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Resumo

Aqui nós apresentamos um protocolo para descrever o desenvolvimento e validação de uma única molécula matriz digital ensaio de ELISA, que permite a detecção de ultra sensível de todos os subtipos de IFN-α em amostras humanas.

Resumo

O principal objectivo do presente protocolo é descrever o desenvolvimento e validação de um interferon (IFN)-ensaio digital do ensaio de imunoabsorção Enzyme-Linked (ELISA) de α única molécula matriz. Este sistema permite a quantificação da proteína IFN-α humana com sensibilidade sem precedentes e com nenhuma reactividade cruzada para outras espécies de IFN.

A primeira etapa chave do protocolo é a escolha do par de anticorpos, seguido pela conjugação do anticorpo captura de grânulos paramagnéticos e biotinylation do anticorpo de detecção. Após esta etapa, diferentes parâmetros, tais como configuração de ensaio, concentração de anticorpo do detector e composição do tampão podem ser modificados até que seja alcançada a sensibilidade a melhor. Finalmente, especificidade e reprodutibilidade do método são avaliados para garantir confiança nos resultados. Aqui, nós desenvolvemos um ensaio de matriz única molécula IFN-α com um limite de detecção de 0,69 fg/mL usando alta afinidade auto-anticorpos isolados de pacientes com biallelic mutações na proteína regulador auto-imune (AIRE) causando Poliglandular Auto-imune síndrome tipo 1/autoimune Poliglandular-candidíase-ectodérmica distrofia (APS1/APECED). Importante, estes anticorpos permitiram a deteção de 13 todos os subtipos de IFN-α.

Esta nova metodologia permite a detecção e quantificação de proteína IFN-α em amostras biológicas humanas em concentrações attomolar pela primeira vez. Essa ferramenta será muito útil na monitorização dos níveis desta citocina na saúde humana e Estados de doença, mais particularmente infecção, auto-imunidade e autoinflammation.

Introdução

Tipo I IFNs são uma família de citocinas que desempenham um papel central em orquestrar antivirais respostas imunes. Eles foram descobertos por Isaacs e Lindenmann 60 anos há1,2 e agora é conhecido que esta família heterogênea de polipeptídeos compreende 14 diferentes subclasses (13 subtipos de IFN-α e IFN-1 β). Tipo eu IFNs são essenciais para o apuramento das infecções virais, mas também têm sido implicados na patologia de uma variedade de Estados de doenças humanas, incluindo as doenças auto-imunes Lúpus eritematoso sistémico (SLE), Dermatomiosite juvenil (DMJ), e o tipo Eu interferonopathies em qual tipo de constitutivo eu induzida pelo IFN sinalização resulta em patologia3,4,5,6,7.

Estudar tipo de proteína IFN níveis em amostras biológicas tem sido um desafio desde sua identificação inicial como um, "interferindo substância"1,2. Atualmente, o sanduíche do ensaio de imunoabsorção Enzyme-Linked (ELISA) é o método mais utilizado para detecção de proteínas IFN-α. Apesar de ser específicos, simples e rápida, tipo eu IFN ELISAs apresentam limitações importantes, tais como limitada sensibilidade. Além disso, a medição de todos os subtipos de IFN-α requer o uso de múltiplos ensaios cada com sua própria capacidade de detecção e sensibilidade. Enquanto houver ELISAs comerciais que detectam diferentes subtipos de IFN-α, sua sensibilidade é limitada (1,95 pg/mL, pg/mL 12,5 e 12.5 pg/mL, respectivamente) que é muitas vezes insuficiente para detectar proteínas IFN-α em amostras biológicas. Para contornar essa limitação, vários proxy biológico foram desenvolvidos ensaios para quantificar do tipo I IFN medindo expressão gênica induzida ou atividade funcional8,9,10,11, 12 , 13 , 14. no entanto, estes ensaios não fornecem uma medida direta da proteína IFN-α.

Neste estudo, a única molécula matriz digital ELISA tecnologia foi usada para desenvolver um ensaio para a detecção de moléculas de proteína IFN-α única. ELISA digital utiliza a mesma química básica como ELISA convencional, no entanto, a reação ocorre em matrizes compreendendo 50.000 individual 46 femtoliter tamanho poços15,16. Moléculas de proteína única são capturadas pelo anticorpo-revestida de grânulos paramagnéticos e rotuladas com um anticorpo de detecção biotinilado, seguido por ligação de um conjugado de enzima, streptavidin-β-galactosidase (SBG). Posteriormente, os grânulos são suspensos com um substrato fluorogenic, resorufin-β-D-galactopyranoside (RGP), em matrizes de único-molécula. Diminuindo o volume reação 2 bilhões de vezes17, uma alta concentração local do sinal fluorescente é alcançada e contagens de molécula se tornar viáveis, como cada molécula gera um sinal de que agora pode ser fiavelmente mensurados18. Em essência única molécula matrizes são capazes de contar único imunocomplexos e determinar um número médio de enzimas por grânulo (AEB). Contando aos micropoços em que é detectado um sinal permite a quantificação/digitalização de moléculas de proteína, como não há uma correlação direta entre a concentração de proteína e a relação entre contas de immunocomplexed e um número total de grânulos presentes no as câmaras de tamanho femtoliter.

