마우스 작은 장의 면역 시스템에서 세포를 분리

요약

여기 창 자 연관 된 림프 조직 Peyer의 패치 및 배수 mesenteric 림프절을 포함 하 여 유도 사이트와 lamina propria 포함 이펙터 사이트에서 세포의 고립에 대 한 자세한 프로토콜 설명 및 작은 장 면역 시스템의 장 상피입니다.

초록

장의 면역 시스템 enteropathogenic에 대 한 효과적인 면역 응답을 설치 하는 동안 식이 항 및 공생 박테리아 허용 응답을 생성 하 여 위장의 장벽 기능 유지에 중요 한 역 미생물입니다. 또한, 그것은 분명 지역 장 면역 먼 및 조직의 면역에 깊은 영향을가지고 되었다. 따라서, 그것은 장 면역 반응을 유도 하는 어떻게 무엇 이며 응답의 면역학 결과 공부 하는 것이 중요입니다. 여기, 상세한 프로토콜 창 자 연관 된 림프 조직 Peyer의 패치 및 배수 mesenteric 림프절 같은 소장 유도 사이트와 lamina propria 같은 이펙터 사이트에서 세포의 고립에 대 한 설명 및 장 상피입니다. 이 기술은 최적의 순도 및 생존 능력 허용 시간 범위 내에서 최소한의 상호 compartmental 오염 작은 창 자 조직에서 세포의 많은 수의 격리를 보장합니다. 세포 및 장 조직에서 다른 면역 세포 분리 기술 기능 위장 감염, 암, 염증 성 질환에 면역 반응의 이해를 수 있습니다.

서문

위장 (GI)는 많은 주름 돌출 외부 환경과 내부 신체 분리 큰 인터페이스를 나타내는 있다. 장의 면역 시스템 기 관의 장벽 기능 유지에 필수적인 역할을 한다. 그것은 끊임없이 식이 항, 공생 박테리아 및 병원 성 미생물에 노출 됩니다. 이와 같이, 음식 항 원 및 공생 박테리아 관용 있어야 합니다 빠르게 enteropathogenic 미생물¹에 대 한 효과적인 면역 응답을 생성 하는 능력을 유지 하면서. 장의 면역 시스템 해부학 어디 순진한 림프 톨 항 원 장 점 막에서 항 원을 운반 하는 세포에 의해 활성화 됩니다, 유도 사이트 및 이펙터 사이트, 활성화 된 림프 톨 특정 발휘로 분할 될 수 있다 이펙터 기능². 유도 사이트 구성 조직된 림프 구조에 Peyer의 패치 (PP)의 전문된 M 세포와 지역 배수 mesenteric 림프절 (MLN)의 행동을 통해 직접 창 자 루멘을 조사. 이펙터 사이트 lamina propria (LP), 지하실 멤브레인와 장 상피 세포, intraepithelial 세포 (IEL)를 포함 하는 지하실 멤브레인 위에 있는 단일 셀 레이어 아래 결합 조직으로 구성 됩니다. 세포는 적응 면역의 주요 플레이어는 감염 및 암에 대 한 보호를 중재 하 고 염증 성 질병에 immunopathology에도 기여할 수 있습니다. 그것은 중요 한 고이 고유에 세포를 공부 하는 관련성이 높은 해 부 점 막 구획을 더 나은 이해 그들의 유도 및 이펙터 기능.

소장에 발생 하는 면역 이벤트를 탐험 하는 수 사관의 수는 가속으로 비교적 간단 하 고 통합 프로토콜 이러한 구획에서 세포의 고립에 대 한 필요 합니다. 여러 연구 그룹 출판 마우스 작은 창 자 구획^{3,,45,6,7에서에서 면역 세포를 분리 하는 데 몇 가지 유사한 프로세스를 공유 하는 프로토콜} . 그러나, 개별 프로토콜의 초점에 따라 그들 가운데 몇 가지 기술적 차이가 있습니다. 예를 들어 LP에서 면역 세포를 분리 하는에 초점을 맞추고, 한 프로토콜 세포 생존 능력, 세포 표면 마커 식, 그리고 고립 된 면역 세포⁵의 구성에 다양 한 효소 소화에 미치는 영향을 검사 합니다. 다른 프로토콜 밀도 원심 분리⁶없이 세포의 고립에 대 한 신속 하 고 재현성 방법을 강조 한다. 마지막으로, 특정 프로토콜 또한 작은 창⁷의 다른 조직 층에서 단 식 세포를 고립 시키기 위해 존재 한다. 여기, 소장의 MLN, PP, LP, 및 IEL 구획에서 림프 구 인구의 순차적 격리를 허용 하는 높은 재현 프로토콜 제공 됩니다.

