Isolando i linfociti del sistema immunitario intestinale piccolo per Mouse

Riepilogo

Qui descriviamo un protocollo dettagliato per l'isolamento dei linfociti dai siti induttivi tra cui il tessuto linfoide associato all'intestino di Peyer ed i linfonodi mesenterici drenanti e i siti di effettrici tra la lamina propria e la epitelio intestinale del piccolo sistema immunitario intestinale.

Abstract

Il sistema immunitario intestinale svolge un ruolo essenziale nel mantenimento della funzione di barriera del tratto gastrointestinale generando tollerante responses to antigeni dietetici e batteri commensali durante il montaggio efficaci risposte immunitarie a enteropatogeni microbi. Inoltre, è diventato chiaro che l'immunità intestinale locale ha un impatto profondo sull'immunità distanti e sistemica. Pertanto, è importante studiare come viene indotta una risposta immunitaria intestinale e qual è il risultato immunologico della risposta. Qui, un protocollo dettagliato è descritto per l'isolamento dei linfociti dal piccolo intestino induttivo siti come il tessuto linfoide associato all'intestino di Peyer e il drenaggio dei linfonodi mesenterici ed effettrici siti come la lamina propria e la epitelio intestinale. Questa tecnica garantisce un isolamento di un gran numero di linfociti dai tessuti intestinali piccole con ottima purezza e vitalità e minima contaminazione trasversale compartimentale all'interno dei vincoli di tempo accettabile. La capacità tecnica per isolare i linfociti e altre cellule immuni da tessuti intestinali permette la comprensione della risposta immunitaria a infezioni gastrointestinali, tumori e malattie infiammatorie.

Introduzione

Il tratto gastrointestinale (GI) ha molte pieghe e sporgenze che rappresenta l'interfaccia più grande che separa il corpo interno e ambiente esterno. Il sistema immunitario intestinale svolge un ruolo essenziale nel mantenimento della funzione di barriera del tratto di GI. È costantemente esposta ad antigeni alimentari, batteri commensali e microbi patogeni. Come tale, deve rimanere tollerante per gli antigeni alimentari e batteri commensali, preservando la capacità di generare rapidamente una risposta immunitaria efficace a microbi enteropatogeni¹. Il sistema immunitario intestinale può essere anatomicamente diviso in siti induttivi, dove i linfociti naive sono attivati da cellule che trasportano gli antigeni da mucosa intestinale presentanti l'antigene, ed effettrici, dove esercitano specifici linfociti attivati effector funzioni². I siti induttivi comprendono la struttura linfoide organizzata di placche di Peyer (PP) che sorveglia il lume intestinale direttamente attraverso l'azione delle cellule M specializzate e regionali drenanti linfonodi mesenterici (MLN). I siti dell'effettore consistono della lamina propria (LP), che è il tessuto connettivo sotto la membrana dello scantinato e l'epitelio intestinale, uno strato unicellulare si trova sopra la membrana dello scantinato che contiene linfociti intraepiteliali (IEL). I linfociti sono giocatori importanti dell'immunità adattativa che mediano protezione contro infezioni e tumori e possono anche contribuire all'immunopatologia nelle malattie infiammatorie. È importante e altamente pertinenti per lo studio dei linfociti in questi distinti compartimenti anatomici mucosi per meglio capire le loro funzioni di induzione ed effettrici.

Un protocollo relativamente semplice e unificato per l'isolamento dei linfociti da questi compartimenti è necessario in quanto il numero di investigatori esplorare immuni eventi che si verificano nell'intestino stanno accelerando. Diversi gruppi di ricerca hanno pubblicato protocolli che condividono diversi processi simili per isolare le cellule immuni dal mouse piccoli scomparti intestinale^3,4,5,6,7 . Tuttavia, ci sono parecchie differenze tecniche fra loro a seconda lo stato attivo del protocollo individuale. Ad esempio, con l'attenzione per isolare le cellule immuni dal LP, un protocollo esamina l'impatto di vari digestioni enzimatiche sulla vitalità cellulare, espressione del marcatore di superficie delle cellule e la composizione delle cellule immunitarie isolato⁵. Un altro protocollo evidenzia un metodo rapido e riproducibile per l'isolamento dei linfociti senza densità centrifugazione⁶. Infine, specifici protocolli esistono anche allo scopo di isolare i fagociti mononucleari dagli strati differenti del tessuto del piccolo intestino⁷. Qui, un protocollo altamente riproducibile che consente l'isolamento sequenza delle popolazioni del linfocita dal vano MLN, PP, LP e IEL di piccolo intestino è presentato.