Yeung et al. realizaram um estudo de avaliação abrangente de plataformas usando diferentes tecnologias de nove e quatro citocinas imunoensaios com o objectivo de comparar a precisão do ensaio, sensibilidade e correlação de dados através de diferentes plataformas19. Dentre as principais conclusões do estudo foi que única molécula matrizes e única molécula contando imunoensaio apresentaram a maior sensibilidade para a deteção de citocinas no soro humano dentro do intervalo de concentração de sub-pg/mL. Ensaios de citocina única molécula matriz Digitas ELISA foram usados para estudar o papel do TNF-α e IL-6 no Crohn doença20, IFN-α em interferonopathy e autoimunes pacientes 7, e as diferentes post-translationally modificado em formas de C-X-C motivo chemokine 10 (CXCL10) em hepatite crônica e doadores saudáveis recebendo sitagliptina21,22. Outras aplicações incluem a medição de rodopsina em pacientes com retinopatia diabética,23; o estudo das patologias do cérebro através de medições de soro/plasma do Neurofilamento luz24 e β-amiloide 1-42 peptídeo25, no contexto da esclerose múltipla e a doença de Alzheimer, respectivamente. Ensaios de matriz única molécula também podem ser usados para detecção de patógeno melhorada como caracterização de reservatório viral HIV26e também para detecção de DNA27 e micro RNAs28. Uma grande vantagem da tecnologia de matriz única molécula é este grande versatilidade, como um ensaio contra qualquer analito de interesse pode ser desenvolvido se um par de anticorpo específico está disponível. Além disso, kits de ensaio do homebrew são comercialmente disponíveis, permitindo o desenvolvimento de novos ensaios, o protocolo que é detalhado em uma forma modificada abaixo.

Aqui, uma descrição detalhada das etapas de desenvolvimento e validação para um ensaio de matriz única molécula é apresentada que resulte em maior sensibilidade para a deteção de proteínas de IFN-α. Anticorpos para ensaios de matriz única molécula devem ser altamente específicos, evitando a reactividade cruzada com proteínas relacionadas (com especificidade de espécie considerada-se relevante). Idealmente, devem ser escolhidos de anticorpos com um KD menor que 10-9 M; alta afinidade assegura ligação forte, com a produção de um sinal mais elevado. A cinética da ligação antígeno-anticorpo são também importantes e rápido Kna e K lentofora favorecerá a montagem de complexos antígeno-anticorpo. Começando com um par de anticorpo que tem um bom desempenho em ELISA clássica, com um limite de detecção (LOD) de 1-100 pg/mL, aumenta as chances de obtenção de um ensaio de matriz de molécula altamente sensível. Chang e colegas realizaram estudos cinéticos detalhados das interações biomoleculares ocorrendo em cada passo, propondo um conjunto de equações para predizer a sensibilidade analítica18. Eles mostraram essa matriz única molécula ELISA digital parece ser eficaz dentro de uma ampla gama de afinidades de anticorpo (KD ~ 10−11 - 10−9 M), bem como a geração de sinal é mais dependente a taxa de tais anticorpos.

Para utilizar alta afinidade anticorpos que tiramos vantagem de anticorpos isolados de pacientes com a Síndrome Poliglandular autoimune tipo 1/autoimune Poliglandular-candidíase-ectodérmica distrofia (APS1/APECED)29. Por razões que ainda não estão totalmente esclarecidos, a grande maioria dos indivíduos de AIRE-deficiente desenvolver um conjunto de alta avidez anticorpos contra todos os subtipos de IFN-α29, e nós selecionamos dois clones de anticorpo anti-IFN-α de afinidades de ligação complementares para os diferentes subtipos de IFN-α, como estimado por valores de IC50 . A combinação destes anticorpos exclusivo de alta afinidade com a tecnologia de matriz única molécula permitiu a quantificação direta de IFN-α em concentrações attomolar (fg/mL). Tal deteção de proteínas de IFN-α ultra-sensível irá contribuir para uma melhor compreensão da natureza, regulamento e impacto biológico da resposta induzida pelo IFN em configurações diferentes da doença.

Protocolo

1. seleção de anticorpos

  1. Antes de iniciar o protocolo de rever todas as etapas-chave (tabela 1) e selecione anticorpos ideais.
    Nota: Para este protocolo foram selecionados os anticorpos anti-IFN-α alta afinidade - o IC50 dos quais são descritos na tabela 2 . Preferencialmente, escolha um par que funciona bem com ELISA convencional.

2. a conjugação de anticorpos de captura de grânulos paramagnéticos e testes de diferentes concentrações

Nota: Sempre grânulo conjugação Buffer (BCB) e do grânulo Wash Buffer (BWB) no gelo durante o processo de conjugação de anticorpo.