우리는 크게 다른 장의 구획에서 오염 물질의 무료 LP 및 IEL 구획에서 높게 순화 된 인구를 고립 시키기에 초점. 이 널리 사용 프로토콜 생산 허용 시간 제약^{4,8,9,10,,1112}에서 극대로 순수 하 고 실행 가능한 세포의 높은 수확량. 이 프로토콜 또한 타고 난 기회가 뚜렷한 구획에 세포 공부를 수 있도록 최소한의 크로스 compartmental 오염 LP 및 IEL 구획에서 림프 톨의 격리를 보장 합니다. 고립 된 세포 흐름 cytometric 분석 또는 기능 분석 같은 추가 조작 대상이 될 수 있습니다. 이 프로토콜 성공적으로 적용 된 세포의 고립에 마우스 작은 창 자와 콜론에서 Listeria monocytogenes, 살 모 넬 라 typhimurium, 페스트 pseudotuberculosis 등 세균 감염 시 감염 그리고 화학 및 병원 체 유발 장 염 등 염증 성 조건. 이 프로토콜은 수지상 세포, 대 식 세포, 호 중구, 및 monocytes 마우스 작은 창 자와 콜론에서 같은 타고 난 면역 세포를 분리 하도 사용할 수 있습니다.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

프로토콜

모든 동물 실험 국립 건강 연구소의 지침에 따라 실시 하 고 스토 니 브 룩 대학 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인 했다.

주: 절차를 수행 하기 전에 모든 승인을 부여 됩니다 확인 하십시오.

1. 솔루션 준비

1. HGPG (HEPES, L-글루타민, 페니실린/스, 그리고 gentamycin), 100 ×
   1. 혼합 59.6 g HEPES (최종 500 mM) 14.6 g L-글루타민 (200 m m 최종), 1 × 10⁶ U 페니실린 (2000 U/mL 최종), 1 g 스 (2 mg/mL 최종), 그리고 2.5 mg gentamicin (5 µ g/mL 최종). 추가 RPMI 1640 ~ 500 mL. 7.5 NaOH를 사용 하 여 pH를 조정 (조정, 전에 버퍼가 노란색/주황색 약 6.0 ph). 필터는 0.45 μ m 필터를 사용 하 여 소독. 약 수 그리고 저장소 또는 1 달까지 4 ° C에서 최대 1 년 동안-20 ° C에서.
2. HEPES-중 탄산염 버퍼, 10 배
   1. 혼합 23.8 g HEPES (최종 100 mM) 21 g NaHCO₃ (최종 250 m m) 및 1000 mL에 물을 추가. HCl. 여과기와 pH 7.2 조정 0.45 μ m 필터를 사용 하 여 소독. 실내 온도에 상점. 산도 시간이 지남에 변경 됩니다. 다시 정기적으로 pH를 조정 합니다.
3. 미디어를 수확 (~ 1 병/2 마우스)
   1. 500 ml RPMI 1640, 25 mL 열 비활성화 태아 둔감 한 혈 청 (5% 최종), 그리고 5 mL 100 × HGPG 추가 합니다. 4 ° c.에서 최대 6 개월까지 저장
4. Dithioerythritol (DTE) 솔루션 (40 mL/작은 내장)
   1. 믹스 50 mL 10 × 행 크 스 균형된 소금 솔루션, Ca₂⁺-Mg₂⁺-무료, 50 mL 10 × HEPES-중 탄산염 버퍼, 그리고 50 mL 열 비활성화 태아 둔감 한 혈 청 (최종 10%). 350ml H₂O와 15.4 mg dithioerythritol/100 mL (최종 1 m m)를 추가 합니다. 사용 하기 전에이 신선한 준비.
5. Ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA) 솔루션 (50 mL/작은 내장)
   1. 믹스 50 mL 10 × 행 크 스 균형된 소금 솔루션, Ca₂⁺-Mg₂⁺-5 mL 100 × HGPG 무료. 445 mL H₂o. 추가 260 µ L 0.5 M EDTA를 추가/100 mL (최종 1.3 m m). 사용 하기 전에이 신선한 준비.
6. 콜라 솔루션 (30 mL/LP)
   1. 500 mL RPMI, 50 mL FBS 추가 (10 %FBS 최종) 5 mL 100 × HPGP, 1 mL 0.5 M MgCl₂ (최종 1 mM) 및 1 mL 0.5 M CaCl₂ (최종 1 m m). 콜라를 추가 내가 (최종 100 U/mL)을 입력 합니다. 사용 하기 전에이 신선한 준비.
7. 밀도 그라데이션 (DG) 솔루션
   1. 90 mL DG 재고 솔루션을 혼합 하 여 1 × DG 재고 솔루션을 준비 ( 테이블의 자료를 참조) 10 × PBS의 10 mL와 함께. 4 ° c.에 살 균 유지
   2. 1 × DG 재고 솔루션 및 56 mL RPMI 1640 44 mL를 혼합 하 여 44 %DG 솔루션 (8 mL/IEL, 8 mL/LP)를 준비 합니다. 사용 하기 전에이 신선한 준비.
   3. 1 × DG 재고 솔루션 및 33 mL RPMI 1640 67 mL를 혼합 하 여 67 %DG 솔루션 (5 mL/IEL, 5 mL/LP)를 준비 합니다. 사용 하기 전에이 신선한 준비.