Ci concentriamo su isolare popolazioni altamente purificate dai comparti LP e IEL, che sono in gran parte privi di contaminanti da altri compartimenti intestinale. Questo ampiamente utilizzato protocollo produce un'alta resa dei linfociti al massimo puri e praticabile entro tempi accettabili vincoli^{4,8,9,10,11,12}. Questo protocollo garantisce anche l'isolamento dei linfociti dal vano LP e IEL con minima contaminazione compartimentali, permettendo una buona fede opportunità studiare i linfociti in questi compartimenti distinti. I linfociti isolati possono essere sottoposti a ulteriori manipolazioni come analisi cytometric di flusso o analisi funzionale. Questo protocollo è applicato con successo per l'isolamento dei linfociti da mouse piccolo intestino e del colon durante infezioni batteriche come la Listeria monocytogenes, Salmonella typhimuriume Yersinia pseudotuberculosis infezioni e patologie infiammatorie come la colite indotta da chimica e patogeno. Questo protocollo è utilizzabile anche per isolare cellule dell'immunità innata quali le cellule dendritiche, macrofagi, neutrofili e monociti da mouse piccolo intestino e del colon.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali sono state condotte secondo le linee guida del National Institute of Health e approvati dal comitato di uso e Stony Brook University istituzionale Animal Care.

Nota: Assicurarsi che tutte le autorizzazioni sono concesse prima di eseguire le procedure.

1. soluzione preparazione

1. HGPG (HEPES, L-Glutammina, penicillina/streptomicina e gentamicina), 100 ×
   1. Mescolare 59,6 g HEPES (500 mM finale), 14,6 g L-Glutammina (finale 200 mM), 1 × 10⁶ U penicillina (2.000 U/mL finale), streptomicina 1 g (2 mg/mL finale) e gentamicina 2,5 mg (5 µ g/mL finale). Aggiungere RPMI 1640 a 500 mL. Aggiustare il pH a 7,5 usando NaOH (prima della regolazione, il buffer è giallo/arancio con un pH di circa 6.0). Filtro sterilizzare usando un filtro da 0,45 µm. Aliquotare e conservare a-20 ° C fino a 1 anno o a 4 ° C per 1 mese.
2. Tampone HEPES-bicarbonato, 10x
   1. Mescolare 23,8 g HEPES (100 mM finale), 21 g NaHCO₃ (250 mM finale) e aggiungere acqua a 1.000 mL. Aggiustare il pH a 7,2 con HCl. filtro sterilizzare usando un filtro di 0,45 μm. Conservare a temperatura ambiente. Il pH cambia nel tempo. Ri-regolare il pH periodicamente.
3. Raccolta multimediale (~ 1 bottiglia/2 topi)
   1. A 500 mL RPMI 1640, aggiungere 25 mL inattivati siero bovino fetale (5% finale) e 5 mL 100 × HGPG. Memorizzare fino a 6 mesi a 4 ° C.
4. Soluzione dithioerythritol (DTE) (40 mL/piccolo intestino)
   1. Mix 50 mL 10 × soluzione salina bilanciata di Hanks e Ca₂⁺- Mg₂⁺-gratis, 50 mL 10 × bicarbonato-HEPES buffer e 50ml inattivati siero bovino fetale (10% finale). Aggiungere 350 mL H₂O e 15,4 mg dithioerythritol/100 mL (1 mM finale). Preparare questo fresco prima dell'uso.
5. Soluzione di acido etilendiamminotetraacetico acido (EDTA) (50 mL/piccolo intestino)
   1. Mix 50 mL 10 × soluzione salina bilanciata di Hanks e Ca₂⁺- Mg₂⁺-gratuito con 5 mL 100 × HGPG. Aggiungere mL 445 H₂O. aggiungere 260 µ l 0,5 M EDTA/100 mL (1,3 mM finale). Preparare questo fresco prima dell'uso.
6. Soluzione della collagenosi (30 mL/LP)
   1. 500 mL RPMI, aggiungere 50 mL FBS (10% FBS finale), 5 mL 100 × HPGP, 1 mL 0,5 M MgCl₂ (finale 1 mM) e 1 mL 0,5 M CaCl₂ (1mm finale). Aggiungere collagenosi, tipo I (100 U/mL finale). Preparare questo fresco prima dell'uso.
7. Soluzioni (DG) gradiente di densità
   1. Preparare 1 × DG stock soluzione mescolando 90 mL DG di soluzione madre (fare riferimento alla Tabella materiali) con 10 mL di 10 × PBS. Mantenere sterile a 4 ° C.
   2. Preparare soluzione di 44% DG (8 mL/IEL, 8 mL/LP) con 44 mL di soluzione madre 1 × DG e 56 mL RPMI 1640. Preparare questo fresco prima dell'uso.
   3. Preparare soluzione DG 67% (5 mL/IEL, 5 mL/LP) con 67 mL di soluzione madre 1 × DG e 33 mL RPMI 1640. Preparare questo fresco prima dell'uso.