  1. Capturar o anticorpo Buffer Exchange
    1. Tome as quantidades iniciais de anticorpo anti-IFN-α A para testar 3 rácios de conjugações diferentes do grânulo (0,038 mg/mL, 0,075 mg/mL e 0,3 mg/mL).
      Nota: Concentrações de anticorpos de baixa do revestimento podem ser benéficas se o ensaio apresenta um sinal de fundo elevado. Quantidade de anticorpo inicial deve contabilizar uma perda estimada de 30% durante o processo de troca de amortecedor. De acordo com as instruções do fabricante, a fim de reduzir o fundo inicial, as concentrações de 0,05 mg/mL, 0,1 mg/mL e 0,3 mg/mL foram testadas, embora estes valores exatos muitas vezes não foram obtidos devido à referida perda variável no buffer processo de troca.
    2. Adicione o volume necessário do anticorpo em uma coluna de filtro em conjunto com o BCB, até 500 µ l.
    3. Centrifugar as colunas no > 10.000 x g durante 5 min e descarte o escoamento.
    4. Lavar a coluna duas vezes pela adição de um volume total de 450 µ l de BCB seguido por centrifugação a > 10.000 x g durante 5 min e descartar o fluxo através de.
    5. Coloque a coluna de filtro contendo o anticorpo em um tubo limpo microcentrifuga de cabeça para baixo - a parte aberta da coluna virado para o interior do tubo de novo - e centrifugar a 800 x g por 1 min.
      Nota: Este passo permitirá a coleção do anticorpo limpo. Sem adição de buffer é necessária para esta etapa.
    6. Lave as membranas com 50 µ l do BCB e centrifugar a 800 x g por 1 min como em 2.1.5.
    7. Medir a concentração de anticorpos utilizando um Espectrofotômetro de baixo volume.
    8. Adicione o BCB para atingir a concentração desejada de anticorpo e anotar o volume final.
      Nota: Um volume de 200 µ l será usado para descrever o resto do protocolo, este volume sendo referido como 2 volumes (2V). Todos os seguintes volumes de reagente serão adaptados em conformidade.
    9. Vórtice e manter no gelo.
  2. Preparação do grânulo paramagnético
    1. Grânulos de transferência 2.8 x 108 (100 µ l = 1V) em um tubo de microcentrífuga.
      Nota: O volume de grânulos é dependente o volume final obtido nas 2.1.8.
    2. Rotação do pulso e colocar em um separador magnético por 1 min, descartar o diluente e remover do ímã.
    3. Adicionar 2V de BWB e vórtice para 5 s.
    4. Repita o 2.2.2 e 2.2.3 duas vezes com BWB e mais duas vezes com o BCB.
    5. Para 1V de grânulos adicionar 190 µ l BCB, vórtice 5 s, rotação de pulso e armazenar os grânulos lavados no gelo.
  3. Ativação do grânulo
    1. Adicione 1 mL do BCB frio para um frasco de 10 mg de cloridrato de 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimida (EDC) e vórtice até que a solução é homogênea.
    2. Para 1V de grânulos Adicione 10 µ l de EDC diluído frio para os grânulos lavados, vórtice e mantenha em um shaker a 1.000 rpm por 30 min à temperatura ambiente.
      Nota: Preparação de EDC e adição para as contas deve ser feita tão rapidamente quanto possível, devido à instabilidade da EDC em soluções aquosas. Também, como EDC é altamente reativo, é importante ter uma suspensão homogénea do grânulo antes da adição de EDC para evitar a ativação do grânulo heterogêneos. Após adição de EDC, grânulos devem ser mantidos em suspensão.
  4. Conjugação do grânulo do anticorpo
    1. Vórtice e pulso giram os grânulos ativados. Agora colocar as contas em um separador magnético por 1 min, descartar o sobrenadante BCB e retire o tubo do ímã.
    2. Lave os grânulos com 2V do BCB. Vórtice, rotação de pulso e colocar no separador magnético para 1 min. Então descartar o buffer do BCB e remover os grânulos do ímã.
    3. Adicione rapidamente o frio, tampão-trocado 200 µ l (2V) de anticorpo para as contas ativadas.
    4. Vórtice e mantenha por 2 h no shaker em temperatura ambiente.
  5. Grânulo bloqueio e Final limpar
    1. Rotação de pulso a suspensão de grânulos de anticorpo-revestido, colocou o separador magnético por 1 min, transfira o sobrenadante para um tubo novo e medir a concentração com um Espectrofotômetro de baixo volume.
      Nota: Este passo irá fornecer informações sobre se os grânulos são saturados - quaisquer valores acima de zero indica saturação do grânulo - como detecção de anticorpos solúveis não é possível vincular as contas serão mensurável.
    2. Remover os grânulos conjugados do ímã, adicionar 2V de BWB, vórtice para 5 s, rotação de pulso e colocar no separador magnético para 1 min.
    3. Transferir o sobrenadante para um tubo novo e medir a concentração usando um Espectrofotômetro de baixo volume.
      Nota: Este passo irá fornecer informações sobre se os anticorpos são estàvel fixas para os grânulos. Concentração de anticorpo detectável neste sobrenadante indicará descolamento do anticorpo de grânulos, que acontece regularmente. Este ensaio frequentemente funciona mesmo quando quantidades muito pequenas de captura anticorpo permanecem ligadas aos talões.
    4. Remover os grânulos conjugados do ímã, adicionar 2V de BWB, vórtice para 5 s, rotação de pulso e colocar no separador magnético para 1 min.
    5. Retire o ímã grânulos conjugados, adicionar 2V do grânulo bloqueio de Buffer, vórtice por 5 s e incube no shaker durante 30 min à temperatura ambiente.
    6. Lavagem do anticorpo-revestido e bloqueada contas 3x com 2V, uma vez com BWS e 2 x com tampão diluente do grânulo (descartar todos os sobrenadantes).
    7. Armazene os grânulos revestidos e bloqueados em 4° C até o uso com 2V de tampão diluente do grânulo.
      Nota: Imediatamente antes da utilização, grânulos devem ser lavados uma vez com Detector/diluente de amostra usando um volume de 250 x volume do grânulo/20, utilizando o separador magnético.

