  8. もとに麻酔室に注入されたマウスを置きマウスの全身循環ペット スキャンの前に 1 時間分散を経由するプローブを許可する 37 ° C で 1.5-2% イソフルラン。
    注: 無効にする簡単に18F-FDG 可視化マウスの下の斜面に移植腫瘍のためにスキャンする前に膀胱に有益な場合があります。
  9. 1 時間後鼻円錐形のイソフルラン麻酔下で、37 ° C でのイメージング室にマウスを置き、仰臥位で医療用テープと場所で四肢を固定します。
  10. ペット/ct の撮像室を配置します。
  11. PET/CT スキャナー マニュアル28に記載されているは、PET 像と CT スキャンを取得します。
    注: 600 のペット画像を取得光子減衰、検出器の正規化 (散乱線補正された放射性同位元素の崩壊に修正最尤推定期待値最大化を使用して再建された 650 150 keV のエネルギー ウィンドウ s適用されません)。CT 画像は、50 s 使用 50 kVp、200 μ A x 線源とフラット パネル検出器は, フェルドカンプ アルゴリズムを使用して再構築するための連続モードで取得されます。
  12. ペット/CT の完了後は、イメージングの商工会議所から、マウスを削除そのケージに回復するようにし、なさい。それは完全には意識を取り戻したが、胸骨の横臥を維持することができますまでは、マウスを監視します。
  13. アミド ソフトウェアにファイルし、開くをクリックして適切なファイルを選択する再生 PET/CT 画像をインポートします。
  14. また件名の入力することでペットのデータを任意の残留量の会計処理を注射器で去った後注入の時に投与量を入力してグラム (%ID/g) あたりの投与量の % 注入の単位または単位の標準摂取量 (SUV) を変換します。重量。これを行う、ペットのデータ セットを右クリックし、検索するには、%ID/g フィールド、[基本情報] タブには、以前に記録した %ID/g を入力します。
  15. 腫瘍と正常組織 (肝臓、筋肉、肺、心臓、脳と皮下脂肪) に関心の領域 (Roi) を描画します。これを行うには、編集をクリックして、追加投資収益率を選択およびROI の図形を選択、投資収益率に名前を付けます。腫瘍と組織・ ロワを描画し、全 3 軸の興味の組織をカバーするためその寸法を調整します。
    注: ペット プローブ体内の動物との間の違いを考慮して腫瘍 ROI 値ことができますさらに正規化する肝臓、 18F-FDG の循環を表す最小の解糖系アクティビティでよく灌流オルガンの ROI 値。同じマウスの腫瘍と正常組織の ROI 分析が実行されます。肺の腫瘍は、正常肺に18F-FDG 保存が比較的低いので一般的に18F-FDG によって識別されます。CT は、 18F-FDG、熱心な病変特に病変を識別するためにも使用されます。分離肺のex vivo解析は、腫瘍病変のローカライズにも役立ちます。