2. Mesenteric 림프절, 내장, 절연 및 파이어의 패치

1. 마 취 법 이산화 탄소와 2 차 자 궁 경부 전위를 사용 하 여 마우스를 안락사 그것의 뒤에 마우스를 놓고 70% 에탄올 스프레이 합니다. 중간 절 개를가 위를 사용 하 여 하 고 복 벽 복 막 구멍을 노출 하 고 피부를 엽니다.
2. caecum 찾아서를 부드럽게는 caecum 집게를 사용 하 여. 집게를 사용 하 여 신중 하 게 소장 결 맞춰집니다 전체 MLN 체인 노출 오른쪽으로 이동.
   참고: 내장의 체인 및 임 파 액 배수 장치는 이전 mesenteric 림프절의 지도^13을그려져 있습니다.
3. 체인, 맹에 가까운 있는 하단 노드를 식별 합니다. 집게의 한 세트를 사용 하 여 mesentery/지방 주위를 파악 하 고 부드럽게 제거 MLN 체인 하단에서 상단에 tweezing 집게의 또 다른 세트로 림프절 주위에서 지방으로.
4. 베스트 미디어를 적신 종이 타월에 MLN 체인을 하다. 종이 타워에 체인을 압 연 하 고 집게의 두 세트와 지방을 미루어 여 mesentery/지방을 제거 합니다. 장소 나중 격리 단계에 대 한 차가운 수확 미디어 MLN.
   참고: 노드 (i) 직접 처리 실망입니다. 대신, 그들의 주위 mesentery/지방 파악. (ii) 세포 생존 능력을 개선 하기 위해 가능한 많은 mesentery/지방 제거에 중요 하다.
5. 소장 pyloric 괄약근 아래와 위를 사용 하 여 맹 위를 잘라. 당겨 내장 천천히는 회장에서 십이지 집게의 1 세트를 사용 하 여 연결 된 mesentery/집게의 또 다른 세트를 사용 하 여 지방을 제거 하는 동안에.
6. 베스트 미디어를 적신 종이 타월에 소장을 놓고 집게의 두 세트와 함께 모든 나머지 mesentery/지방에서 애타게 합니다.
   참고: (i) 가능한 최적의 셀 생산량 및 생존 능력에 대 한 많은 mesentery/지방 질을 제거 해야 합니다. (ii) 소장이 다음 단계에 걸쳐 주기적으로 수확 미디어를 적용 하 여 습 유지.
7. Peyer의 패치 곡선가 위 소장에서 그들을 제거 하 여 수집 합니다. 해 범위 또는 (초보자); 필요한 경우 돋보기를 사용 하 여 대부분 Peyer의 패치는 훈련 된 눈에 표시 되어야 합니다. 작은 창 자에서 5-11 (일반) Peyer의 패치를 수집 합니다. 나중 격리 단계에 대 한 차가운 수확 미디어에 장소 파이어 패치.
   참고: 파이어의 패치는 작은, 주로 mesentery 첨부 파일의 라인 반대 장 외벽에 bulges 라운드.
8. 회장으로 십이지에서 집게와 부드럽게 슬라이드의 편평한 측을 사용 하 여 지저분한 콘텐츠 및 점액을 추방. 대부분 점액의 제거를 한 번 반복 합니다.
   참고: 점액의 불완전 한 제거 세포 생존 능력을 감소 하 고 얻을 수 있습니다. 그럼에도 불구 하 고, 부드럽게 villi 스트립 또는 지하실 멤브레인의 손상을 방지 하려면 소장 슬라이드를 해야 합니다.
9. 좋은 위를 사용 하 여 한 지점에 무딘 엔드와, 소장에 무뚝뚝한 끝을 삽입 하 고 자르면 소장 십이지에서 경도 회장에. 옆으로 ~ 2 cm 조각으로 열린된 소장을 잘라. 25 mL 찬 수확 미디어 나중 격리 단계 50 mL 원뿔 튜브에 장 조각을 놓으십시오.
   참고: 미디어를 적신가 위 유지 소장을 통해 여유롭게 슬라이드 그들 도움이 됩니다.