3. detecção anticorpo Biotinylation

  1. Deteção de anticorpo Buffer Exchange
    1. Pegue 260 µ g de dois clones Ab anti-IFN-α.
      Nota: Isto leva em consideração uma perda de 30% durante troca de amortecedor e permite teste de duas proporções diferentes biotina/anticorpo.
    2. Proceda como 2.1 usando Biotinylation reação Buffer (BRB) em vez de BCB.
    3. Medir o volume e as concentrações de anticorpos e ajustar o volume para obter uma concentração final de 1 mg/mL.
      Nota: Esta é uma concentração inicial sugerida, mas ele pode ser otimizado se o ensaio não atingir a sensibilidade necessária.
  2. Deteção anticorpo Biotinylation
    1. Trazer a N-Hidroxisuccinimida-polietileno-glycol4-biotina (NHS-PEG4-biotina) à temperatura ambiente e ressuspender com um total de 400 µ l de água destilada para obter uma concentração de 3,4 mM.
    2. Decidir a relação de biotina: anticorpo para testar e misturar o anticorpo da deteção e biotina diluída em conformidade (60:1 ratio igual a 100 µ l de anticorpo detecção e 4,5 µ l de biotina).
      Nota: Para começar, teste rácios de 30: 1 e 60:1.
    3. Mistura de vórtice do anticorpo-biotina, rotação de pulso e incube por 30 min à temperatura ambiente.
      Nota: Não precisa apertar.
  3. Purificação do anticorpo biotinilado deteção
    1. O anticorpo biotinilado de transferência para um filtro novo e proceder como 2.1, executar 3 passos de lavagem com BRB (400, 450 e 450 µ l) e uma coleção final.
    2. Medir o volume e a concentração do anticorpo biotinilado da deteção purificado e loja a 4 ° C até o uso.

4. ensaio de otimização

Nota: Use o software de analisador de matriz única molécula em uma configuração de Homebrew30.
A máquina de analisador de matriz única molécula é controlada por um software que permite para executar padronizações de ensaio, para executar as quantificações de amostra, para modificar parâmetros externos (talão, detector, SBG, RGP concentrações; diluições da amostra...) e interno parâmetros (número de passos, incubações...) para alcançar as condições ideais de ensaio e também pode ser usado para calcular os resultados (quantidades de fundo, LOD,). Para a instalação do analisador matriz única molécula e calcular os volumes de reagente necessários para cada rodada de otimização, consulte as instruções do fabricante. Realize as primeiras rodadas de otimização usando uma configuração de 2 passos.

  1. Teste combinações de captura anticorpo conjugado grânulos e biotinilado deteção em ambas as configurações.
    1. Testar combinações da três diferentes anti-IFN-α A capturar as concentrações de anticorpos com as dois diferentes anti-IFN-α B biotinylation proporções como deteção e captura de anticorpos e vice versa (Figura 1), pela seleção das condições adequadas em o software de analisador.
    2. Escolher a combinação mais sensível, ou seja, as condições que oferecem o mais baixo LOD, e usá-lo para novas etapas
      Nota: A Figura 1 mostra como um 0,3 mg/mL anti-IFN-α uma concentração de grânulo de anticorpo e uma relação de biotina: anticorpo de 30: 1 com anticorpo anti-IFN-α B resultou na maior sensibilidade, como evidenciado por um LOD de 11,6 fg/mL. (Ver tabela complementar 1). Esta combinação será usada para todas as etapas futuras. Observe que o grande sensibilidade alcançada com este ensaio específico antes de qualquer rodadas de otimização.

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Figura 1: seleção da orientação do anticorpo, capturar a concentração de anticorpo em grânulos e relação biotinylation. Foram testadas duas possíveis configurações diferentes, usando o A anti-IFN-α como captura anticorpo e anti-IFN-α B como anticorpo de deteção (A) e vice versa (B). IFNα - 2C foi utilizado como antígeno. Captura de diferentes concentrações de anticorpos, bem como relações de biotina: anticorpo (B:A) também foram testadas para ambas as configurações. Linha pontilhada mostra LOD para a melhor condição; anti-IFN-α um 0,3 mg/mL como captura e anti-IFN-α B biotina: detector anticorpo razão de 30 (LOD = 11,6 mg/mL, correspondente a um valor AEB de 0.017265). Utilizou-se uma configuração de 2 passos. Biotina: anticorpo (B:A). clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

  1. Compare um 2 vs 3-passo de configuração.
    Nota: Em uma configuração de 3 etapas, existem etapas de incubação diferentes três, uma com o anticorpo de captura, um com o anticorpo da deteção e um terceiro final para a rotulagem de enzima SBG. No entanto, em uma configuração de 2 passos, capturar e anticorpos de deteção são incubados em simultâneo com o analito de interesse.
    1. Execute o analisador de matriz única molécula com a captura e a concentracao de anticorpo detector e rácios de 4.1.2 selecionando as configurações 2 e 3-etapa pré-configuradas no analisador, instruções30 do fabricante seguir.
    2. Escolha a configuração que permite a mais alta sensibilidade e mantê-lo por etapas futuras
      Nota: Como mostrado na Figura 2 e complementar a tabela 2, a configuração 2-passo deu ligeiramente maior sensibilidade e relação de sinal/plano de fundo para cada concentração testada. Portanto, a configuração 2-passo foi mantida para etapas futuras.

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Comparação de configuração passo 3-Figura 2:2 vs. As configurações de 2 e 3-passo foram avaliadas usando 0,3 mg/mL de um anticorpo anti-IFN-α como captura e anti-IFN-α B como anticorpo da deteção, na proporção de 30 biotina: anticorpo. IFNα - 2C foi utilizado como antígeno. Em uma configuração da condição 3-passo, existem três incubação diferentes passos, um com o anticorpo de captura, um com o anticorpo da deteção e um terceiro final para a rotulagem de enzima SBG. No entanto, em uma configuração de 2 passos, capturar e anticorpos de deteção são incubados em simultâneo com o analito de interesse. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

  1. Otimização de concentração de anticorpo detector e SBG
    1. Teste de três diferentes concentrações do anticorpo detector (0,1, 0,3 e 0,6 µ g/mL), juntamente com três diferentes concentrações da SBG (50, 150 e 250 pM) conforme descrito acima de30.
    2. Escolher as concentrações que dá a maior sensibilidade e mantê-los para ações futuras.
      Nota: A Figura 3 mostra aquele detector de 0,3 µ g/mL e 150 SBG pM foram as condições que mostraram o LOD ideal. Estas condições também deram níveis de fundo de baixa e média amplitude, um comportamento que produz valores bom desvio padrão (SD) (complementar a tabela 3). Concentrações típicas variam entre 0,1 - 1 µ g/mL para o anticorpo da deteção e da 50-200 pM para SBG, embora umas concentrações mais elevadas (por exemplo, até 300 pM) deste último pode ser necessária. É importante evitar condições que irão processar fundos superiores a 0,02 AEB. Aumentando a concentração do anticorpo monoclonal de detector (mAb) ou SBG irá melhorar tanto a resposta de sinal e a fundo. No entanto, se o incremento no sinal supera a mudança no plano de fundo, o LOD irá melhorar. Uma situação pode ocorrer em que uma diminuição no fundo permite melhor discriminação entre os calibradores baixos.