2. 18F-FDG オートラジオグラフィー

  1. 18F-FDG、今、希薄18F-FDG を除いて次の手順 1.1-1.12 調整崩壊修正注入濃度 1,000 µCi/200 μ L 滅菌生理食塩水でイメージングのためマウスを準備します。
    注: 18F-FDG の高用量が使用放射線写真法の追加サンプルの処理時間と最適な検出を考慮する蛍光体プレート。
  2. マウスを介してのイソフルランは 5% または CO2 (IACUC 承認プロシージャ) によって致命的な吸入安楽死させます。
    注: これは肺の組織を損傷することが、頚部転位は使用しないでください。
  3. 公開腹側表面でマウスをピン留めし、切開する前にその髪を畳に 70% エタノールをスプレーします。
  4. 正中切開を適用し横隔膜を離れて切断、胸部の壁を取り払い、胸腔内を開きます。慎重に唾液腺を除去することによって気管を公開します。できるだけ、顎に近いとして気管気管のタイトなフィットを確保するブルドッグ クランプを配置します。場所 23 G 針はブルドッグ クランプ下気管内 3 mL の注射器に接続されているし、OCT:PBS (1:1) (最適切削温度: リン酸緩衝生理食塩水) ソリューションの 〜 2 mL を注入します。
    注: 10 月、非常に粘性、肺の中に簡単に注射できるように PBS と混合されます。
  5. 気管から針を外し、OCT:PBS ソリューションの漏れを防ぐために注射部位にクランプする鉗子を使用します。
  6. 慎重に胸腔内から肺を削除、左葉を肺の残りの部分から分離します。場所ラベル付き cryomold で左葉を数滴 10 月でいっぱい。金型内肺葉, 肺区域を 10 月でトップに cryomold を入力します。
  7. 肺の右半分と同じ手順を繰り返します。
    注: 中心部に18F-FDG 信号が高いことが予想される場合、または肺腫瘍中心部の近くに位置している場合は、有益かもしれない任意のトレーサーの漏れを防ぐために中心部を削除します。また、単一の cryomold に肺全体を埋め込むことができます。OCT を使用するときに空気の泡を避けるために重要です。
  8. ドライアイスとイソペンタンの混合物を含むにクローズドセルの押し出し発泡ポリスチレン容器に準備 cryomold を入れる長い鉗子を使用して。
    注: この混合物約-70 ° C で凍結のために、cryomold を配置する前にする必要があります。焼き入れ後 10 月化合物は白になります。複数のサンプルを同時に処理する場合、10 月 cryomolds で凍結試料はドライアイスに一時的に格納できます。
  9. Cryomold から冷凍のブロックを外し、セクショニングのクリオスタットにマウントします。ミクロトームの刃 (34 °/80 mm、知名度の高い) を用いた 4 μ m 厚でブロックをセクションします。組織切片を室温で保存されているスライド ガラスに転送します。
  10. 蛍光イメージング プレート上に標本スライドを配置します。カセット プレートを置き、スライドがシフトすることを防ぐためにそれをそっと閉じます。一般的に一晩、カセットをプレートの露出のための-20 ° C のフリーザーに格納します。
    注: プレートとカセットは-20 ° C 使用する前に体が冷え切ってしまう前に必要があります。-80 ° C にサンプルを置くことも許容範囲です。
  11. 曝露後プレートからスライドを削除し、イメージ リーダーのプレートを読み取る。
  12. スライドをプラスチック製のラップでラップし、-80 ° C で保存することができます、または彼らはヘマトキシリン ・ エオシン染色や免疫組織化学を覚悟することができます。

3. 組織学のため肺組織を収穫

  1. 手順 2.2 2.4 以外は、OCT:PBS ソリューションを使用する代わりに、肺を修正する 10% 通常緩衝ホルマリンの 2-3 mL を注入します。
  2. 気管から針を外し、ホルマリンの漏れを防ぐために注射部位にクランプする鉗子を使用します。慎重に胸腔内から肺を削除し、完全な固定を確保するため 16 24 時間 10% 通常緩衝ホルマリンの ~ 20 mL を含む 50 mL の円錐管に配置します。
    注: 最適な解剖学的特徴の保存のため肺を固定可能します。
  3. 次の日は、70% エタノール、ホルマリン固定肺に転送し、組織カセットに配置する肺を準備します。
  4. 番号 1-5図 1Dに示すように、5 の葉間ブランチ ポイントでカットするはさみを使用して葉を慎重に解剖、組織学の肺を準備し、組織カセットに非重複の向きで配置します。向きをそのままに保つために肺組織に優しく泡パッドを配置します。
  5. パラフィン包埋まで 70% エタノールに切り裂かれた肺葉を格納します。
  6. カセットの組織をパラフィン埋め込むし、標準的な手順を使用して染色、4 μ m 厚いセクションをカットします。

