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要約

ここで開発および単一分子配列デジタル ELISA 法、人間のサンプルですべての IFN-α サブタイプの超高感度検出を可能にする検証を記述するプロトコルを提案する.

要約

このプロトコルの主な目的は、開発とインターフェロン (IFN) の検証を記述することです-α 分子配列デジタル酵素結合抗体法 (ELISA) 試金。このシステムは、前例のない感度とは交差しなかった IFN の他の種の人間の IFN-α タンパク質の定量を可能。 にします。

プロトコルの最初のキーのステップは、キャプチャ抗体の共役続く常磁性ビーズおよび検出の抗体のビオチン化抗体ペアの選択です。次のこの手順では、最適感度を達成するまで、試験構成、検出抗体濃度バッファー組成などさまざまなパラメーターを変更できます。最後に、結果の信頼性を確保するため特異性と法の再現性を評価します。ここでは、0.69 fg/ml の自己免疫の polyendocrinopathy を引き起こす自己免疫レギュレータ (アイレ) 蛋白質のシュミレーション変異患者から分離した高親和性抗体を使用して検出限界と IFN α 分子配列アッセイを開発しました。症候群の種類 1/自己免疫 polyendocrinopathy-カンジダ症-外胚葉性ジストロフィー (APS1/APECED)。重要なは、これらの抗体は、すべて 13 IFN α サブタイプの検出を有効にします。

この新しい手法により、検出および IFN α タンパク質の定量 attomolar 濃度で生体試料中初めて。このようなツールは人間の健康と病気の状態、このサイトカインのレベルの監視に便利ですになりますほとんど特に感染症、自己免疫疾患、および autoinflammation。

概要

型 Ifn、抗ウイルス免疫応答を調整する際に中心的な役割を担うサイトカインの家族。彼らが初めて発見されたアイザックスと Lindenmann 60 年前 (13 の IFN-α サブタイプおよび IFN β 1) 14 さまざまなサブクラスをポリペプチドのこの異種族に装備1,2そしてそれは今知られています。私 Ifn はウイルス感染との隙間に欠かせないが、また様々 な人間の病気の状態、若年性皮膚筋炎 (JDM) である自己免疫疾患全身性エリテマトーデス (SLE) などの病理に関与している種類と種類私は interferonopathies 構成型 IFN 誘導されたシグナリング私の病理3,4,5,6、7の結果します。

勉強タイプ I IFN 蛋白生体試料中レベル挑戦されているその最初の識別から、「妨害物質」として1,2。現在、サンドイッチ酵素免疫測定法 (ELISA) は、最も広く使用されている IFN-α タンパク質の検出法です。にもかかわらず、特定、シンプルで、急速な私に限られた感度など IFN Elisa 現在重要な制限事項を入力します。また、IFN α サブタイプのすべての測定では、検出能力と感度複数のアッセイの使用が必要です。別のサブタイプの IFN-α を検出する市販 Elisa、その感度は限られて (1.95 pg/mL、12.5 pg/mL、および 12.5 pg/mL、それぞれ) をしばしば不十分である生体試料の IFN-α タンパク質を検出します。この制限を克服するために定量化するアッセイを開発されているいくつかの生物学的プロキシ タイプ I IFN 誘導遺伝子の発現や機能の活動8,9,10、11,を測定することによって12,13,14. それにもかかわらず、これらの試金は IFN α タンパク質の直接測定を提供しています。

本研究では単一分子配列デジタル ELISA 技術は IFN α タンパク質分子の検出のための試金を開発に使用しました。デジタル ELISA が従来の ELISA と同じ基本的な化学を利用して、ただし、反応が 50,000 個々 46 サイズ用いた井戸15,16を含む配列で起こる。単一タンパク質分子は抗体をコーティングした常磁性ビーズによってキャプチャされ、ビオチン標識検出の抗体、酵素共役、ストレプトアビジン-β-ガラクトシダーゼ (SBG) のバインド順にラベル付け。その後、ビーズ蛍光酵素基質、ら-β-D-ガラクトピラノシド (RGP)、分子配列を中断しています。ボリュームを減少させることによって反応 2, 000, 000 回17、蛍光シグナルの高い局所濃度を達成、各分子が確実にできるようになりました信号を生成する、実現可能になる単一分子数が18を測定します。本質的に単一の分子配列は単一の immunocomplexes をカウントし、酵素ビーズ (AEB) ごとの平均数を決定することができます。タンパク質濃度と immunocomplexed ビーズとビーズの現在の合計数の比と直接相関があるタンパク質分子の定量化/デジタル化ができるように信号が検出されたマイクロウェルをカウント用いたサイズの部屋。