2. isolamento dei linfonodi mesenterici, intestini e placche di Peyer Patches

1. Eutanasia il mouse usando anidride carbonica narcosi e dislocazione cervicale secondaria. Posizionare il mouse sul dorso e spruzzare con etanolo al 70%. Usare le forbici per fare un'incisione del midline e aprire la pelle e la parete addominale per esporre la cavità peritoneale.
2. Individuare l'intestino cieco e utilizzare il forcipe per estrarre delicatamente l'intestino cieco verso il basso. Utilizzare pinze per muovere con cautela l'intestino tenue a destra, esponendo l'intera catena MLN, che è allineata con i due punti.
   Nota: Una mappa dei linfonodi mesenterici catena e il drenaggio linfatico dell'intestino era precedentemente raffigurato¹³.
3. Identificare il nodo di fondo della catena, situato più vicino al cieco. Utilizzare un set di pinze per afferrare il mesentere/grasso intorno ad esso e rimuovere delicatamente la catena MLN dal basso verso l'alto di tweezing il grasso da intorno il linfonodo con un altro set di pinze.
4. Posare la catena MLN su un tovagliolo di carta inumidito con media di raccolta. Rimuovere il mesentere/grasso facendo rotolare la catena sulla Torre carta e tirando il grasso fuori con due set di pinze. Posto il MLN in media freddo raccolto per i passaggi successivi di isolamento.
   Nota: (i) diretta gestione dei nodi è scoraggiata. Invece, afferrare il mesentere/grasso intorno a loro. (ii) è fondamentale per rimuovere tanto mesentere/grasso possibile per migliorare la vitalità cellulare.
5. Tagliare l'intestino tenue sotto lo sfintere pilorico e sopra l'intestino cieco con le forbici. Estrarre l'intestino lentamente dall'ileo duodeno tramite un set di pinze mentre si rimuove il mesentere/grasso allegato usando un'altra serie di pinze.
6. Posizionare l'intestino su un tovagliolo di carta inumidito con media raccolto e stuzzicare qualsiasi mesentere/grasso residuo fuori con due set di pinze.
   Nota: (i) assicurarsi di rimuovere tanto mesentere/grasso possibile per cellulare ottimale rendimento e redditività. (ii) mantenere l'intestino inumidito in tutto questo e i seguenti passaggi applicando periodicamente la raccolta multimediale.
7. Raccogliere di Peyer rimuovendoli dall'intestino con forbici curve. Utilizzare un ambito di dissezione o lente d'ingrandimento se necessario (principianti); la maggior parte delle placche di Peyer dovrebbe essere visibile per l'occhio allenato. Raccogliere 5-11 (tipico) placche di Peyer dal piccolo intestino. Posto placche di Peyer patches in media freddo raccolto per i passaggi successivi di isolamento.
   Nota: Placche di Peyer patches sono piccole, principalmente rotondo rigonfiamenti nella parete intestinale esterna fronte alla linea di attacco del mesentere.
8. Utilizzare il lato piatto del forcipe e delicatamente diapositiva dal duodeno verso ileo per espellere il muco e contenuto fecale. Ripetere l'operazione una volta per rimuovere la maggior parte del muco.
   Nota: La rimozione incompleta del muco può diminuire la vitalità cellulare e resa. Tuttavia, assicurarsi di far scorrere l'intestino delicatamente per evitare di spogliatura villi o danneggiare la membrana dello scantinato.
9. Usare le forbici bene con una punta smussata su un punto, inserire l'estremità smussata nell'intestino e tagliare l'intestino aperto longitudinalmente dal duodeno al ileo. L'intestino aperto di lateralmente tagliate a pezzi di ~ 2 cm. Posto i pezzi intestinali in una provetta conica da 50 mL con media freddo raccolto 25 mL per i passaggi successivi di isolamento.
   Nota: Tenendo le forbici inumidite con media li aiuterà a scorrimento senza sforzo attraverso l'intestino.