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Figura 3: otimização de concentração Detector e SBG. Três diferentes concentrações de biotinilado detector (0,1, 0,3 e 0,6 µ g/ml) em conjunto com três diferentes concentrações da SBG (50, 150 e 250 pM) foram avaliados. Linha pontilhada mostra LOD para a melhor condição; anticorpo do detector em 0,3 mg/mL e SBG 150 pM (LOD = 0,09 mg/mL, correspondente a um valor AEB de 0.017184). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

  1. Etapas adicionais de otimização
    1. Se a sensibilidade necessária não foi alcançada, tempos de incubação diferentes para as diferentes etapas usando as opções pré-configuradas no software analisador de teste.
    2. Se o ensaio não é sensibilidade suficiente, otimize o número de grânulos por ensaio usando as opções pré-configuradas no software analisador.
      Nota: Uma vez que testes de amostras biológicas começa, volume de amostra é um parâmetro adicional suscetível a otimização. Certifique-se que as amostras são tratadas de acordo com os procedimentos de segurança e saúde.

5. ensaio de especificidade e reprodutibilidade

  1. Testar a especificidade do ensaio de IFN-α, testando o ensaio com diferentes subtipos de IFN-α e de outras proteínas relacionadas (figura 4a e 4b).

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Figura 4: especificidade e sensibilidade do ensaio de matriz de molécula do IFNα otimizado. (A) IFN-β, IFN-λ1, λ2-IFN, IFN-ω e proteínas recombinantes foram testadas, juntamente com (B) 16 subtipos de IFN-α, IFN-γ, incluindo três tipos de IFN-α2 (IFN-α2a, IFN-α2b e IFN-α2c). Adaptado de Rodero et al. 2017. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

  1. Avalie a reprodutibilidade do ensaio otimizado pela realização de três experimentos independentes de replicar e avaliar a variabilidade inter ensaio (Figura 5).
  2. Calcular o LOD do ensaio
    Nota: O LOD foi calculada a média dos três espaços em branco + 3 desvios padrão (SD), obtendo-se assim um valor de 0,23 fg/mL. Como o fator de diluição de amostra-padrão é 1:3, a inclusão do factor de diluição dá um LOD de 0,69 fg/mL.

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Figura 5: reprodutibilidade do ensaio otimizado pan-IFN-α única molécula matriz. Três corridas independentes foram realizadas utilizando dois lotes diferentes dos grânulos. Para o segundo lote, foram realizados dois experimentos independentes. Cada medida foi adquirida em duplicatas. A linha pontilhada representa o LOD, definida pela média da enzima média em branco por grânulo + SD de todas as execuções. IFN-α17 foi usado como referência, tendo em conta que a curva padrão derivada é representante de todos os outros subtipos de IFN-α, como mostrado na figura 4b. Enredo mostra o valor médio e SD (barras de erros). Linhas pontilhadas mostram LOD para a execução de diferente; Executar 1: 0.073 fg/mL AEB = 0.006238, executar 2: 0,113 fg/mL AEB = 0.007119, executar 3: 0.043 fg/mL AEB = 0.05518). Adaptado de Rodero et al. 2017. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

6. ensaio de competição de proteína

  1. Realizar um ensaio de competição de proteína (descrito na Figura 6 legenda) para demonstrar ainda mais a especificidade do ensaio.
    Nota: Amostras de Plasma pacientes com SLE (n = 5) foram utilizados.
    1. Quando o vírus são suspeitos de estar presente na amostra biológica, prepare buffer de inactivação adicionando 200 µ l de tensoativo não-ioinic (0,5% nonidet P40 substituto) 40ml Detector/diluente de amostra e vórtice vigorosamente.
    2. Centrifugar as amostras biológicas contendo o analito de interesse a 10.000 g durante 15 min a 4 ° C para remover restos celulares.
    3. Amortecedor do diluente ou inativação da Detector/amostra do µ l da 185 Mix com 100 µ l da amostra biológica (fator de diluição final 3) e 15 µ l anti-IFN-α anticorpo A (inicial de concentração 1 mg/mL, a concentração final de 50 ug/mL) ou buffer. Incube durante 30 min à temperatura ambiente.
    4. Execute amostras com e sem o anticorpo anti-IFN-α no analisador de matriz a única molécula como descrito acima.
      Nota: Em caso de saturação de sinal, as amostras devem ser ainda mais diluídas. Além disso, 300 µ l é o volume necessário para análise em duplicado.