・ ヨンら。19の異なるプラットフォーム間で測定精度、感度、およびデータの相関性を比較する目的で 9 つの異なる技術と 4 つのサイトカインの免疫を使用して広範なクロス プラットフォームの評価研究を行います。研究の主要な調査結果の 1 つは単一分子配列および分子免疫をカウントがサブ pg/mL の濃度範囲内の血清中サイトカインの検出の最高感度を表示されることでした。単一分子配列のデジタル ELISA サイトカインのアッセイは、Crohn 病20、interferonopathy および自動免疫患者7IFN α TNF α, il-6 の役割を研究に使用されている、異なるファーストクリーニング C X のフォームを変更慢性肝炎とシタグリプチン21,22を受け取る健康なドナーのモチーフ ケモカイン 10 (CXCL10)。他のアプリケーションには、糖尿病網膜症23; 患者ロドプシンの測定ニューロ フィラメントの血清/血漿計測による脳の病態の研究光の24とアミロイド β 1-42 ペプチド25多発性硬化症、アルツハイマー病のコンテキストでそれぞれ。HIV ウイルスの貯蔵所26, 特性評価など改良された病原体検出のための DNA27とマイクロ Rna の28の検出、単一分子配列の試金を使用もできます。単一分子アレイ技術の主な利点は、抗体ペアが使用可能な場合、関心の任意の試料に対してアッセイを開発できる、汎用性の高いこの。さらに、自作アッセイ キットが市販するプロトコルは以下の変更された形態の詳細な新しいアッセイの開発が可能します。

ここでは、単一分子配列分析のための開発と検証の手順の詳細な説明は、IFN α タンパク質検出感度が強化されたでその結果が提示されます。単一分子配列の試金のための抗体は特異性の高い (と種特異性が関連する場合と見なされます) の関連蛋白質との交差反応を避ける必要があります。理想的には、10-9 M より小さい KDが付いている抗体を選択必要があります。高い親和性により、高い信号の生産との強い結合です。抗体抗原の結合の動態もでK 重要な高速、オフ遅い K 抗原抗体複雑なアセンブリが支持されます。高感度単一分子配列のアッセイを取得のチャンスを高める良いパフォーマンスは、1 100 pg/mL の検出 (LOD) の制限の古典的な ELISA 抗体ペアから始まります。チャンと同僚は、分析感度18を予測する方程式のセットを提案してすべて 1 つのステップで起こる生体分子の相互作用の詳細な速度論的研究を実行しました。彼らはデジタル ELISA 抗体親和性の広い範囲内で有効であることが表示されますその単一分子配列を示した (KD 〜 10−11 - 10− 9 M) と同様、信号の生成はそのような抗体の率に依存して。

高い親和性を利用するには、抗体自己免疫性 polyendocrinopathy 症候群の患者から分離された抗体の利用をしましたが 1/自己免疫 polyendocrinopathy カンジダ症-外胚葉性ジストロフィー (APS1/APECED)29を入力します。理由はまだ理解されていないが、アイレ欠損患者の大多数が高親和全 IFN α サブタイプ29抗体のコア セットを開発し、我々 は相補的な結合親和性の 2 つの抗インターフェロン α 抗体クローンを選択別の IFN α サブタイプ IC50値によって推定されるようです。これらのユニークな高親和性抗体と単一分子アレイ ・ テクノロジーの組み合わせは、attomolar (fg/mL) 濃度で IFN α の直接定量を有効にします。このような超高感度の IFN-α 蛋白質の検出は、自然、規制および異なった病気設定でインターフェロン誘起反応の生物学的影響のより良い理解に貢献します。

プロトコル

1. 抗体の選択

  1. プロトコルを開始する前にすべてのキーの手順 (表 1) を確認し、最適な抗体を選択します。
    注: このプロトコルの親和性が高い抗インターフェロン α 抗体 - IC50 を表 2で説明が選ばれました。優先的に、従来の ELISA とうまく動作するペアを選択します。

