マウス小腸管免疫系からリンパ球を分離すること

要約

腸管関連リンパ組織パイエル排水腸間膜リンパ節など誘導サイトと粘膜を含むエフェクター サイトからのリンパ球の隔離のための詳しいプロトコルについて述べると、小さな腸管免疫系の腸上皮は。

要約

腸管の免疫系は、急性胃腸炎起因する効果的な免疫応答をマウントしながらレスポンス食物抗原と共生細菌の耐性を生成することによって、腸管のバリア機能を維持する上で重要な役割を果たしています。微生物。さらに、ローカルの腸管免疫では、遠いと全身の免疫力の深遠な影響が明らかになった。そのため、腸内の免疫応答を誘導する方法と、免疫応答の結果を研究することが重要です。腸管関連リンパ組織パイエルとドレインの腸間膜リンパ節のような小腸誘導サイトと粘膜のようなエフェクター サイトからのリンパ球の隔離のための詳しいプロトコルの説明ここと腸上皮。この手法は、最適な純度と生存率と許容可能な時間制約の中での最低限のコンパートメント クロスコンタミネーション多数小さい腸組織からのリンパ球の分離を保証します。リンパ球および小腸組織から他の免疫細胞を分離する技術力により、消化器感染症、癌、炎症性疾患に対する免疫応答の理解。

概要

胃腸 (GI) 地域には多くのひだや突起内部の体と外部環境を分離する最大のインターフェイスを表す。腸管の免疫系は、消化管のバリア機能を維持する上で重要な役割を果たしています。それは常に食物抗原、共生細菌と病原微生物にさらされます。そのため、それは急速に急性胃腸炎起因微生物¹効果的な免疫応答を生成する能力を維持しながらの食物抗原と共生細菌への耐性に残らなければなりません。腸管免疫系誘導サイト、ナイーブ リンパ球は抗原提示細胞が腸の粘膜から抗原を運ぶがアクティブ化されている、およびエフェクター サイト、活性化リンパ球出す特定に解剖学的分類できます。エフェクター機能²。誘導サイトは、調査専門の M 細胞と地域の排水腸間膜リンパ節 (MLN) の作用により直接腸管パイエル板 (PP) のリンパ組織構造を構成します。エフェクター サイトは基底膜と小腸上皮、上皮間リンパ球 (IEL) を含む基底膜上にある単一の細胞層の下の結合組織である粘膜 (LP) から成っています。リンパ球が、感染症や癌に対する保護を仲介し、炎症性疾患の免疫病理学にまた貢献するかもしれない適応免疫の主要なプレーヤーです。それは重要でありこれらの明瞭なリンパ球の研究に関連性の高いより良い粘膜局所理解の誘導とエフェクター機能。

腸内免疫事象を探る捜査官の数を加速するいると、これらのコンパートメントからのリンパ球の隔離のための比較的シンプルで統一されたプロトコルが必要です。いくつかの研究グループがマウス小さい腸内コンパートメント^{3,4,5,6,7 から免疫細胞を分離することにいくつかの類似のプロセスを共有プロトコルを公開しています。}.ただし、個々 のプロトコルの焦点に応じてそれらの間でいくつかの技術的な違いがあります。たとえば、LP から免疫細胞を孤立させることにフォーカスを 1 つのプロトコルは細胞生存率、細胞表面マーカーの発現と分離免疫細胞⁵の構成に関するさまざまな酵素の消化力の影響を調べます。他のプロトコルは、密度遠心分離⁶なくリンパ球の隔離のための迅速かつ再現性のある方法を強調表示します。最後に、特定のプロトコルは、小腸⁷の異なったティッシュ層から単核食細胞を分離する目的も存在します。ここでは、小腸の MLN PP LP、IEL のコンパートメントからリンパ球集団の連続分離ができる再現性の高いプロトコルが表示されます。

我々 は主無料その他の腸の仕切りからの汚染物質の LP と IEL のコンパートメントから高純度の人口を隔離するのに焦点を当てます。これは広くプロトコル生成に許容可能な時間の制約^{4,8,9,10、11,12}内で最大限に純粋な実行可能なリンパ球の高収率を使用しました。このプロトコルはまたこれらの異なるコンパートメントにリンパ球を勉強する善意の機会をできるように最小限の交差コンパートメント汚染と LP と IEL コンパートメントからのリンパ球の分離を保証します。分離されたリンパ球は、フローサイトメトリーによる解析や機能解析のようなそれ以上の操作を受けることができます。このプロトコルが正常にリンパ球の分離にマウス小腸と大腸から中に適用されたリステリア菌、サルモネラ、エルシニア ペスチスなど細菌感染症感染症や化学物質、病原体誘発大腸炎などの炎症性条件。このプロトコルは、樹状細胞、マクロファージ、好中球と単球マウス小腸結腸からなどの自然免疫系細胞を分離するも使用できます。