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Figura 6: ensaio de competição de proteína. Foram realizados experimentos de competição usando amostras de cinco diferentes pacientes de SLE. Amostras biológicas foram centrifugadas a 10,000 g durante 15 min a 4 ° C. Eles foram diluídos 1/3 com diluente de amostra/Detector contendo NP40 para inativação viral. 15 µ l de anticorpo anti-IFN-α A (inicial de concentração 1 mg/mL, a concentração final de 50 µ g/mL) ou tampão foram adicionados a um volume total de 300 µ l. incubação foi realizada à temperatura ambiente por 30 min. grupo de controle é mostrado em cinza e as amostras tratadocom com anti-IFN-α A anticorpos são mostrados em preto. O gráfico mostra o valor médio e SD (barras de erros). Linha pontilhada representa LOD (AEB = 0.024774, 0.8037 fg/mL). Adaptado de Rodero et al . 2017 clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Resultados

Em resumo, um ensaio de matriz única molécula pan-IFN-α com um limite de detecção de 0,69 fg/mL, usando uma configuração de 2-passo com captura de grânulos revestidos com 0,3 mg/mL de anti-IFN-α um anticorpo e anti-IFN-α B deteção anticorpo biotinilado na proporção de biotina: anticorpo 30 foi desenvolvido. As concentrações usadas para biotinilado deteção e SBG foram 0,3 µ g/mL e 150 pM, respectivamente. Este ensaio altamente específico é capaz de detectar todos os 13 subtipos de IFN-α e o cross não reage com outro tipo de IFNs. Assim, enquanto não é possível identificar e quantificar cada espécie individual de IFN-α, todos eles podem ser detectados e medidos juntos, dando um valor de concentração total para IFN-α, que compreende as 13 diferentes subclasses.

Para explorar o potencial valor diagnóstico deste teste recentemente desenvolvido, proteína IFN-α no plasma e no soro de indivíduos saudáveis foram medidos e comparados com amostras de pacientes que sofrem de SLE e JDM. Conforme ilustrado na Figura 7, altos níveis de proteína IFN-α foram detectados em ambas as coortes de doença em comparação com controles saudáveis. A linha pontilhada indica o LOD de um convencional ELISA comercialmente disponível, ilustrando como esta abordagem não detectaria proteína IFN-α nestes grupos de pacientes apesar das associações desta citocina conhecidas com estes fenótipos. Além disso, IFN-α pode ser quantificada sobre 5 registros de magnitude, ilustrando a ampla faixa dinâmica do ensaio, com níveis detectáveis entre 1-10 fg/mL, confirmando a natureza altamente sensível do ensaio.

figure-results-1801
Figura 7: quantificação da proteína IFN-α no plasma e soro do pacientes coortes. Esta figura foi modificada em Rodero et al. 2017. plasma de controles saudáveis (n = 20) e pacientes que sofrem de SLE (n = 72) e JDM (n = 43) foram testados com o ensaio de matriz única molécula pan-IFNα. Análise foi realizada usando o teste de ANOVA One-Way (Kruskal-Wallis) e do Dunn teste entre grupos de comparação múltipla. Mediana é retratada. Linha pontilhada indica LOD de um referência humana anti-IFN-α ELISA (1,95 pg/mL = 1950 fg/mL). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

PassoConsiderações sobreReferência
1. escolha do par de anticorpoDiferentes epitopos alvoTabela 2
Alta afinidade
Rápido Kna / K lentofora
2. orientação do par anticorpoEscolha uma condição com o menor limite de detecçãoFigura 1
3. capturar a concentração de anticorpos
4. relação de anticorpo biotina: Detector
5. 2 vs 3-passo de configuraçãoEscolher a condição com a maior relação de sinal: fundoFigura 2
6. concentração de anticorpo detectorEscolha uma condição com o menor limite de detecçãoFigura 3
7. concentração de SBG
8. especificidadeDeterminar a reactividade cruzadaFigura 4
9. sensibilidadeAvaliar o reconhecimento dos subtipos (se aplicável)
10. reprodutibilidadeAvaliar a variabilidade do ensaioFigura 5

Tabela 1: Resumo das etapas de desenvolvimento e otimização de um ensaio de matriz única molécula. Esta tabela resume os diferentes passos necessários para o desenvolvimento e otimização de um ensaio de matriz única molécula, desde a escolha inicial do par de anticorpo até a avaliação da reprodutibilidade.

Antigénio8H 1 (A)12H 5 (B)SifalimumabRontalizumab
IFNΑ128,351,346022,63
IFNΑ2256310.79,022.15
IFNΑ45.112.9935.35325.3
IFNΑ52.0119,693.292,49
IFNΑ664,73.034.97-
IFNΑ70.90,63233.1-
IFNΑ83020,8369110,86
IFNΑ102.540,7143,2-
IFNΑ1432242.114.520.9
IFNΑ161.8332.9959,1828.65
IFNΑ172.210,77890,923.86
IFNΑ212.7812.8717695.8

Tabela 2: seleção do anticorpo Pan-alfa. IC50 (ng/mL) determinada usando o elemento de resposta interferon-estimulada (ISRE)-ensaio de neutralização de Luciferase. Tabela mostra valores de IC50 de mAbs utilizados no ensaio de matriz única molécula para todos os subtipos de IFN-α. 10.000 células HEK 293 MSR foram semeadas em placas de 96 poços de metade-área brancas e reverso-transfectadas com 50 ng pré-misturado ISRE-Firefly luciferase repórter e construtos de Renilla luciferase usando reagentes de transfecção de acordo com as instruções do fabricante. A construção do luciferase-expressando serviu como um controle interno de normalização. As células foram incubadas durante a noite em reduzida soro suplementado com aminoácidos não essenciais de 0,1 mM, piruvato de sódio 1 mM, 0,5% de soro bovino fetal a 37º C, 5% de CO2 em um ambiente umidificado. Após a incubação durante a noite, as células foram estimuladas por 24 h com meio contendo misturas de recombinante humano IFN-α com ou sem anti-IFN-α mAbs ou controle IgG que tinha sido pré-incubada durante 1 h a 37 ° C. Após 24h de estimulação, dual luciferase repórter ensaios foram realizados de acordo com as instruções do fabricante. «-» Não determinado. Sifalimumab é um plenamente humano, imunoglobulina G1 κ anticorpo monoclonal que vincula e neutraliza a maioria dos subtipos de IFN-α; Rontalizumab é um anticorpo monoclonal humanizado contra IFN-α. Adaptado de Meyer et al . 2016 e Rodero et al 2017.