2. キャプチャ抗体常磁性ビーズと異なる濃度のテストの活用

注: 常に抗体の接合過程におけるビーズ活用バッファー (BCB) とビーズ洗浄バッファー (BWB) 氷の上を保持します。

  1. 抗体バッファー交換をキャプチャします。
    1. 抗インターフェロン α 抗体 (0.038 mg/mL、0.075 mg/mL と 0.3 mg/mL) 3 の異なるビーズ動詞の比率をテストする最初の量を取る。
      注: 低抗体コーティング濃度は有益なアッセイが高いバック グラウンド信号を提示した場合することができます。初期の抗体量推定 30% 損失バッファー交換処理中に考慮必要があります。製造元の指示に従って、初期の背景を減らすために、0.05 mg/mL、0.1 mg/mL と 0.3 mg/mL の濃度テストされたバッファーに前述の変数損失のためこれらの正確な値は得られなかった多くの場合が交換プロセス。
    2. 一緒に BCB、最大 500 μ L フィルター列に抗体の必要量を追加します。
    3. 列を遠心分離機 > 10,000 x g は 5 分、流れを破棄します。
    4. 2 回での遠心分離に続いて、BCB の 450 μ L の容量を追加することによって、列を洗う > 10,000 x g で 5 分、流れを破棄します。
    5. -新しいチューブの内側に直面して列の開口部 - 逆さまきれいな遠心管に抗体を含むフィルター列を置き、1 分の 800 × g で遠心分離機します。
      注: この手順はきれいにされた抗体のコレクションになります。この手順に必要なバッファーの追加はありません。
    6. 2.1.5 のように 1 分の 800 の x g で 50 μ L BCB で膜と遠心分離機を洗います。
    7. 低ボリューム分光光度計を用いた抗体の濃度を測定します。
    8. 目的とする抗体濃度を達成し、最終的なボリュームに注意してください BCB を追加します。
      注: 200 μ L のボリュームはプロトコルは、2 つの容積 (2 v) と呼ばれてこのボリュームの残りの部分を記述するために使用されます。すべての次の試薬のボリュームはそれに応じて適応されます。
    9. 渦と氷を続ける。
  2. 常磁性ビーズの作製
    1. 転送 2.8 × 108ビーズ (100 μ L = 1 v) および microfuge の管に。
      注: 量のビーズは 2.1.8 で得られた最終巻に依存しています。
    2. スピンをパルスし 1 分の磁気分離装置に入れて、希釈を破棄し、磁石から削除します。
    3. BWB と 5 の渦の 2 v を追加 s。
    4. 2.2.2 と 2 回と BWB 2.2.3、BCB をさらに 2 回繰り返します。
    5. ビーズの 1 v 190 μ BCB の渦 5 s は、パルス スピンを追加し、氷の上洗浄ビーズを格納します。
  3. ビーズの活性化
    1. ソリューションが均質になるまで 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) カルボジイミド塩酸塩 (EDC) と渦の 10 mg バイアルに冷たい、BCB の 1 mL を追加します。
    2. ビーズの 1 v 洗浄ビーズ、渦、室温で 30 分間 1,000 rpm でシェーカーおいて冷たい希薄 EDC の 10 μ L を追加します。
      注: EDC 準備とに加えて、ビーズ、EDC に水溶液中で不安定なため可能な限りすばやく行われるべき。また、EDC は反応性が高いため、EDC 添加前に均質なビーズ懸濁液を持っている異種ビーズ活性化を防ぐために重要です。EDC 添加後のビーズは、懸濁液に保たれなければなりません。
  4. 抗体ビーズ活用
    1. スピン渦とパルス活性のビーズ。今マグネットセパレーター 1 分にビーズを入れ、上澄み、BCB を破棄、磁石からチューブを取り外します。
    2. BCB の 2 v とビーズを洗浄します。渦、スピン、パルス、1 分のマグネットセパレーター。BCB バッファーを破棄し、磁石からビーズを削除します。
    3. すぐに活性のビーズに、冷たい、バッファー交換 200 μ L (2 v) の抗体を追加します。
    4. 渦と室温でシェーカーで 2 時間保つ。
  5. ビーズ ブロックと最終的なクリーンアップ
    1. パルス スピン抗体をコートしたビーズ懸濁液で、1 分の磁気分離装置に入れて、上清を新しいチューブに転送し、低ボリューム分光光度計で濃度を測定します。
      注: この手順はビーズが飽和しているかどうかに関する情報が提供されます - 溶ける抗体ビーズにバインドすることができないが測定可能となるよう、0 より大きい任意の値はビーズ彩度 - になります。
    2. 磁石を用いた共役ビーズを削除したり、1 分のマグネットセパレーターで BWB、5 s、パルス スピン入れて渦の 2 v を追加します。
    3. 上清を新しいチューブに転送し、低ボリューム分光光度計を使用して濃度を測定します。
      注: この手順は抗体がビーズに固定安定かどうかに関する情報を提供します。この上清の検出の抗体濃度は定期的に起こる、ビーズから抗体の剥離を示します。この試金はしばしばも、キャプチャー抗体の非常に少量はビーズに接続されたまま動作します。
    4. 磁石を用いた共役ビーズを削除したり、1 分のマグネットセパレーターで BWB、5 s、パルス スピン入れて渦の 2 v を追加します。
    5. 磁石を用いた共役ビーズを削除したり、ビーズをブロック バッファー、5 の渦の 2 v を追加 s、室温で 30 分間シェーカーで孵化させなさいと。
    6. 洗って抗体をコーティングした、ブロック ビーズ、BWS で一度、2 v と 3 x と 2 x ビーズ希釈バッファー (すべての培養上清を破棄する)。
    7. ビーズ希釈バッファーの 2 v での使用まで 4 ° C でコーティングしブロックされたビーズを格納します。
      注: 使用する直前ビーズ必要があります洗浄する一度検出器/検体希釈用液 × ビーズのボリューム/20、250 のボリュームを使用して磁気分離装置を使用しています。

3. 検出抗体のビオチン化

  1. 検出抗体バッファー交換
    1. 2 つの抗 IFN-α Ab クローンの 260 μ g を取る。
      注: これはバッファー交換時に 30% の損失を考慮し、二つの異なるビオチン/抗体比率のテストできます。
    2. 2.1 BCB 代わりにビオチン化反応バッファー (BRB) を使用して、進んでください。
    3. ボリュームと抗体濃度を測定し、最終濃度が 1 mg/mL のボリュームを調整します。
      注: これは、提案された開始濃度が、アッセイが必要な感度を達成しない場合に最適化することができます。
  2. 検出抗体のビオチン化
    1. 部屋の温度、N-ヒドロキシスクシンイミド-ポリエチレン-glycol4-ビオチン (NHS-PEG4-ビオチン) を持参し、3.4 mM 濃度を達成するために蒸留水 400 μ L の合計で再懸濁します。
    2. テスト、検出の抗体の希釈ビオチンをそれに応じてミックスするビオチン: 抗体比を決定 (60: 1 の比に等しい検出の抗体の 100 μ L とビオチンの 4.5 μ L)。
      注: 最初に、30: 1 と 60: 1 の比率をテストします。
    3. 渦抗体ビオチン ミックス スピンをパルスし、室温で 30 分間インキュベートします。
      注: を振る必要はありません。
  3. ビオチン標識検出抗体の浄化
    1. 新しいフィルターにビオチン化抗体を転送し、2.1、BRB との 3 洗浄手順として続行 (400 や 450, 450 μ L) と最終的なコレクション。
    2. ボリュームと精製、ビオチン標識検出の抗体と 4 ° C でストアの使用までの濃度を測定します。