3. 절연 유도 사이트에서 세포의

1. 부드럽게 3 mL 주사기의 플런저를 사용 하 여 70 µ m 셀 스 트레이너를 통해 해리 여 MLN에서 세포를 분리. 셀 스 트레이너 찬 수확 미디어의 5 mL로 씻는 다.
2. 펠 릿 MLN-4 ° c.에서 5 분 동안 400 × g에서 centrifuging 셀 1 mL 찬 수확 미디어에 셀 펠 릿을 resuspend. Trypan 블루 제외를 사용 하 여 가능한 셀을 계산 합니다.
   참고: 붉은 혈액 세포 세포의 용 해 버퍼 제거 중에 발생 한 출혈 하는 경우 적혈구를 제거 하려면 사용할 수 있습니다.
3. 37 ° C와 30 분 동안 220 rpm에서 5 mL prewarmed 콜라 솔루션을 포함 하는 15 mL 원뿔 튜브에 Peyer의 패치를 배양 하 여 Peyer의 헝겊 조각에서 세포를 분리.
4. 15 대 한 소용돌이에서 최대 설정 및 필터 s 소화 조직과 상쾌한 50 mL 원뿔 튜브로 70 µ m 셀 스 트레이너를 통해. 부드럽게 3 mL 주사기의 플런저를 사용 하 여 나머지 조직 조각을 해리 하 고 차가운 수확 미디어의 5 mL와 함께 셀 여과기를 세척.
5. Peyer의 패치 셀 4 ° C에서 5 분 동안 400 × g에서 centrifuging 여 작은 고 1 mL 찬 수확 미디어에 셀 펠 릿 resuspend. Trypan 블루 제외를 사용 하 여 가능한 셀을 계산 합니다.
   참고: 파이어 패치 절연의 일부 오염 lamina propria 세포, intraepithelial 세포를 할 수 있습니다.