Suplementares tabela 1: seleção da orientação do anticorpo, capturar a concentração de anticorpo em grânulos e relação biotinylation. Foram testadas duas possíveis configurações diferentes, usando o A anti-IFN-α como captura anticorpo e anti-IFN-α B como anticorpo de deteção (A) e vice versa (B). IFNα - 2C foi utilizado como antígeno. Captura de diferentes concentrações de anticorpos, bem como relações de biotina: anticorpo (B:A) também foram testadas para ambas as configurações. Saturação (Sat). Laranja: Valores AEB que foram usados para cálculo de LOD; essas concentrações foram consideradas em branco como os valores AEB manteve-se estável. LOD foi calculado como dizer em branco + 3SD. clique aqui para baixar este arquivo.

Suplementares tabela 2: teste da configuração do passo 3-2 vs. As configurações de etapa 2 e 3 - foram avaliadas usando IFNα - 2C como antígeno. Valores AEB também como sinal/fundo rações (S/B) são mostradas para ambas as condições. Clique aqui para baixar este arquivo.

Suplementares tabela 3: otimização de concentração Detector e SBG. Três diferentes concentrações de biotinilado detector (0,1, 0,3 e 0,6 µ g/mL) em conjunto com três diferentes concentrações da SBG (50, 150 e 250 pM) foram avaliados. AEB valores são mostrados para as nove condições testadas. Laranja: Valores AEB que foram usados para cálculo de LOD; essas concentrações foram consideradas em branco como os valores AEB manteve-se estável. LOD foi calculado como dizer em branco + 3SD. clique aqui para baixar este arquivo.

Suplementares tabela 4: especificidade e sensibilidade do ensaio de matriz de molécula do IFNα otimizado. Enzima média por valores de grânulos são mostrados quando IFN-β, IFN-λ1, λ2-IFN, IFN-ω e IFN-γ proteínas recombinantes foram testaram (A), juntamente com os 16 subtipos de IFN-α (B). «-» Não determinado. Clique aqui para baixar este arquivo.

Suplementares tabela 5: reprodutibilidade do otimizado IFNα única molécula matriz ensaio. Os valores médios da AEB para todas as três corridas independentes são mostrados para uma concentração de 10.000 fg/mL. «-» Não determinado. Saturação (Sat). Clique aqui para baixar este arquivo.

Suplementares tabela 6: ensaio de competição de proteína. Enzima média por grânulos, os valores são mostrados para todas as condições testadas. As medições foram feitas em duplicado. Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

Aqui, descrevemos o desenvolvimento e validação de uma molécula altamente reprodutível, ultra-sensível matriz digital ELISA para quantificação directa da proteína IFN-α em amostras humanas (passos resumidos na tabela 1). Um dos passos mais importantes no desenvolvimento do ensaio é a escolha do par anticorpo16, com as características em termos de cinética e vinculação epítopo, sendo a chave para um ensaio bem sucedido. É importante evitar o uso de emparelhados anticorpos monoclonais que destino o mesmo epítopo ou que causam impedimento estérico. Anticorpos policlonais poderiam ser usados como anticorpos de deteção para superar tais limitações. Se em qualquer etapa dada a sensibilidade desejada não for atingida, mais possibilidades de otimização devem ser consideradas. Isto pode incluir o uso de pares de anticorpo alternativos, alterações em parâmetros como tipo de proteína (por exemplo, BSA < caseína), pH (6.0-8.5), força iônica, capacidade tampão (por exemplo, concentrações de NaCl e fosfato), grânulos de transportadora e/ou presença de surfactantes. Uma vasta gama de parâmetros con ser otimizado ao desenvolver um ensaio de matriz única molécula. No entanto, em geral, condições que dão sinal: fundo elevado rácios e mínimos LODs são os preferidos (veja a Figura 3, Figura 1e Figura 2).

Em relação a especificidade, o ensaio de IFN-α mostrou nenhuma reactividade cruzada para qualquer outros IFNs testado (β, γ, λ1, λ2, ω) (figura 4a) e foi capaz de detectar todos os 13 subtipos de IFN-α (figura 4b). No entanto, o ensaio mostrou uma menor afinidade para o subtipo de IFN-α2, (figura 4b e complementar a tabela 4). Curiosamente, sensibilidades diferentes para as diferentes classes de IFN-α2 (a, b, c) foram também observadas, que pode ser devido a processos de fabrico distintas ou sequências de aminoácidos diferentes, como os subtipos de IFN-α2 foram obtidos de diferente comercial fornecedores. Com esta única exceção, todas as espécies de IFN-α deram respostas muito semelhantes. A especificidade do ensaio demonstrou-se ainda mais pelo pré-tratamento das amostras com o anti-IFN-α um clone, que revogada o sinal (Figura 6 e complementar o quadro 6).

Uma das principais vantagens desta tecnologia é que qualquer analito de interesse pode ser potencialmente alvo16. Além disso, diferentes espécimes biológicos podem ser testados, tais como soro, plasma, líquido cefalorraquidiano, lisados celulares, cultura sobrenadantes31 e sequer respirar32. Normalmente, uma diluição de 1:3 do plasma é realizada para evitar entupimento potencial do analisador matriz única molécula. No entanto, o analito de interesse poderia estar presente em concentrações muito baixas na amostra biológica relevante e concentrações mais altas de amostra podem ser necessário (dependendo da sensibilidade do ensaio)33. Apesar de existir a possibilidade de multiplexação, mantendo boa sensibilidade34, é um processo desafiador e ensaios para medição superior a 6 proteínas dentro das mesmas experiências têm ainda de ser desenvolvido35.