4. アッセイ条件の最適化

注: 自作構成30の単一分子配列解析ソフトウェアの使用。
単一分子配列アナライザー マシンはアッセイの標準化、外部パラメーターを変更するのには、サンプルの数量を実行するを実行することができますソフトウェアによって制御 (ビーズ、検出器、sbg 社、RGP 濃度; サンプル希釈...) および内部パラメーター (ステップ、数インキュベーション時間...) 最適分析条件を達成するために、結果 (背景、LOD、数量) を計算するも使用できます。最適化の各ラウンドに必要な試薬体積を計算する単一分子配列アナライザーのセットアップは、製造元の指示を参照してください。2 段構成の最適化の最初のラウンドを実行します。

  1. どちらの構成でもキャプチャ標識抗体ビーズ、ビオチン化検出の抗体の組み合わせをテストします。
    1. 3 つの異なる抗 IFN-α A の組み合わせをテストの検出と捕獲抗体と副として 2 つの異なる抗 IFN-α B ビオチン化比を持つ抗体濃度をキャプチャ適切な条件の選択によって逆 (図 1)analyzer ソフトウェア。
    2. 最も敏感な組み合わせ、最も低い LOD を提供条件を選択し、詳細な手順については、
      注: 図 1に示す方法 0.3 mg/mL 抗インターフェロン α 抗体ビーズ濃度と抗 IFN-α B 抗体と 30: 1 のビオチン: 抗体比なりました最高感度 11.6 fg/mL の LOD で明らかなよう。(補足の表 1を参照)。この組み合わせは、今後すべてのステップのため使用されます。素晴らしい感度が最適化のすべてのラウンドの前にこの特定のアッセイで実現できることに注意してください。

figure-protocol-5239
図 1: 抗体の向きの選択キャプチャ抗体濃度ビーズ、ビオチン化比率。検出抗体 (A) と副として捕獲抗体と抗 IFN-α B 反 IFN α A を使用して、2 つの可能な異なる構成がテストされましたバーサ (B)。インターフェロン-2 c は、抗原として使用されました。異なる捕獲抗体濃度としてビオチン: 抗体 (B:A) 比は、どちらの構成もテストされました。点線は、最高の状態の LOD を示しています抗 IFN-α 30 のキャプチャと抗 IFN-α B ビオチン: 検出抗体比として 0.3 mg/mL (LOD = 11.6 mg/mL 0.017265 の AEB 値に対応する)。2 段階構成が使用されました。ビオチン: 抗体 (B:A).この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

  1. 3 ステップ構成対 2 を比較します。
    注: 3 ステップ構成にある 3 つの異なる培養手順、キャプチャー抗体との 1 つ、1 つの検出の抗体と SBG 酵素分類のための最終的な 3 つ。ただし、2 段構成でキャプチャおよび興味の analyte と同時に孵化する抗体を検出。
    1. 4.1.2 アナライザー、次の製造元の手順30で事前構成されている 2 と 3 ステップの構成を選択するからには、キャプチャおよび検出抗体濃度比と単一分子配列アナライザーを実行します。
    2. 最高の感度を許可する構成を選択し、手順については今後それを維持
      注:図 2および補足の表 2に示すとおり、2 段構成を与えたわずかに高い感度とシグナル/バック グラウンド比テストすべての濃度。したがって、今後のステップの 2 段構成が保たれました。

figure-protocol-6326
図 2:2 対 3 ステップ構成比較します。2 と 3 ステップの構成キャプチャと抗 IFN-α B 30 ビオチン: 抗体の比率で検出の抗体として 0.3 mg/mL 抗 IFN-α、抗体を使用しました。インターフェロン-2 c は、抗原として使用されました。3 ステップの条件設定で 3 つの異なる培養手順、キャプチャー抗体との 1 つ、1 つの検出の抗体と SBG 酵素ラベル付けのための最終的な 3 つがあります。ただし、2 段構成でキャプチャおよび興味の analyte と同時に孵化する抗体を検出。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