4. 組織分割とソフトウェアを用いた定量化

  1. 画像ヘマトキシリンとエオシン (H & E) は、商業マルチ スペクトル イメージング システムを使用して、1.25 倍の倍率で肺セクションを染色しました。
  2. 画像をデジタル画像キューブに変換し、H & e. の (クリックファイル、し、スペクトル ライブラリのロードに) 既製スペクトル ライブラリをロード
    注: スペクトル ライブラリは、単独で汚れた肺セクション、1 つのセクションだけエオシンのステンド_グラスからスペクトル画像を取得することによって事前に開発されたオープン ソースのプロプライエタリなスペクトル ライブラリに保存されたをヘマトキシリンで他のだけ染色し、ファイル (.csl)。オペレーティング ソフトウェアが必要 (取得プロトコルによって定義された)、各波長でのイメージを取得するイメージング システムがあります。それらのイメージ (「イメージ キューブ」) は、オープン ソースの独自マルチ スペクトル ファイル形式 (.im3) に格納されます。スペクトル計測ソフトウェアを使用してイメージ キューブから抽出され別のスペクトル ライブラリ ファイルに格納されています。
  3. スペクトルUnmixボタンをクリックして擬似色 H & E 全体の肺の画像を unmix します。
    注: 分離 1 未満になります s。各組織の種類のピクセル数は、形態画像解析ソフトウェアを使用して定量化されました。
  4. 各画像の強度でたたみ込み, 目の波長依存の色応答の使用によるマルチ スペクトル データを同等の 3 色 (赤、緑、青) のイメージに変換することによってキューブごとにイメージを視覚化します。
    メモ: 結果の 3 つの画像は、標準の 24 ビット カラー イメージとして表示されます。
  5. 擬似カラーでユーザーが選択したイメージのスケーリングによって各混じり気のないイメージ (例えば、赤、緑、紫、等) の色し、1 つ標準的な 24 ビット カラー画像に他の疑似カラーの混じり気のない画像を一緒に追加。
  6. すべての解析の既定の設定を使用します。
    注: 一般に、セグメンテーションのこの種は、(すなわち、どれだけうまく訓練外画像のセグメンテーション設定作品の評価) 結果の視覚的評価に依存しているのでそれは正しくトレーニングに画像を分割することが重要テストと検証のセット。
  7. 2-3 画像のトレーニング セット (人間の生検試料の 10-15) として鉄道まで上を開始それら結果、よく見るし、別の 2-3 のイメージにそのアルゴリズムを適用します。そして、完全な検証セットに結果のアルゴリズムを適用します。
    注: ほとんどの場合、いくつかの訓練が必要でしょう。
  8. 各マウスの葉 1-5 赤の疑似カラー腫瘍の総ピクセル数を計算することによって全肺セクションで腫瘍領域を分析します。
    注: 正常な組織だったが、疑似カラー緑と血/血の船が疑似カラー ピンクの図 3に示すように。各治療群の平均腫瘍負担された治療群の各マウスの総ピクセル数を測定することによって計算されます。

結果

18F-FDG pet は KL マウスで実行され、これらのマウスで腫瘍が昇格した18F-FDG 消費量 (図 1A)、以前に発行された研究26、同意で示すように、解糖系高度実証 29。全体の肺の切除には、いくつかの腫瘍 (図 1B) の存在が明らかになった。マウス肺は、数字 1と1 Dで表される 5 別葉に分割できます。H & E またはブドウ糖の運送者 1 (Glut1) で染色した切片の肺にラベル付けされた葉 1-5 (図 1D)。Glut1 はグルコースと18F-FDG とその式の主な輸送、腫瘍細胞の細胞膜に局在18F-FDG SUV29直接関連付けます。(40 X) を染色 Glut1 の高解像度解析では18F FDG 熱心な肺腫瘍トランスポーターの局在と高架式で示した細胞膜 (図 1D)。

Pet の限られた解像度のため PET/CT と組織の両方のオートラジオグラフィーを行った。オートラジオグラフィーの高解像度は、小さい腫瘍や腫瘍18F-FDG 分布の不均一性を特定できます。腫瘍誘導後 KL マウス (図 2A) で続いて放射線写真法 (図 2 bおよび2 C) これらのマウスから分離した肺に18F-FDG PET/CT イメージングを行った.図 2 b 2 Cで見られる、オートラジオグラフィー識別18F-FDG 陽性まだペットボトルによって容易に認識されなかった 2 つの追加小さい腫瘍放射線写真法、次は、biomarker(s) の (IHC) 免疫組織化学染色組織スライドを使用できます。H & E 染色の腫瘍 (図 2D) 左葉の腫瘍の存在を確認しました。