プロトコル

すべての動物実験は、国立衛生研究所のガイドラインに従って実施され、石の小川の大学機関動物ケアおよび使用委員会によって承認されました。

メモ: は、手順を実行する前にすべての承認が与えられていることを確認します。

1. ソリューションの準備

1. HGPG (HEPES、L-グルタミン、ペニシリン/ストレプトマイシン、ゲンタマイシン)、100 ×
   1. ミックス 59.6 g HEPES (最終的な 500 mM)、14.6 g L-グルタミン (最終的な 200 mM)、1 × 10⁶ U (2,000 U/mL 最終) ペニシリン、ストレプトマイシン 1 g (2 mg/mL 最終) と 2.5 mg ゲンタマイシン (5 μ g/mL 最終)。追加 RPMI 1640 ~ 500 mL。NaOH を使用して 7.5 pH 調整 (調整する前にバッファーが ph 値約 6.0 の黄色/オレンジ色)。フィルターは、0.45 μ m のフィルターを使用して滅菌します。因数とストア 4 ° C、1 ヶ月、最長 1 年間、-20 ° C で。
2. HEPES 炭酸バッファーは、10 x
   1. 23.8 g HEPES (最終的な 100 mM)、21 g NaHCO₃ (最終的な 250 mM) を混合し、1,000 mL に水を追加します。塩酸フィルターで 7.2 pH を調整する 0.45 μ m のフィルターを使用して殺菌します。常温で保存します。PH は、時間の経過と共に変更します。再定期的に pH を調整します。
3. メディアを収穫 (〜 1 ボトル/2 マウス)
   1. 500 mL RPMI 1640、25 mL の熱不活化ウシ胎児血清 (5% 最終)、および 5 mL 100 × HGPG を追加します。4 ° C で最大 6 ヶ月の保存します。
4. ジチオエリトリトール (DTE) ソリューション (40 mL/小腸)
   1. ミックス 50 mL 10 × ハンクス平衡塩溶液、Ca₂⁺- および Mg₂⁺-無料、50 mL 10 × HEPES 炭酸バッファー、および 50 mL の熱不活化ウシ胎児血清 (10%)。350 mL H₂O および 15.4 mg ジチオエリトリトール/100 mL (最終的な 1 mM) を追加します。使用する前に新しいこれを準備します。
5. エチレンジアミン edta 溶液 (50 mL/小腸)
   1. ミックス 50 mL 10 × ハンクス平衡塩溶液、Ca₂⁺- および Mg₂⁺-5 mL 100 × HGPG で無料。445 mL H₂O を追加 260 μ L 0.5 M の EDTA を追加/100 mL (最終的な 1.3 mM)。使用する前に新しいこれを準備します。
6. コラゲナーゼの解決 (30 mL/LP)
   1. 500 mL RPMI 追加 50 mL FBS (10 %fbs ファイナル) 5 mL 100 × HPGP、1 mL 0.5 M MgCl₂ (最終 1 mM)、および 1 mL 0.5 M CaCl₂ (最終 1 mM)。タイプ I (100 U/mL ファイナル)、コラゲナーゼを追加します。使用する前に新しいこれを準備します。
7. 密度勾配 (DG) ソリューション
   1. 90 mL DG 原液を混合することによって 1 × DG 原液を準備 (材料の表を参照) を 10 mL 10 × PBS の。4 ° C で滅菌を維持します。
   2. 1 × DG 原液、56 mL RPMI 1640 44 mL を混ぜて 44 %dg ソリューション (8 mL/発想 8 mL/LP) を準備します。使用する前に新しいこれを準備します。
   3. 1 × DG 原液、33 mL RPMI 1640 67 mL を混ぜて 67 %dg 溶液 (5 mL/発想 5 mL/LP) を準備します。使用する前に新しいこれを準備します。