A capacidade de detectar e quantificar a citocinas e outras proteínas biológicas relevantes em tão baixas concentrações abre uma nova gama de aplicações33,36. É sabido que inúmeras proteínas exercem seus efeitos mesmo em concentrações muito baixas, o que até agora estavam abaixo do limite de detecção da melhor ELISAs37. Enquanto outras tecnologias de imunoensaio oferecem vantagens sobre convencional ELISA19, demonstramos aqui que única molécula matriz digital ELISA é uma plataforma robusta e reprodutível para a detecção ultra-sensível de baixa concentração de citocinas em amostras humanas. Como tal, esta tecnologia oferece um enorme potencial para a descoberta de biomarker e melhor gestão paciente de uma vasta gama de doenças.

Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

DD e YJC reconhece apoio da ANR (projeto IFNX, não. CE17001002) e ImmunoQure AG para fornecimento de anticorpos monoclonais. Agradecemos a Brigitte Bader-Meunier, Nathalia Bellon, Christine Bodemer, Alex Belot, Isabelle Melki e Pierre Quartier para fornecer amostras clínicas. YJC reconhece o Conselho Europeu de investigação (GA 309449: Fellowship para YJC) e um subsídio de estado gerenciado pela Agência Nacional de pesquisa (França), no âmbito do programa "Os investimentos para o futuro", tendo a referência ANR-10-IAHU-01.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Anti-IFN-α antibody A (8H1 clone)ImmunoQure AGNANot commercially available
Anti-IFN-α antibody B (12H5 clone)ImmunoQure AGNANot commercially available
Anti-IFN-α antibody EBI-1 cloneeBioscienceBMS216C
Anti-IFN-α antibody BMS216BK cloneeBioscienceBMS216BKNot an ELISA kit but bulk abs
IFN α2ceBioscienceBMS305OK
IFN αI (17)PBL11150-1
IFN α2aPBL11100-1
IFN α2aPeproTechNo longer available
IFN α2bPBL11105-1
IFN α1PBL11175-1
IFN α4a (M1)PBL11177-1
IFN α4b (a4)PBL11180-1
IFN αB2 (a8)PBL11115-1
IFN αC (a10)PBL11120-1
IFN αD (a1)PBL11125-1
IFN αG (a5)PBL11135-1
IFN αF (a21)PBL11130-1
IFN αH2 (a14)PBL11145-1
IFN αJ1 (a7)PBL11160-1
IFN αK (a6)PBL11165-1
IFN αWA (a16)PBL11190-1
IFN λ1PeproTech300-02L
IFN λ2PeproTech300-02K
IFN ωPeproTech300-02J
IFN βPeproTech300-02BC
IFN γPeproTech300-02
Anti-IFN-α ELISAPBL41115.1
96-well platesCorning3904
ISRE-ReporterQiagenCCS-008L
Fu-GENE HD Transfection ReagentPromegaE2311
Opti-MEM Reduced Serum MediuemThermoFischer Scientific31985062
Dual-Luciferase Reporter assayPromegaE1910
Nonidet P40 SubstituteSigma-Aldrich74385
Spectrophotometer NanoDrop 1000Thermo ScientificNo longer available
Amicon micocentrifuge tubes - 0.5mL filtresMerck MilliporeUFC505096
Bead Conjugation BufferQuanterix102040Can not be ordered separately
Non-Encoded Paramagnetic BeadsQuanterix101360
Bead Wash BufferQuanterix102040Can not be ordered separately
EDCFisher Scientific11844071
Bead Blocking BufferQuanterix102040Can not be ordered separately
Bead Diluent BufferQuanterix101362
Detector and Sample DiluentQuanterix101359
Biotinylation Reaction BufferQuanterix102040Can not be ordered separately
NHS-PEG4-BiotinFisher Scientific11891195
diH2O
Centrifuge for 1.7mL microcentrifuge tubes (Heraens Fresco 21 Centrifuge)Thermo Scientific75002478
Standard laboratory vortex mixer (MS2 Minishaker)IKAMS2
Pipettes (10, 20, 200 and 1000 μl)Thermo Scientific
Tips (10, 20, 200 and 1000 μl)Thermo Scientific
1.7mL microcentrifuge tubesEppendorf
Magnetic separator that accomodates 1.7mL microcentrifuge tubes (Life Technologies DynaMag-2)ThermoFisher Scientific12321D
Mini benchtop centrifuge (Galaxy MinisStar)VWR521-2844
Mixer/Shaker (Eppendorf Thermomixer Comfort)Eppendorf
Single molecule array (Simoa) reagents
SBG, Bead and Detector Barcode LabelsQuanterix101652
15 mL Reagent BottlesQuanterix102411
Simoa specimen 96-well platesQuanterix101457
Simoa DiscsQuanterix100001
Simoa 2.0 conductive TipsQuanterix101726
Simoa CuvettesQuanterix100803
Simoa SBG ReagentQuanterix102295
Simoa RGP ReagentQuanterix101736
Simoa System Buffer 1Quanterix100486
Simoa System Buffer 2Quanterix100487
Sealing OilQuanterix100206
ddH2O
Simoa HD-1 AnalyzerQuanterix100032
Technologies
Single molecule array (Simoa)Quanterix
Single molecule counting Erenna Immunoassay SystemsSingluex

Referências

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