  1. 検出抗体と SBG 濃度の最適化
    1. Sbg 社の 3 つの異なる濃度とともに検出器抗体 (0.1、0.3、0.6 μ g/mL) の 3 つの異なる濃度をテスト (250、150、50 分)30上記のよう。
    2. 最高感度を与える濃度を選択して、今後のステップのそれらを保ちます。
      注:図 3に示します検出器には 0.3 μ g/mL と sbg 社 150 pM 最適な LOD を示した条件はあった。これらの条件はまた、低バック グラウンド レベルと中の振幅、良い標準偏差 (SD) の値 (補正表 3) を生成する動作を与えた。典型的な濃度範囲 0.1 - 1 μ G/ml 検出の抗体と 50 から 200 の sbg 社、午後が高濃度 (例えば最大 300 pM) 後者の必要があります。0.02 AEB より高い背景を表示するための条件を避けるために重要です。信号応答と背景の両方を高める器モノクローナル抗体 (mAb) または SBG の濃度を増加させます。ただし、信号の増加は、バック グラウンドで変更を乗り越える、LOD が改善されます。状況は、バック グラウンドで減少が低キャリブレータ間良好な識別をことができますが発生します。

figure-protocol-7510
図 3: 検出器と SBG 濃度の最適化。Sbg 社の 3 つの異なる濃度とともにビオチン検出抗体 (0.1、0.3、0.6 μ g/ml) の 3 つの異なる濃度 (250、150、50 分) 評価しました。点線は、最高の状態の LOD を示しています検出抗体 0.3 mg/mL と SBG 150 pM (LOD = 0.09 mg/mL 0.017184 の AEB 値に対応する)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

  1. その他の最適化手順
    1. 必要な感度が達成されていない場合、アナライザー ソフトウェアで構成済みのオプションを使用して別の手順の異なるインキュベーション時間をテストします。
    2. アッセイが感度が十分でない場合は、アナライザー ソフトウェアで構成済みのオプションを使用してアッセイあたりのビーズの数を最適化します。
      注: 生物学的サンプルのテストが開始されると、検体量は追加のパラメーターの最適化に影響を受けやすいです。健康と安全の手順に従ってサンプルを処理することを確認します。

5. アッセイの特異性と再現性

  1. IFN α サブタイプが異なると他の関連蛋白質 (図 4 aおよび4 b) アッセイをテストして IFN α アッセイの特異性をテストします。

figure-protocol-8452
図 4: 最適化されたインターフェロン分子配列アッセイの感度と特異性。(A) IFN β やインターフェロン λ1、IFN λ2、インターフェロン-ω IFN-γ IFN - α, (B) 16 サブタイプとともに、組換えタンパク質を調べた 3 つの IFN α 2 種類 (IFN α2a、IFN-α2b、および IFN α2c) を含みます。Roderoらから適応。2017この図の拡大版を表示するにはここをクリックしてください。 。

  1. 3 つの独立した複製実験および測定間変動 (図 5) を評価し、最適化された測定の再現性を評価します。
  2. アッセイの LOD を計算します。
    注意: LOD を求めた 3 つの空白 + 3 の標準偏差 (SD) の平均 0.23 fg/mL の値を取得するため。標準試料の希釈倍率は 1:3、希釈倍率の包含は 0.69 fg/mL の LOD を与えます。

figure-protocol-9165
図 5: 最適化されたパン IFN-α 分子配列分析の再現性です。ビーズの 2 つの異なるロットを使用して 3 つの独立した実行を行った。第 2 ロットの 2 つの独立した実験を行った。各測定は、重複に買収されました。点線は、ビーズ + すべてのランの SD あたり平均空平均酵素によって定義された、LOD を表します。IFN α17 は、図 4 bに示すように、派生の標準曲線が他のすべての IFN-α サブタイプの代表であることを考慮、参照として使用されました。プロットは、平均値と SD (誤差の範囲) を示しています。点線は異なる実行; の LOD を表示します。1: 0.073 fg/mL AEB を実行 2: 0.113 fg/mL AEB を実行 0.006238 を = = 3: 0.043 fg/mL AEB を実行 0.007119 = 0.05518)。Roderoらから適応。2017この図の拡大版を表示するにはここをクリックしてください。 。

6. タンパク質競争の試金

  1. アッセイの特異性をさらに実証する蛋白質競争の試金 (図 6凡例で説明) を実行します。
    注: SLE 患者の血漿 (n = 5) 使用されました。
    1. 生体試料中に存在するウイルスが疑われ、精力的に 40 mL 検出器/サンプル希釈と渦に非 ioinic の界面活性剤 (0.5% ノニデット P40 代替) の 200 μ L を追加する不活化バッファーを準備します。
    2. 細胞の残骸を削除する 4 ° C で 15 分間 10,000 g で興味の analyte を含む試料を遠心します。
    3. ミックス 185 μ L 検出器/サンプル希釈液あるいは不活化バッファー 100 μ L 試料 (最終希釈倍率 3) と、15 μ L 抗インターフェロン α 抗体 A (初期濃度 1 mg/mL、最終濃度 50 ug/mL) またはバッファー。室温で 30 分間インキュベートします。
    4. 単一分子配列解析ツール上記のように抗インターフェロン α 抗体の有無にかかわらず、サンプルを実行します。
      注: 信号彩度の場合サンプルする必要がありますさらに希釈します。また、300 μ L、重複解析に必要なボリュームです。

figure-protocol-10525
図 6: 蛋白質の競争の試金。競争の実験は、5 つの異なる SLE 患者からのサンプルを使用して行った。生体試料は 4 ° C で 15 分間 10.000 g で遠心分離しました。彼らが希釈されたウイルス不活化 NP40 を含む検出器/サンプル希釈液を 1/3。抗インターフェロン α 抗体 A の 15µl (初期濃度 1 mg/mL、最終濃度 50 μ g/mL) またはバッファーが追加された 300 μ L の総ボリュームに潜伏した室温で 30 分群はグレーで表示されで処理された試料抗 IFN-α A抗体は、黒で表示されます。グラフでは、平均値と SD (誤差の範囲) を示しています。点線は、LOD を表します (AEB = 0.024774、0.8037 fg/mL)。Roderoら2017 から適応この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