4. 소장에서 Intraepithelial 세포의 고립

1. 반전 튜브 10 배, 정착, 장 조각 하 고는 상쾌한을 붓는 하 여 조각을 소장의 세 번 찬 수확 미디어의 25 mL 씻으십시오.
   참고: 조직 조각 쉽게 튜브의 바닥에 침전 해야 한다. 그들이 경우에, 그것은 너무 많은 mesentery/지방 계속 연결 되어 또는 그들은 공기 방울이와 관련 된 표시.
2. 포함 된 내장 조각 50 mL 원뿔 튜브에 prewarmed DTE 솔루션의 20 mL를 추가 하 고 볶음 bar가 포함 된 50 mL 시 삼각 flask에 전송. 37 ° C에서 약동 하 고 20 분에 대 한 자력에 220 rpm를 사용 하 여 큰 자석 플라스 크의 외부에 저 어 바 보유 조직과 솔루션 50 mL 원뿔 튜브 다시 전송.
3. 최대 설정 10 미 전송는 상쾌한 새로운 50 mL 원뿔 관으로 원래 관에서 조직 조각을 계속 주의 70 µ m 셀 스 트레이너를 통해 튜브 소용돌이. 상쾌한; 버리지 마십시오 상쾌한 intraepithelial 세포를 포함 되어 있습니다. 4 ° c.에서 5 분 동안 400 × g에서 centrifuging 펠 릿 셀 10 mL 찬 수확 미디어에 셀 펠 릿을 resuspend 하 고 얼음에 저장 합니다.
4. 포함 된 내장 조각 50 mL 원뿔 튜브에 prewarmed DTE 솔루션의 20 mL를 추가 하 고 다시 50 mL 시 삼각 플라스 크 볶음 bar가 포함 된 전송. 37 ° C에서 약동 하 고 20 분에 대 한 자력에 220 rpm를 사용 하 여 큰 자석 플라스 크의 외부에 저 어 바 보유 조직과 솔루션 50 mL 원뿔 튜브 다시 전송.
   참고: DTE는 풍요롭게 하는 intraepithelial 세포는 감소 시키는 대리인.
5. 소용돌이에 최대 설정 10 미 전송은 상쾌한 70 µ m 셀 스 트레이너를 통해 포함 하는 셀 (4.3 단계)에서 첫 번째 DTE 치료의 상쾌한에서 이전 관으로 관.
   참고: 나머지 장 조각은 lamina propria에서 세포를 분리 하는 데 사용 됩니다. 품질 관리: 조직의 조각은 제거 고 확인 조직학 상피 세포 존재 하 고 지하실 막이 손상 될 수 있습니다.
6. 4 ° c.에서 5 분 동안 400 × g에서 상쾌한 centrifuging 펠 릿 셀 실 온 (RT)에서 44 %DG 솔루션의 8 ml에서 셀 펠 릿을 resuspend.
7. 17 mm ø x 100으로 전송 8 mL 44 %DG 솔루션/세포 현 탁 액은 mm 14 mL 폴 리 프로필 렌 라운드 하단 튜브 스타일. RT 67 %DG 솔루션의 5 mL와 언더레이. 브레이크를 사용 하지 않고 20 분 RT에서 1600 × g에서 원심.
   참고: 튜브 튜브 벽에 튀어나와에서 세포를 방지 하기 위해 소 혈 청으로 pretreated 될 수 있습니다.
8. Note는 44% ~ 67% 인터페이스에서 밴드 (버 피 코트)를 형성 하는 실행 가능한 세포, 죽은 세포와 상피 세포 일부에 그라데이션, 상단의 mucoid 영화 있고 붉은 혈액 세포 펠 릿에. 진공 포부에 의해 인터페이스의 ~ 2 cm 내에서 그라데이션 상위 레이어를 제거 합니다. 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 인터페이스에 버 피 코트를 수확 하 고 40 mL 찬 수확 미디어를 포함 하는 50 mL 원뿔 튜브에 그들을 전송.
9. 4 ° c.에서 5 분 동안 400 × g에서 centrifuging 펠 릿 셀 1 mL 찬 수확 미디어에 셀 펠 릿을 resuspend. Trypan 블루 제외를 사용 하 여 가능한 셀을 계산 합니다.