3. isolamento dei linfociti dai siti induttivi

1. Isolare i linfociti da MLN dissociando delicatamente attraverso un colino di cella di 70 µm utilizzando lo stantuffo della siringa da 3 mL. Lavare il filtro cella con 5 mL di media raccolto freddo.
2. Pellet MLN-cellule mediante centrifugazione a 400 × g per 5 min a 4 ° C. Risospendere il pellet cellulare in media raccolto freddo 1 mL. Conteggio di cellule vitali con esclusione del blu di trypan.
   Nota: buffer di lisi di globuli rossi consente di rimuovere le cellule di anima rosse se lo spurgo ha accaduto durante la rimozione.
3. Isolare i linfociti da placche di Peyer incubando di Peyer in un tubo conico di 15 mL contenente soluzione della collagenosi 5ml preriscaldato a 37 ° C e 220 giri/min per 30 min.
4. Vortex per 15 s all'impostazione massima e filtro digerito tessuto e surnatante in una provetta conica da 50 mL attraverso un colino di cella di 70 µm. Delicatamente dissociare i restanti pezzi di tessuto utilizzando lo stantuffo della siringa da 3 mL e lavare il filtro cella con 5 mL di media raccolto freddo.
5. Pellet di cellule toppa di Peyer mediante centrifugazione a 400 × g per 5 min a 4 ° C e risospendere il pellet cellulare in media raccolto freddo 1 mL. Conteggio di cellule vitali con esclusione del blu di trypan.
   Nota: Isolamento di toppe di Peyer possono avere alcuni contaminanti linfociti della lamina propria e linfociti intraepiteliali.