結果

要約すると、0.69 fg/mL、キャプチャ ビーズを使用した 2 段構成の検出限界とパン IFN-α 分子配列試金コーティング 0.3 mg/ml 抗 IFN-α、抗体および抗 IFN-α B 検出抗体ビオチン化ビオチン: 抗体の比で30 が開発されました。ビオチン標識検出の抗体と SBG に使用濃度が 0.3 μ g/mL と 150 分、それぞれ。この非常に特定のアッセイはすべて 13 IFN α サブタイプを検出と Ifn の他のタイプとクロスも反応しません。したがって、IFN α のそれぞれの個々 の種の定量化可能なはなく、それらのすべては検出することができます、IFN α 13 のさまざまなサブクラスを含むため濃度値を一緒に与えて測定します。

この新しく開発されたアッセイの潜在的な診断価値を探索するには、プラズマと健全な個人からの血清の IFN-α タンパク質を測定し、SLE や JDM から患者からのサンプルと比較して.図 7に示すように、IFN α タンパク質の高レベルが健常者と比較して両方の疾患コホートで検出されました。点線は、従来市販 elisa 法は、これらの表現型を持つこのサイトカインの知られている連合にもかかわらずこれらの患者のグループでこのアプローチ IFN α タンパク質が検出がないを示しますの LOD を示します。さらに、1-10 fg/mL アッセイの非常に敏感な性質を確認する間検出可能なレベルと、アッセイの広いダイナミック レンジを示す大きさの 5 のログを上書き IFN α を定量化することができます。

figure-results-892
図 7: プラズマと患者コホートからの血清の IFN-α タンパク質の定量化します。この図は、Roderoらから変更されています。2017。 健常者からプラズマ (n = 20) と SLE 患者 (n = 72) と JDM (n = 43) パン インターフェロン分子配列分析とテストされました。一方通行 ANOVA テスト (クラスカル-ウォリス) とダンの多重比較のグループ間のテストを使用して分析を行った。中央が描かれています。点線を示します参照人間抗 IFN-α ELISA の LOD (1.95 pg/mL = 1950 fg/mL)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

ステップ上の考慮事項参照
1. 抗体ペアの選択ターゲットの異なるエピトープテーブル 2
親和性が高い
Kの高速/低速 Kオフ
2. 抗体ペア向き最低検出限界条件を選択します。図 1
3. 抗体濃度をキャプチャします。
4. ビオチン: 検出器抗体比
5. 2 と 3 ステップの構成最高の信号: バック グラウンド比の条件を選択します。図 2
6. 検出器抗体濃度最低検出限界条件を選択します。図 3
7. SBG 濃度
8. 特異性交差反応性を評価します。図 4
9. 感度(該当する場合) のサブタイプの認識を評価します。
10. 再現性試金の変動を評価します。図 5

表 1: 開発および単一分子配列分析の最適化手順の概要です。この表は、開発と再現性の評価まで抗体ペアの最初の選択からの単一分子配列分析の最適化のために必要な異なる手順をまとめたものです。

抗原8 H 1 (A)12 H 5 (B)SifalimumabRontalizumab
IFNΑ128.351.346022.63
IFNΑ2256310.79.022.15
IFNΑ45.112.9935.35325.3
IFNΑ52.0119.693.292.49
IFNΑ664.73.034.97-
IFNΑ70.90.63233.1-
IFNΑ83020.8369110.86
IFNΑ102.540.7143.2-
IFNΑ1432242.114.520.9
IFNΑ161.8332.9959.1828.65
IFNΑ172.210.77890.923.86
IFNΑ212.7812.8717695.8

表 2: パン α 抗体選択します。IC50 (ng/mL) を用いてインターフェロン刺激応答要素 (資料)-ルシフェラーゼ中和アッセイ。IFN α サブタイプのすべてに単一分子配列試金で使用される抗体の IC50 値を表に示します。10,000 HEK 293 MSR 細胞白半部 96 ウェル プレートでシード, 50 ng 予事業ホタル ルシフェラーゼ レポーターと製造元の指示に従ってトランスフェクション試薬を用いる Renilla ルシフェラーゼ構成逆 transfected。ルシフェラーゼ発現コンストラクトは、内部正規化コントロールとして提供しています。加湿雰囲気で 5% CO2 0.5% 牛胎児血清 37 ° C で、1 mM ピルビン酸ナトリウム 0.1 mM 必須でないアミノ酸を添加した減少血清培地で一晩培養細胞。一晩インキュベートした後細胞が遺伝子組換えヒト IFN-α 反 IFN α モノクローナル抗体またはコントロール 37 ° C で 1 時間虫されていた igg 抗体の有無の混合物を含む培地で 24 時間刺激されました。刺激の 24 h 後デュアル ルシフェラーゼ レポーター アッセイは、製造元の指示に従って行われました。«-» 未定します。Sifalimumab は、IFN α サブタイプの大半を中和して完全ひと免疫グロブリン G1 κ モノクローナル抗体Rontalizumab は、IFN α に対するヒト化モノクローナル抗体です。マイヤーら2016 と Roderoらから適応2017。