2. 腸間膜リンパ節、腸、の分離およびパイエル パッチ

1. 炭酸ガス麻酔とセカンダリの頚部転位を使用してマウスを安楽死させます。その裏にマウスを置き、70% エタノールをスプレーします。はさみを使用して正中切開し、皮膚と腹壁腹腔内を公開するを開きます。
2. 盲腸を検索し、鉗子を使用して盲腸をそっと引き下げます。鉗子を使用して、慎重にチェーンは、コロンが提携した全体の MLN の公開、右に小腸に移動します。
   注: 腸のチェーンやリンパ排水であった腸間膜リンパ節の地図には、¹³が描かれています。
3. 盲腸に近い、チェーンの下のノードを識別します。その周りに腸間膜/脂肪をつかんで鉗子の別のセットを持つリンパ節の周りから脂肪を tweezing によっては下部から上部の MLN チェーンを削除優しくする鉗子のセットを使用します。
4. MLN チェーンを収穫メディアで湿らせたペーパー タオルに置きます。ペーパー タワーのチェーンをローリングと鉗子の 2 つセットで脂肪を引っ張って腸間膜/脂肪を削除します。冷たい収穫後の分離手順でメディアの MLN の場所。
   注: ノードの (i) 直接操作は推奨されません。代わりに、それらの周りの腸間膜/脂肪を把握します。(ii) 細胞生存率を改善するために可能な限り多くの腸間膜/脂肪を削除するが重要です。
5. 幽門括約筋の下とはさみを使って盲腸上小腸をカットします。腸を引き出しますゆっくり回腸から十二指腸鉗子の別のセットを使用して接続されている腸間膜/脂肪を除去しながら 1 組の鉗子を使用します。
6. 収穫メディアで湿らせたペーパー タオルに腸を置き、鉗子の 2 つのセットをオフ任意の残りの腸間膜/脂肪をいじめます。
   注: (i) は最適な細胞収量および実行可能性のために、できるだけ多くの腸間膜/脂肪を除去することを確認します。(ii) 収穫メディアを定期的に適用することによってこの手順と次の手順で湿らせた腸を維持します。
7. 曲線はさみで腸からそれらを削除することによって、パイエル板を収集します。解離性のスコープまたは虫眼鏡 (初心者) を必要な場合使用します。パイエル板のほとんどは訓練された目に見えるはずです。小腸から 5 11 (典型的な) パイエルを収集します。冷たい収穫後の分離手順でメディアの場所 Peyer のパッチ。
   注: Peyer のパッチが小さく、主に丸腸間膜付着線向かい外側腸壁の膨らみ。
8. 糞便のコンテンツ、粘液を追放するのに回腸に向けて十二指腸から鉗子と優しくスライドの平らな側面を使用します。一度粘液の大部分を削除する手順を繰り返します。
   注: 粘液の削除が不完全する細胞生存率が低下し、降伏。それにもかかわらず、必ず腸絨毛をストリッピングや基底膜の損傷を避けるためにゆっくりスライドしてください。
9. 高級はさみを使用し一点に鈍い端腸に鈍い端を挿入し、腸を縦十二指腸から回腸までオープン カットします。横方向に ~ 2 cm 開いた腸を切る。25 mL 冷たい収穫メディア分離手順については後で 50 mL の円錐管で腸の作品を配置します。
   注: メディアで湿らせたはさみを維持に役立ちます腸で楽々 スライドします。

3. 誘導サイトからリンパ球の分離

1. 3 mL シリンジのプランジャーを使用して 70 μ m セル ストレーナーにどう優しく MLN リンパ球を分離します。5 ml の冷たい収穫メディアのセル ストレーナーを洗浄します。
2. 4 ° C で 5 分間 400 × g で遠心分離によるペレット MLN 細胞1 mL 冷たい収穫メディアで細胞ペレットを再懸濁します。トリパン ブルー色素排除を使用して実行可能なセルを数える。
   注: 赤い血セル換散バッファーは削除中に出血した場合、赤色の血液細胞を削除する使用できます。
3. 37 ° C で 30 分間 220 rpm prewarmed 5 mL コラゲナーゼ溶液 15 mL の円錐管にパイエル板の孵化によって、パイエル板のリンパ球を分離します。
4. 15 の渦最大設定でフィルター s 消化組織及び上澄み 50 mL の円錐管に 70 μ m セル ストレーナー。優しく 3 mL シリンジのプランジャーを使用して残りの組織部分を切り離して、冷たい収穫メディアの 5 mL のセル ストレーナーを洗浄します。
5. 4 ° C で 5 分間 400 × g で遠心分離によってパイエル パッチ細胞をペレットし、1 mL 冷たい収穫メディアで細胞ペレットを再懸濁します。トリパン ブルー色素排除を使用して実行可能なセルを数える。
   注: Peyer のパッチ分離いくつかの汚染の粘膜固有層リンパ球および上皮間リンパ球があります。