4. isolamento dei linfociti Intraepithelial dal piccolo intestino

1. Lavare i pezzi di piccolo intestino tre volte con 25 mL di media raccolto freddo capovolgendo il tubo 10 volte, lasciando i pezzi intestinali stabilirsi, e versando il sovranatante.
   Nota: Pezzi di tessuto devono prontamente depositano alla parte inferiore del tubo. Se non lo fanno, è un'indicazione che troppi mesentere/grassi rimane attaccato o sono associati con una bolla d'aria.
2. Aggiungere 20 mL della soluzione DTE preriscaldata a tubo conico da 50 mL contenente pezzi dell'intestino e trasferimento in un matraccio di Erlenmeyer siliconato da 50 mL contenente un'ancoretta. Mescolare a 37 ° C e 220 giri/min su un agitatore magnetico per 20 min. utilizzare un grande magnete sulla parte esterna della muffola per tenere l'ancoretta e trasferire il tessuto e la soluzione torna a tubo conico da 50 mL.
3. Vortice del tubo al massimo l'impostazione per 10 s. trasferimento il surnatante in una nuova provetta conica 50 mL attraverso un colino di cella di 70 µm avendo cura di tenere i pezzi di tessuto nel tubo originale. Non scartare il surnatante; il surnatante contiene linfociti intraepiteliali. Pellet di cellule mediante centrifugazione a 400 × g per 5 min a 4 ° C. Risospendere il pellet cellulare in media freddo raccolto 10 mL e memorizzare sul ghiaccio.
4. Aggiungere 20 mL della soluzione DTE preriscaldata a tubo conico da 50 mL contenente pezzi dell'intestino e trasferire il matraccio di Erlenmeyer siliconato da 50 mL contenente un'ancoretta. Mescolare a 37 ° C e 220 giri/min su un agitatore magnetico per 20 min. utilizzare un grande magnete sulla parte esterna della muffola per tenere l'ancoretta e trasferire il tessuto e la soluzione torna a tubo conico da 50 mL.
   Nota: DTE è un agente riducente che arricchisce di linfociti intraepiteliali.
5. Vortice del tubo al massimo l'impostazione per 10 s. trasferimento il surnatante attraverso un colino di cella di 70 µm nella provetta precedente contenente cellule dal surnatante del primo trattamento DTE (dal punto 4.3).
   Nota: I restanti pezzi intestinali sono utilizzati per isolare i linfociti da lamina propria. Controllo di qualità: Un pezzo di tessuto può essere rimosso e controllato istologicamente per garantire che le cellule epiteliali sono presenti e la membrana basale è intatta.
6. Pellet di cellule mediante centrifugazione il supernatante a 400 × g per 5 min a 4 ° C. Risospendere il pellet cellulare in 8 mL di soluzione DG del 44% a temperatura ambiente (TA).
7. Trasferire la sospensione di 8 mL 44% DG soluzione/cellulare in un ø 17 mm x 100 mm stile tubo tondo-fondo in polipropilene 14 mL. Sottofondo con 5 mL di soluzione di RT 67% DG. Centrifugare a 1600 × g per 20 min a RT senza utilizzare il freno.
   Nota: I tubi possono essere pretrattati con siero bovino per impedire che le cellule aderiscano alle pareti del tubo.
8. Si noti che cellule vitali formano una band (buffy-coat) all'interfaccia del 44% al 67%, le cellule morte e alcune cellule epiteliali sono in un film mocoso nella parte superiore della sfumatura e i globuli rossi sono nel pellet. Rimuovere lo strato superiore della sfumatura all'interno di ~ 2 cm dell'interfaccia tramite aspirazione a vuoto. Utilizzare una pipetta Pasteur per raccogliere il buffy-coat all'interfaccia e trasferirli in una provetta conica da 50 mL contenente 40 mL freddo raccolto media.
9. Pellet di cellule mediante centrifugazione a 400 × g per 5 min a 4 ° C. Risospendere il pellet cellulare in media raccolto freddo 1 mL. Conteggio di cellule vitali con esclusione del blu di trypan.