補足表 1: 抗体の向きの選択キャプチャ抗体濃度ビーズ、ビオチン化比率。検出抗体 (A) と副として捕獲抗体と抗 IFN-α B 反 IFN α A を使用して、2 つの可能な異なる構成がテストされましたバーサ (B)。インターフェロン-2 c は、抗原として使用されました。異なる捕獲抗体濃度としてビオチン: 抗体 (B:A) 比は、どちらの構成もテストされました。飽和 (Sat)。LOD 計算に使用されたオレンジ: AEB 値これらの濃度は、底堅く推移して AEB の値として空白と考えられていた。LOD 求めた意味空白 + 3SD ですファイルのダウンロードは、こちらをご覧ください。 。

補足テーブル 2: 2 対 3 ステップ構成のテスト。2 と 3 のステップ構成は、抗原としてインターフェロン-2 c を使用して評価されました。AEB 値だけでなく、シグナル/バック グラウンド配給 (S/B) とおり両方の条件です。このファイルをダウンロードするここをクリックしてください。

補足テーブル 3: 検出器と SBG 濃度の最適化。Sbg 社の 3 つの異なる濃度とともにビオチン検出抗体 (0.1、0.3、0.6 μ g/mL) の 3 つの異なる濃度 (250、150、50 分) 評価しました。AEB 値の 9 つのテスト条件のとおりです。LOD 計算に使用されたオレンジ: AEB 値これらの濃度は、底堅く推移して AEB の値として空白と考えられていた。LOD 求めた意味空白 + 3SD ですファイルのダウンロードは、こちらをご覧ください。 。

補足表 4: 最適化されたインターフェロン分子配列アッセイの感度と特異性。ビーズの値ごとの平均の酵素は、IFN β、IFN λ1、IFN λ2、インターフェロン-ω、IFN-γ 遺伝子組換えタンパク質がテストしたとき (A)、16 サブタイプの IFN-α (B) と共に表示されます。«-» 未定します。このファイルをダウンロードするここをクリックしてください。

補足表 5: 最適化されたインターフェロン分子配列分析の再現性です。すべての 3 つの独立した実行の平均 AEB 値は、10.000 fg/mL の濃度表示されます。«-» 未定します。飽和 (Sat)。このファイルをダウンロードするここをクリックしてください。

補足テーブル 6: 蛋白質の競争の試金。ビーズの値ごとの平均の酵素のテストのすべての条件のとおりです。重複の測定を行った。このファイルをダウンロードするここをクリックしてください。

ディスカッション

ここで、開発と人間サンプル (表 1にまとめた手順) で IFN α タンパク質の直接定量再現性の高い、超高感度単一分子配列デジタル elisa 法の検証について述べる。アッセイの開発で最も重要な手順の 1 つは、抗体ペア16動態と正常な試金の鍵をされているエピトープ結合面で特性の選択です。同じエピトープをターゲットまたは立体障害が発生する一対のモノクローナル抗体の使用を避けることが重要です。ポリクローナル抗体は、このような制限を克服するために抗体を検出として使用できます。特定の手順で必要な感度が得られない場合にさらに最適化の可能性が考慮されなければなりません。これは蛋白質の種類などのパラメーターの変更、代替抗体ペアの使用を含めることができます (例えば BSA < カゼイン)、pH (6.0 8.5)、イオン強度、緩衝能力 (例えば塩化ナトリウム、リン酸塩濃度)、キャリア ビーズや界面活性剤の存在。パラメーターの広い範囲コン単一分子配列分析を開発するときに最適化。しかし、全体的に、高い信号: バック グラウンド比と最小限の Lod を与える条件が好ましいもの (図 1図 2、および図 3を参照)。

特異性に関する IFN α アッセイを示した他の Ifn の交差反応をテスト (β、γ、λ1、λ2、ω) (図 4 a) され、すべて 13 IFN α サブタイプ (図 4 b) の検出が可能。しかし、アッセイは、IFN α 2 サブタイプ、(図 4 bおよび補足の表 4) に低い親和性を示した。興味深いことに、IFN-α 2 (a、b、c) の別のクラスの別の感度も観察、個別製造手順や異なるアミノ酸配列に起因する可能性がありますされた IFN α 2 のサブタイプが異なるコマーシャルから得られました。サプライヤー。この唯一の例外には、IFN α のすべての種は、非常に似た応答を与えた。抗 IFN-α (図 6および表 6 の補足) 信号を廃止する、クローンによる試料の前処理によってさらにアッセイの特異性を示した。

この技術の主な利点の 1 つは興味の任意の試料が対象となる16にすることができます潜在的です。さらに、異なる生物学的標本をテストできます、血清、プラズマ、脳脊髄液、細胞溶解液、培養上清中31息さえ32など。通常、プラズマの 1:3 希釈が単一分子配列アナライザーの潜在的な目詰まりを避けるために行われます。しかし、興味の analyte が関連する生物学的サンプルでは非常に低濃度で存在できる、サンプル濃度が高い可能性があります (アッセイ感度) によって必要な33。34良い感度を維持しながら多重化の可能性がある、それはより挑戦的なプロセスと同じ実験内 6 タンパク質がまだ35を開発するより大きい測定のための試金。