4. 小腸上皮間リンパ球の分離

1. 10 回チューブを反転し、解決、腸の部分をさせる、上澄みを離れて注ぐ冷たい収穫メディア 25 mL で 3 回小腸の部分を洗います。
   注: 組織の部分はチューブの底に容易に解決すべき。そうでない場合あまりにも多くの腸間膜/脂肪が添付されているか、空気の泡を関連付けられている指標です。
2. 腸を含んでいる 50 mL の円錐管に prewarmed DTE 溶液 20 mL を追加し、攪拌棒を含む 50 mL のシリル エルレンマイヤー フラスコに転送します。37 ° C で攪拌し、220 rpm 20 分マグネチックスターラーで攪拌棒を保持し、組織とソリューションを 50 mL の円錐管に転送するフラスコの外に大きな磁石を使用します。
3. 渦で最大に設定 10 s. 転送清新しい 50 mL の円錐管に元管内組織部分を保つように注意しながら 70 μ m セル ストレーナー管。の上清を廃棄しないでください上清には、上皮間リンパ球が含まれています。4 ° C で 5 分間 400 × g で遠心分離によるペレット細胞10 mL の冷たい収穫メディアで細胞ペレットを再懸濁します、氷保存できます。
4. 腸を含んでいる 50 mL の円錐管に prewarmed DTE 溶液 20 mL を追加し、攪拌棒を含む 50 mL シリコーン エルレンマイヤー フラスコに戻って転送します。37 ° C で攪拌し、220 rpm 20 分マグネチックスターラーで攪拌棒を保持し、組織とソリューションを 50 mL の円錐管に転送するフラスコの外に大きな磁石を使用します。
   注: DTE は上皮間リンパ球を豊かにする還元剤です。
5. 渦で最大に設定 10 s. 転送清 70 μ m セル ストレーナー (ステップ 4.3) から最初の DTE 治療上清から細胞を含む前のチューブにチューブ。
   注: 残りの腸管部分、粘膜からリンパ球を分離する使用されます。品質管理: 組織の部分ことができます削除、組織学的に上皮細胞が存在し、基底膜が損なわれていないことを確認するチェックします。
6. 4 ° C で 5 分間 400 × g で上清を遠心分離によって細胞をペレット室温 (RT) で 44 %dg 溶液 8 mL の細胞ペレットを再懸濁します。
7. 転送 8 mL 44 %dg ソリューション/細胞懸濁液に 17 mm ø x 100 mm 14 mL ポリプロピレン製丸底チューブをスタイルします。RT 67 %dg 溶液 5 mL にアンダーレイします。ブレーキを使用せず室温で 20 分間 1600 × g で遠心分離機します。
   注: チューブは細胞が管壁に付着するを防ぐためにウシ血清前処理した可能性があります。
8. 生菌が 44% から 67% 界面バンド (バフィー コート) を結成、死んだ細胞といくつかの上皮細胞は、グラデーションの上部に粘液状のフィルムと赤の血液細胞は、ペレットに注意してください。真空吸引によりインターフェイスの ~ 2 cm 以内へのグラデーションの最上位のレイヤーを削除します。パスツール ピペットを使用して、インターフェイスでバフィー コートを収穫し、40 mL 冷たい収穫メディアを含む 50 mL の円錐管にそれらを転送します。
9. 4 ° C で 5 分間 400 × g で遠心分離によるペレット細胞1 mL 冷たい収穫メディアで細胞ペレットを再懸濁します。トリパン ブルー色素排除を使用して実行可能なセルを数える。