次に、 18F-FDG pet を行った MLN0128 治療KraG12D;Lkb1-/-マウスの肺腫瘍 (図 3) 糖代謝の機能性バイオ マーカーとして18F-FDG を利用するために。MLN0128 による治療は確実 mTORC1 シグナル伝達と減少18F-FDG 消費 (図 3 aと3 b) で示すように、解糖系を阻害するがわかりました。これらの結果は、以前公開された実験室17,27として KL マウスの MLN0128 を評価する臨床研究に同意します。最後に、IHC 染色は、腫瘍 (図 3C) で行われました。腫瘍は、(P S6)対不活化 (S6) H & E のまたはリン S6、mTORC1 の保存された基板は、mTORC1 活性化を示すために使用する抗体のいずれかを染色しました。図 3Cは、KL 腫瘍に比べて車両は、過去に発表された17に同意する治療を受けた人の MLN0128 による P S6 の堅牢な抑制を示しています。KRAS、に加えて上皮成長因子受容体 (EGFR) などの発癌のドライバーは肺腫瘍と同様の解糖系代謝をサポートします。したがって、エルロチニブ恒常活性変異 EGFR の阻害抑制マウス異種移植片18F-FDG 代謝かどうかをテストしました。図 3 Dそして3Eひと肺腫瘍ライン HCC827 del19、egfr 遺伝子の変異を庇護が次の 5 日間エルロチニブ治療の有意な減少18F-FDG 消費を示したことを示します。

最後に、断面の肺と肺腫瘍腫瘍病理組織のサブタイプ、壊死、血管正常肺と空気のスペースを区別するために同様に総腫瘍の負担を定量化する組織モルフォメトリー分析による検討を行った。KL GEMMs は、さまざまな histopathologies の肺腫瘍を持つ自分自身を提示複雑な病理学的病を開発しました。(ADC) 腺癌および扁平上皮癌 (SCC) が含まれます-この不均一性は手ごわい挑戦この癌の治療を行います。図 4Aは、現在 2 つの大きな腫瘍を持つ単一 H & E 染色の肺の葉を示しています。図 4Bに示すように高倍率の画像は通常肺、血管と空域、および腫瘍壊死として明確に定義された乳頭構造と、扁平上皮癌によって特徴付けられる腺癌を識別します。図 4Cは、肺葉の腫瘍通知形態のソフトウェアを使用して擬似着色を表します。図 4Dは、正常肺、血管、腫瘍の壊死や分割高分化腺癌扁平上皮癌腫瘍のサブタイプなど個々 の病態の割合を示しています。

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図 1: 代謝的活性KraG12D;Lkb1-/- (KL) 突然変異体の肺腫瘍は、 18F-FDG 正とエクスプレス高レベルのグルコーストランスポーター 1 (Glut1).パネルAとBは、扁平上皮癌の肺腫瘍をかくまっているいくつかの FDG 熱心な KL マウスの18F PET と CT 解析の最大強度投影 [3 次元 (3 D) 画像とも呼ばれる] を表示します。(T) として、3次元復元および肺 tumor(s) の (B) 横、矢状面と冠状ビュー (A) を示します。(C) このパネルはパネルAとBで画像化された KL マウスの全肺組織を示しています、どちらか染色抗体、H & E (上部パネル) の特定 Glut1 (底板)。肺の葉の番号が付けられます。スケール バー = 2 mm (D) この図 H & E (中間パネル) のパネルCに示すようにスライドからの方向と H & E または Glut1 染色腫瘍のより高い解像度 40 X 画像とマウス (上部パネル) の葉数を表しますか。Glut1 の特定抗体で染色 (底板)。スケール バー = 25 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

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図 2:18F FDG の放射線写真法は代謝活性は、小さな腫瘍を識別できます。(A) この18F-FDG PET/CT 画像は、 18F FDG 熱心な腫瘍 KL マウスの最大値投影画像として表示されます。T1 と T2 腫瘍、H = = 心臓、B 膀胱、K = = 腎臓。(B) このパネルは、マウスの右と左の肺野区間の連続切片の前のヴィヴォオートラジオグラフィーを示しています。左と右のパネルの肺と同じです。左のパネルで肺は、擬似カラーのオレンジです。右パネルの肺は、黒と白の色です。(T1、T2、そして T3) の腫瘍は、矢印で示されます。(C) これは放射線写真法 pseudocolored オレンジ (上部パネル) の拡大と黒と白 (底板)。(D) このパネルは、パネルBに示すように左葉のトップ スライスの H & E 染色を示しています。スケール バー = 200 μ mこの図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 