検出し、サイトカインとそのような低濃度で他の生物学的関連性の高い蛋白質を定量化する機能は、アプリケーション33,36の全く新しい範囲を開きます。多数のタンパク質が今まで最高の Elisa37の検出限界以下であった非常に低濃度でも効果を及ぼすことが知られています。他イムノアッセイ技術は、従来の ELISA19上の利点を提供して、ここことを示す単一分子配列デジタル ELISA における低濃度サイトカインの超高感度検出のための再現性と堅牢なプラットフォーム人間のサンプル。そのため、この技術は、バイオ マーカー探索と病気の広い範囲の患者管理の向上のための巨大な潜在性を提供しています。

開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

DD と YJC ANR からサポートを認める (プロジェクト IFNX ないです。CE17001002) と ImmunoQure AG モノクローナル抗体を提供するため。我々 は臨床サンプルを提供するためブリジット バーダー ムニエ、ナタリア Bellon、クリスティン Bodemer、アレックス Belot、イザベル Melki をピエール ・ カルティエをありがちましょう。YJC 認める欧州研究評議会 (GA 309449: フェローシップ YJC を)、および軸受け ANR-10-IAHU-01 参照「未来への投資」プログラムの下で国立研究所 (フランス) によって管理される国庫補助。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Anti-IFN-α antibody A (8H1 clone)ImmunoQure AGNANot commercially available
Anti-IFN-α antibody B (12H5 clone)ImmunoQure AGNANot commercially available
Anti-IFN-α antibody EBI-1 cloneeBioscienceBMS216C
Anti-IFN-α antibody BMS216BK cloneeBioscienceBMS216BKNot an ELISA kit but bulk abs
IFN α2ceBioscienceBMS305OK
IFN αI (17)PBL11150-1
IFN α2aPBL11100-1
IFN α2aPeproTechNo longer available
IFN α2bPBL11105-1
IFN α1PBL11175-1
IFN α4a (M1)PBL11177-1
IFN α4b (a4)PBL11180-1
IFN αB2 (a8)PBL11115-1
IFN αC (a10)PBL11120-1
IFN αD (a1)PBL11125-1
IFN αG (a5)PBL11135-1
IFN αF (a21)PBL11130-1
IFN αH2 (a14)PBL11145-1
IFN αJ1 (a7)PBL11160-1
IFN αK (a6)PBL11165-1
IFN αWA (a16)PBL11190-1
IFN λ1PeproTech300-02L
IFN λ2PeproTech300-02K
IFN ωPeproTech300-02J
IFN βPeproTech300-02BC
IFN γPeproTech300-02
Anti-IFN-α ELISAPBL41115.1
96-well platesCorning3904
ISRE-ReporterQiagenCCS-008L
Fu-GENE HD Transfection ReagentPromegaE2311
Opti-MEM Reduced Serum MediuemThermoFischer Scientific31985062
Dual-Luciferase Reporter assayPromegaE1910
Nonidet P40 SubstituteSigma-Aldrich74385
Spectrophotometer NanoDrop 1000Thermo ScientificNo longer available
Amicon micocentrifuge tubes - 0.5mL filtresMerck MilliporeUFC505096
Bead Conjugation BufferQuanterix102040Can not be ordered separately
Non-Encoded Paramagnetic BeadsQuanterix101360
Bead Wash BufferQuanterix102040Can not be ordered separately
EDCFisher Scientific11844071
Bead Blocking BufferQuanterix102040Can not be ordered separately
Bead Diluent BufferQuanterix101362
Detector and Sample DiluentQuanterix101359
Biotinylation Reaction BufferQuanterix102040Can not be ordered separately
NHS-PEG4-BiotinFisher Scientific11891195
diH2O
Centrifuge for 1.7mL microcentrifuge tubes (Heraens Fresco 21 Centrifuge)Thermo Scientific75002478
Standard laboratory vortex mixer (MS2 Minishaker)IKAMS2
Pipettes (10, 20, 200 and 1000 μl)Thermo Scientific
Tips (10, 20, 200 and 1000 μl)Thermo Scientific
1.7mL microcentrifuge tubesEppendorf
Magnetic separator that accomodates 1.7mL microcentrifuge tubes (Life Technologies DynaMag-2)ThermoFisher Scientific12321D
Mini benchtop centrifuge (Galaxy MinisStar)VWR521-2844
Mixer/Shaker (Eppendorf Thermomixer Comfort)Eppendorf
Single molecule array (Simoa) reagents
SBG, Bead and Detector Barcode LabelsQuanterix101652
15 mL Reagent BottlesQuanterix102411
Simoa specimen 96-well platesQuanterix101457
Simoa DiscsQuanterix100001
Simoa 2.0 conductive TipsQuanterix101726
Simoa CuvettesQuanterix100803
Simoa SBG ReagentQuanterix102295
Simoa RGP ReagentQuanterix101736
Simoa System Buffer 1Quanterix100486
Simoa System Buffer 2Quanterix100487
Sealing OilQuanterix100206
ddH2O
Simoa HD-1 AnalyzerQuanterix100032
Technologies
Single molecule array (Simoa)Quanterix
Single molecule counting Erenna Immunoassay SystemsSingluex

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