5. 小腸粘膜固有層リンパ球の分離

1. 残りの腸の部分を含むフラスコに prewarmed EDTA 溶液の 25 mL を追加することによって腸の組織片から上皮細胞を削除します。37 ° C で 30 分のマグネチックスターラー 220 速回転撹拌フラスコは、攪拌棒を保持し、フラスコ内の腸の部分を維持しながら上澄みを慎重に廃棄フラスコの外に大きな磁石を使用します。
   注: (i) EDTA はカルシウム依存性接合をターゲット、腸管上皮細胞の剥離を促進するカルシウムのキレート剤です。(ii)、上清は曇りであるべきし、自分のコレクションが必要な場合は、IEC を分離するために使用可能性があります。
2. 5.1 のステップを繰り返します。
   注: 上清は少ない曇りこの培養に続くはずです。品質管理: 組織の部分ことができます削除、組織学的に腸上皮細胞を削除されている基底膜が損なわれていないことを確認するチェックします。上清からのサンプルも確認するフローサイトメトリーによって評価されるその白血球 (CD45⁺細胞) が存在しません。
3. RT 収穫メディアの 50 mL をフラスコに追加します。磁石で簡単にかき混ぜます。腸管部分を解決し、慎重に上澄みを廃棄しなさい
   注: この手順により、コラゲナーゼの消化力の前に EDTA の除去、EDTA は、コラゲナーゼの機能にとって重要なカルシウムをキレートでコラゲナーゼを不活性化します。
4. フラスコに prewarmed コラゲナーゼ溶液 30 mL を加え、マグネチックスターラー 45 分に 37 ° C および 220 rpm で腸の部分をかき混ぜます。
5. 転送は、70 μ m セル ストレーナー フィルタ リングによって組織し、50 mL コニカル チューブに上清を消化しました。軽くフィルターをマッシュ アップする 3 mL シリンジのプランジャーを使用して残りの組織部分を切り離して考えます。10 ml の冷たい収穫メディアのフィルターを洗います。
6. 4 ° C で 5 分間 400 × g で遠心分離によるペレット細胞周囲温度 44 %dg 溶液 8 mL の細胞ペレットを再懸濁します。
7. 転送 8 mL 44 %dg ソリューション/細胞懸濁液に 17 mm ø x 100 mm 14 mL ポリプロピレン製丸底チューブをスタイルします。周囲温度 67 %dg 溶液 5 mL にアンダーレイします。常温、1600 × g 20 分でないブレーキとグラデーションを遠心します。
8. 真空吸引により上に脂肪の層を削除します。パスツール ピペットを使用して、インタ フェースと 40 mL 冷たい収穫メディアを含む 50 mL の円錐管に転送でバフィー コートを収穫します。
9. 4 ° C で 5 分間 400 × g で遠心分離によるペレット細胞1 mL 冷たい収穫メディアで細胞ペレットを再懸濁します。トリパン ブルー色素排除を使用して実行可能なセルを数える。

結果

プロトコルの概略図が描かれている (図 1)。腸粘膜誘導とエフェクターのサイト内にあるリンパ球がはっきりと整理されています。Peyer のパッチ (PP) および腸間膜リンパ節 (MLN) を含むよく組織化された T 細胞領域と B 細胞濾胞リンパ腸上皮に分布よりびまん性リンパ球が含まれています。粘膜 (LP) には、分散びまん性リンパ球とリンパ球分離リ?...

ディスカッション

誘導 (MLN と PP)、腸内から粘膜のリンパ球の隔離のため詳細なプロトコルを提示とエフェクター (LP、IEL コンパートメント) サイト。プロトコルが (時間) の入力と出力 (生存率と収量) の生産性と成果を最大化するバランスを開発しました。プロトコルはまた LP と IEL のコンパートメント間の最小限のコンパートメント クロスコンタミネーションを保証します。

マウス小腸...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
HEPES	Fisher Scientific	BP310-500
L-glutamine	Sigma-aldrich	G3126-100G
Penicillin-Streptomycin	Life Technologies	15140-122
Gentamicin	Life Technologies	15710-072
Sodium Hydroxide	Fisher Scientific	S318-500
RPMI 1640	Life Technologies	21870-076
Sodium bicarbonate	Fisher Scientific	S233-500
Fetal bovine serum	Life Technologies	26140-079
10x Hanks' balanced salt solution	Sigma-aldrich	H4641-500ML
1,4-Dithioerythritol	Sigma-aldrich	D9680-5G
0.5M EDTA, pH 8.0	Life Technologies	15575-020
Calsium chloride hexahydrate	Sigma-aldrich	21108-500G
Magnesium chloride hexahydrate	Sigma-aldrich	M2670-100G
Collagenase, Type I	Life Technologies	17100-017
DG gradient stock solution (Percoll)	GE Healthcare	17-0891-01
Red Blood Cell Lysis Buffer	Biolegend	420301
70-µm cell strainer	Corning	352350
14 mL Polypropylene Round-Bottom Tube	Corning	352059
Erlenmeyer flask	Kimble	26500R-50mL
Magnetic stirrer	Thermo Fisher	50094596
Stir bar	Fisher Scientific	14-512-148