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図 3: MTOR 阻害剤 MLN0128 KL マウスの肺腫瘍のブドウ糖の消費を抑制は、 18F-FDG ペットボトルによって検出された(A) このパネルを示しています代表的な18F-FDG PET/CT 画像の車両 (18F-FDG 熱心な左) または MLN0128 を投与した KL マウス (18F-FDG、熱心な右)。ビューの表示横 (上部パネル)、コロナ (中央のパネル)、および矢状 (下段)。腫瘍のとおり赤い線。H = 心臓、L = 肝臓。(B) このパネルは、車両、MLN0128 扱われる腫瘍間 SUVmax (%ID/g) の定量化を示しています。(C) このパネルは、車両や MLN0128 KL マウスから全肺セクションの H & E と P S6 染色処理を示しています。スケール バー = 25 μ m。 このパネル ショー代表18F PET (D) と HCC827 EGFR (del19) 異種前の CT 画像と記事エルロチニブ治療。腫瘍 (T) は矢印、K と示される腎臓、B = = 脳。(E) このパネルは、エルロチニブ治療前後 HCC827 異種移植片の SUVmax (%ID/g) の数量を示します。n = 10 腫瘍/グループ。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

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図 4: 腫瘍の負担と腫瘍組織は形態のソフトウェアを使用して定量化した。
(A) このパネル KL マウスから収集した腫瘍と単一のマウス肺の葉の H & E 染色を示しています。(B) これらのより高い解像度の画像を示す扁平上皮細胞癌 (左上)、正常肺、血管と空気のスペース (右上) と高分化乳頭状腺癌 (左下)、壊死 (右下)。(C) このパネルは、H & E 染色の肺の色相表示を示しています葉の形態のソフトウェアを使用しています。(D) このパネルは通知を用いて葉および腫瘍の病理個々 の肺の割合を示しています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

ディスカッション

この記事は、mTOR 阻害剤 MLN0128 の配信を後の肺腫瘍の新陳代謝および分子の両方の応答を測定するために qIHC の18F-FDG PET/CT イメージングを利用したイメージング ベースの実験的アプローチを説明しました。MLN0128 は、腫瘍の重要な代謝反応を示す18F-FDG 消費を効果的に削減します。PET/CT イメージングを免疫組織化学的にリンクすることにより空間 3次元 PET/CT 画像に対する断面腫瘍を登録し全腫瘍細胞・分子レベルでの詳細な検査を行うことができました。これは、MLN0128 が腫瘍における薬剤のターゲット分子応答確認 mTOR シグナルを抑制したことを確認することが可能。最後に、定量組織学を活かしてをマップすることができました、別の異なる腫瘍病理、腫瘍壊死から全体の腫瘤などから扁平上皮癌、腺癌を醸し出し、痛み画像を補完します。

痛みは、現在約 1 mm の空間分解能が制限されます。さらに、血漿グルコース濃度、種類麻酔露出、環境温度に影響を与える動物の一般的な健康の期間など、さまざまな要因によって18F-FDG 保持特定の組織を受けます18F FDG 動態30。これらのパラメーターは、このプロトコルに最適化されていますが、動物モデルごとに最適化する必要があります。マウス皮下腫瘍の18F-FDG 画像の再現研究を示す個々 のマウスの腫瘍治療効果評価18によることを示唆している、約 15% の平均の %ID/g 変動係数PET は、信頼性の高い、重要な31考慮するこのしきい値より大きい必要があります。

その後染色し、qIHC に登録して共同セクション組織オートラジオグラフィによるペット トレーサーの携帯電話とも細胞内の分布を評価できます。CT との共同登録ペットにより、解剖学的なコンテキストに置くことに PET 画像これは非常に貴重な低軟部組織コントラストとも。CT による軟部組織コントラストの欠如は、磁気共鳴画像 (MRI) で克服できます。さらに、蛍光イメージングのためのバイオ マーカーは、生体内解糖系、しかし光子吸収を評価するために使える、肺空洞の散布は正確な定量や検出感度32に影響を与えます。要約すると、定量的組織全体の動物ペット/CT イメージングを用いた腫瘍生物学次の治療的介入の正確かつリアルタイム マップを提供します。

マルチ スペクトル イメージング (MSI) は、カラー画像を使用可能性がありますどのような状況で適用されます。非常には、少なくとも、MSI は、カラー イメージとして同じ情報を提供します、いくつかのアプリケーションの MSI は、以上にシンプルな広帯域 3 色 (RGB) 画像サンプルのスペクトル特性について詳細な提供できます。一般的には、MSI の制限はカラー撮像、MSI は遅いし画像を取得するより多くの時間がかかることを除いて。形態のソフトウェア イメージの再現性の高い、正確な領域分割結果を得るに使用された材料の表に記載されて.組織の分割と組織の定量化に使用できます追加の市販製品があります。