5. isolamento dei linfociti della Lamina Propria dal piccolo intestino

1. Rimuovere le cellule epiteliali da pezzi di tessuto intestinale aggiungendo 25 mL di soluzione di EDTA preriscaldati il matraccio contenente i pezzi rimanenti intestinali. Boccetta di mescolare a 37 ° C e 220 giri/min su un agitatore magnetico per 30 min. utilizzare un grande magnete sulla parte esterna della muffola per tenere l'ancoretta e attentamente scartare il surnatante mantenendo pezzi intestinale entro il pallone.
   Nota: (i) EDTA è un chelante del calcio che gli obiettivi di giunzioni calcio-dipendente e promuove il distacco delle cellule epiteliali intestinali. (ii) il surnatante dovrebbe essere nuvoloso e può essere utilizzato per isolare IEC se loro collezione è desiderata.
2. Ripetere il punto 5.1.
   Nota: Il surnatante dovrebbe essere meno nuvoloso seguendo questa incubazione. Controllo di qualità: Un pezzo di tessuto può essere rimosso e controllato istologicamente per garantire che le cellule epiteliali intestinali sono stati rimossi e la membrana basale è intatta. Un campione dal surnatante può essere valutato anche tramite flusso cytometry per confermare che leucociti (CD45⁺ cellule) sono assenti.
3. Aggiungere 50 mL di media raccolto RT al pallone. Mescolare brevemente con un magnete. Lasciare pezzi intestinale stabilirsi e attentamente scartare il surnatante.
   Nota: Questo passaggio garantisce la rimozione di EDTA prima della digestione della collagenosi come EDTA inattiva la collagenosi chelatando il calcio che è critico per la funzione di collagenasi.
4. Aggiungere 30 mL di soluzione preriscaldata collagenosi al pallone e mescolare intestinale pezzi a 37 ° C e 220 giri/min su un agitatore magnetico per 45 min.
5. Trasferimento digerito tessuto e surnatante in una provetta conica da 50 mL filtrando attraverso un colino di cella di 70 µm. Delicatamente dissociare pezzi rimanenti del tessuto utilizzando lo stantuffo della siringa da 3 mL di mash attraverso il filtro. Lavare il filtro con 10 mL di media raccolto freddo.
6. Pellet di cellule mediante centrifugazione a 400 × g per 5 min a 4 ° C. Risospendere il pellet cellulare in 8 mL di soluzione DG 44% temperatura ambiente.
7. Trasferire la sospensione di 8 mL 44% DG soluzione/cellulare in un ø 17 mm x 100 mm stile tubo tondo-fondo in polipropilene 14 mL. Sottofondo con 5 mL di soluzione DG 67% temperatura ambiente. Centrifugare le pendenze a temperatura ambiente e 1600 × g per 20 minuti con nessun freno.
8. Rimuovere lo strato di grasso sulla parte superiore tramite aspirazione a vuoto. Utilizzare una pipetta Pasteur per raccogliere il buffy-coat all'interfaccia e trasferirlo in una provetta conica da 50 mL contenente 40 mL freddo raccolto media.
9. Pellet di cellule mediante centrifugazione a 400 × g per 5 min a 4 ° C. Risospendere il pellet cellulare in media raccolto freddo 1 mL. Conteggio di cellule vitali con esclusione del blu di trypan.

Risultati

Una rappresentazione schematica del protocollo è raffigurata (Figura 1). Linfociti all'interno della mucosa intestinale induttivo e siti effettrici distintamente sono organizzati. Peyer di patch (PP) e linfonodi mesenterici (MLN) contengono linfociti nelle aree di cellula T ben organizzate e follicoli di cellule B, mentre l'epitelio intestinale contiene linfociti che sono distribuiti più diffuso. La lamina propria (LP) contiene sia i linfociti diffusamente ...

Discussione

Un protocollo dettagliato è presentato per l'isolamento dei linfociti da intestinale mucosi induttivo (MLN e PP) e siti effettrici (LP e IEL vano). Il protocollo è stato sviluppato per bilanciare l'ingresso (tempo) e uscita (vitalità e rendimento) per massimizzare la produttività e risultati. Il protocollo assicura anche minima contaminazione trasversale compartimentali tra LP e IEL compartimenti.

Diversi protocolli per l'isolamento delle cellule immuni dall'intestino tenue del mouse sono ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
HEPES	Fisher Scientific	BP310-500
L-glutamine	Sigma-aldrich	G3126-100G
Penicillin-Streptomycin	Life Technologies	15140-122
Gentamicin	Life Technologies	15710-072
Sodium Hydroxide	Fisher Scientific	S318-500
RPMI 1640	Life Technologies	21870-076
Sodium bicarbonate	Fisher Scientific	S233-500
Fetal bovine serum	Life Technologies	26140-079
10x Hanks' balanced salt solution	Sigma-aldrich	H4641-500ML
1,4-Dithioerythritol	Sigma-aldrich	D9680-5G
0.5M EDTA, pH 8.0	Life Technologies	15575-020
Calsium chloride hexahydrate	Sigma-aldrich	21108-500G
Magnesium chloride hexahydrate	Sigma-aldrich	M2670-100G
Collagenase, Type I	Life Technologies	17100-017
DG gradient stock solution (Percoll)	GE Healthcare	17-0891-01
Red Blood Cell Lysis Buffer	Biolegend	420301
70-µm cell strainer	Corning	352350
14 mL Polypropylene Round-Bottom Tube	Corning	352059
Erlenmeyer flask	Kimble	26500R-50mL
Magnetic stirrer	Thermo Fisher	50094596
Stir bar	Fisher Scientific	14-512-148