5. 소장에서 Lamina Propria 세포의 고립

1. 남은 장 조각을 포함 하는 플라스 크에 prewarmed EDTA 솔루션의 25 mL를 추가 하 여 장 조직 조각에서 상피 세포를 제거 합니다. 37 ° C와 30 분 대 한 자력에 220 rpm에서 플라스 크 저 어 저 어 바 그리고 신중 하 게 플라스 크 내의 장 조각을 유지 하면서는 상쾌한 삭제 플라스 크의 외부에 큰 자석을 사용 합니다.
   참고: (i) EDTA 칼슘 chelator 칼슘 종속 연결 대상 장 상피 세포의 분리를 촉진 하는. (ii) 상쾌한 흐린 이어야 하며 그들의 컬렉션을 원하는 경우 IEC를 격리 하는 데 사용할 수 있습니다.
2. 5.1 단계를 반복 합니다.
   참고:는 상쾌한 덜 흐린이 부 화에 따라 이어야 한다. 품질 관리: 조직의 조각 제거 고 확인 조직학 장 상피 세포를 제거 하 고 지하실 막이 손상 될 수 있습니다. Cytometry 확인 하는 상쾌한에서 샘플 평가할 수도 있습니다 그 백혈구 (CD45⁺ 세포) 결 석.
3. 플라스 크를 RT 수확 미디어의 50 mL를 추가 합니다. 자석으로 간단히 저 어 줍니다. 장 조각 정착 하 고 신중 하 게는 상쾌한을 삭제 하자.
   참고:이 단계는 EDTA은 콜라 콜라 함수에 대 한 중요 한 칼슘 킬레이트 화 여 서 콜라 소화 전에 EDTA의 제거를 보장 합니다.
4. Prewarmed 콜라 솔루션의 30 mL 플라스 크에 추가 하 고 45 분 자력에 37 ° C 그리고 220 rpm에서 장 조각 저 어.
5. 전송 70 µ m 셀 스 트레이너를 통해 필터링 하 여 조직 및 50 mL 원뿔 튜브에 상쾌한 소화. 부드럽게 필터를 통해 매 시에 3 mL 주사기의 플런저를 사용 하 여 나머지 조직 조각 해리. 찬 수확 미디어의 10 mL와 함께 필터를 세척.
6. 4 ° c.에서 5 분 동안 400 × g에서 centrifuging 펠 릿 셀 주위 온도 44 %DG 솔루션의 8 ml에서 셀 펠 릿을 resuspend.
7. 17 mm ø x 100으로 전송 8 mL 44 %DG 솔루션/세포 현 탁 액은 mm 14 mL 폴 리 프로필 렌 라운드 하단 튜브 스타일. 주위 온도 67 %DG 솔루션의 5 mL와 언더레이. 실내 온도 아무 브레이크 20 분 동안 1600 × g에서 그라디언트 원심
8. 진공 포부에 의해 위에 지방 층을 제거 합니다. 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 인터페이스와 40 mL 찬 수확 미디어를 포함 하는 50 mL 원뿔 튜브에 버 피 코트를 수확.
9. 4 ° c.에서 5 분 동안 400 × g에서 centrifuging 펠 릿 셀 1 mL 찬 수확 미디어에 셀 펠 릿을 resuspend. Trypan 블루 제외를 사용 하 여 가능한 셀을 계산 합니다.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

결과

프로토콜의 도식 표현 묘사 된다 (그림 1). 림프 톨 유도 장 점 막 및 이펙터 사이트 내에서 명백 하 게 구성 됩니다. 파이어의 패치 (PP) 및 mesenteric 림프절 (MLN) 포함에 잘 조직 된 T 세포 및 B 세포 모 낭, 림프 톨 장 상피 세포 더 만들어진다 배포 되는 포함. Lamina propria (LP)에 브러시가 분산된 세포와 세포 고립된 림프 낭 (ILF)과 cryptopatches 같은 조직된 림...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

토론

자세한 프로토콜 유도 (MLN와 PP) 점 막 세포는 창 자에서 격리에 대 한 제시와 이펙터 (LP 및 IEL 구획) 사이트. 프로토콜 균형 입력 (시간) 및 출력 (생존 및 수율) 결과 및 생산성을 극대화 하기 위해 개발 되었습니다. 프로토콜은 또한 LP와 IEL 구획 사이 최소 상호 compartmental 오염을 보장합니다.

마우스 소장에서 면역 세포의 고립에 대 한 여러 가지 프로토콜 되었습니다 게시

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
HEPES	Fisher Scientific	BP310-500
L-glutamine	Sigma-aldrich	G3126-100G
Penicillin-Streptomycin	Life Technologies	15140-122
Gentamicin	Life Technologies	15710-072
Sodium Hydroxide	Fisher Scientific	S318-500
RPMI 1640	Life Technologies	21870-076
Sodium bicarbonate	Fisher Scientific	S233-500
Fetal bovine serum	Life Technologies	26140-079
10x Hanks' balanced salt solution	Sigma-aldrich	H4641-500ML
1,4-Dithioerythritol	Sigma-aldrich	D9680-5G
0.5M EDTA, pH 8.0	Life Technologies	15575-020
Calsium chloride hexahydrate	Sigma-aldrich	21108-500G
Magnesium chloride hexahydrate	Sigma-aldrich	M2670-100G
Collagenase, Type I	Life Technologies	17100-017
DG gradient stock solution (Percoll)	GE Healthcare	17-0891-01
Red Blood Cell Lysis Buffer	Biolegend	420301
70-µm cell strainer	Corning	352350
14 mL Polypropylene Round-Bottom Tube	Corning	352059
Erlenmeyer flask	Kimble	26500R-50mL
Magnetic stirrer	Thermo Fisher	50094596
Stir bar	Fisher Scientific	14-512-148