がんの代謝量を超えた Warburg 効果とグルコース代謝33,34。腫瘍が解糖系を阻害する単剤治療に容易に適応している可能性が高いです。アミノ酸代謝への依存度は、がんにも記載されているし、腫瘍が遊離脂肪酸35,36など他の代謝産物と同様に、グルタミン、グリシン、セリンなど amino acids のホストに頼ることになって 37。18F-FDG に加えてプローブなど18F - と11C 標識グルタミン、コリン、酢酸、1-(2'-デオキシ-2'-fluoroarabinofuranosyl) シトシン (FAC) や fluorothymidine (FLT) 正常に使用されているイメージのアミノ酸、ヌクレオチド、および癌38,39,40,41の動物モデルにおける脂質代謝。オートメーション ・ マイクロ トレーサー放射化学技術より高い解像度と相まって、高い感度 PET スキャナー測定様々 な生物的プロシージャ42,43ペットのアクセシビリティが向上します。代謝の増加の理解、論理ペット ラジオト レーサーのレパートリーが研究者や医師が非侵襲的プロファイル腫瘍代謝を有効にする同様に、増加することです。

ペット/CT イメージングと定量組織学の活用に対応臨床の必要性は、急速に臨床使用にベンチ発見を翻訳することです。研究者は、これを達成するためにどのペット/ct の有効薬剤抵抗性獲得と同様、治療の反応を正確に測定できる必要があります。患者は、標準治療として肺腫瘍 PET/CT と免疫組織化学的解析を使用するさらに、したがって、臨床に直接変換可能とします。重要なは、ペット/ct は容易に治療に抵抗性の腫瘍、研究員は分離でき、疾患のメカニズムを理解するために分子レベルで審尋を識別します。これより耐性のメカニズムを理解し、臨床の翻訳のためのより効果的な治療戦略を設計することが可能とした反復的なプロセスです。

開示事項

P. フランシスのケビンは、パーキン エルマーの従業員です。ジェームス ・ マンス フィールドは、ナスダックのパーキンエルマー社、株式会社 (PKI) 株式の公共の株主です。著者がある何も開示します。

謝辞

我々 はカリフォルニア州ロサンゼルスのクランプ前臨床画像技術センター、援助のマウス、並進病理コア研究所とカリフォルニア大学ロサンゼルス校の統計コアの PET/CT イメージングの大学に感謝します。デイヴィッド ・ ゲフィンの医学腫瘍サンプル調製と解析の支援。資金調達、David B. シャッケルフォードだった、CTSI でサポートされている、KL2 トランスレーショナル科学賞許可番号 KL2TR000122、UL1TR000124、デイヴィッド ・ ゲフィン医学部 ucla とによって、部門の防衛肺がん研究プログラム並進パートナーシップ W81XWH-13-1-0459 と ACS RSG-16-234-01-TBG を研究します。ショーン t. ベイリーは、UCLA でデイヴィッド ・ ゲフィン医学部を通して NIH T32 訓練グラント HL072752 によって支えられました。・ アンソニー ・ ジョーンズは、カリフォルニア大学ロサンゼルス校腫瘍細胞生物学トレーニング プログラム (USHHS ルース L. カースクスタイン機関国立研究サービス賞 # T32 CA009056) によってサポートされます。Gihad Abdelhady は、NIH/NCI 多様性補足 R01CA208642 でサポートされます。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
G8 PET/CTPerkin ElmerCLS139564Used for 18F-FDG PET and CT imaging of mice
Axio Imager.M2Zeiss490020-0003-000Acquiring images of FFPE lung tumor sections
Inform softwarePerkin ElmerCLS135781Morphometric used for image analysis of tumor pathologies
Glut1 antibodyAlpha DiagnosticsGT12-AIHC staining of FFPE lung tumor sections
Phospho-S6 Ribosomal Protein (Ser235/236) (D57.2.2E) XP™ Rabbit mAbCell Signaling Technologies4858IHC staining of FFPE lung tumor sections
MX35 Premier microtome blades Thermo Fisher Scientific3051835Microtome blades for sectioning tissue for autoradiography

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