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要約

ここでは、ラット脳微小血管の分離膜試料の調製の方法を説明します。このプロトコルには、個々 の動物から得られる許容可能なタンパク質試料濃縮微小血管を生産の明確な利点があります。サンプルは、脳微小血管内皮細胞で堅牢なタンパク質解析に使用できます。

要約

血液脳関門 (BBB) は、様々 な病態生理学的および薬理学的刺激に応答する動的なバリア組織です。これらの刺激の結果としてそのような変更大幅脳への薬物送達を調節でき、延長によって、病気の原因のかなりの挑戦中枢神経系の治療に (CNS)。薬物治療学に影響を与える多くの BBB 変更は、ローカライズは、内皮細胞のレベルで表現するタンパク質を含みます。確かに、健康および病気の BBB の生理学的な知識は、これらの膜タンパク質の研究に大きな関心を呼んでいます。基本的な科学研究の観点から、これは単純なが堅牢で再現性のある実験動物から採取した脳組織から血管の分離法のための要件を意味します。新鮮単離血管から膜サンプルを準備するためにサンプル準備が血管内皮細胞に富むが、単位 (すなわち、アストロ サイト、ミクログリア、ニューロンの他の細胞型の存在下で限定が肝要です。ペリサイト)。付加的な利点は、個々 の動物から実験群におけるタンパク質発現の真の変動を捕捉するためにサンプルを準備する機能です。本稿では、ラット脳微小血管の分離と膜試料の調製に利用されるメソッドに関する詳細情報が提供されます。派生した、サンプルの微小血管濃縮サンプル バッファーのデキストランをふくむ 4 遠心分離手順を使用して実現されます。このプロトコルは、特定のアプリケーションの他の所で簡単に対応できます。生理学的、病態生理学的、および薬理学的刺激への BBB 対応の理解を助けることができる大きくタンパク質解析実験から堅牢な実験データを生成するため、このプロトコルから生成されるサンプルを示されています。

概要

血液脳関門 (BBB) は、中枢神経系 (CNS) と全身循環間のインターフェイスに存在して、脳のホメオスタシスの維持に重要な役割を果たしています。具体的には、正確にコントロール溶質濃度1中枢神経系のかなり代謝要求を満たすために脳組織に必要なこれらの栄養素を効率よく供給して脳細胞外液中に BBB の機能。これらの役割は、微小血管内皮細胞のレベルに主に存在する、BBB は脳実質に潜在的に有害物質ができませんを確保しながらアクセスするいくつかの物質を有効に離散のメカニズムを持つ必要がありますを意味します。蓄積されます。確かに、脳微小血管内皮細胞は穴あきではなく、非選択的透過性2の欠如を保証する限られた pinocytosis を展示します。脳微小血管内皮細胞が物理的な隣接する血管内皮細胞間の「封印」と大きく脳に血液媒介物質の傍細胞拡散を制限するフォームに動作するタイトのジャンクションと adherens ジャンクション蛋白質を表現するさらに、実質。確かに、内因性および外因性物質の選択的な透磁率は、吸収と排出トランスポーター3の機能発現を必要とします。全体的に、タイトな接合、アドヘレンスジャンクション、トランスポーターは、BBB のユニークなバリア性を維持するためにコンサートで動作します。

BBB は生理学的、病態生理学的、および薬理学的刺激に応答する動的な障壁であります。たとえば、低酸素/再酸素化ストレスの増加傍細胞透過性このような血管マーカーに関連付けられている (すなわち、オクルディン、ギャップ occluden 1 (ZO-1))、重要なタイト結合タンパク質の発現を調節するのに示されています。ショ糖4,5,6。外傷性脳損傷7末梢炎症性疼痛8,9設定で bbb と同様の観測が行われました。これらの同じ病気の BBB10、11,12,13,14トランスポート メカニズムを調節することがまた。確かに、低酸素/再酸素化障害を高める有機アニオン輸送ポリペプチド 1a4 の機能発現 (Oatp1a4)、BBB でつながることができる特定ファミリートランスポーターの輸送基質の血液-脳輸送に大幅に増加するなどタウロコール酸とアトルバスタチンとの13。薬物療法自体は、脳の薬の効果の両方の深遠な変更および薬物-薬物相互作用の基礎を形成することができますメカニズムによって BBB プロパティを変更することも。たとえば、脳微小血管内皮細胞におけるアセトアミノフェン ターゲット核内受容体シグナル機構重要な排出トランスポーター P 糖タンパク質 (P ・ gp) の発現を増加し、時間依存性鎮痛を変更オピオイド鎮痛薬と確立された P gp は輸送基板15モルヒネによって与えられました。BBB の変更、病気や薬によって誘発されることができますの徹底的な理解は、これらの変更を制御する特定の規制メカニズムの同定と解析にも必要です。確かに、離散のシグナル伝達経路はタイト結合蛋白質16,17 , トランスポーター15,の分子の発現を制御する脳微小血管内皮細胞で確認されている18,19。一緒に取られて、これらの観察は、複雑な分子経路が健康および病気のトランスポーターの BBB のタイトな接合の規制に関与していることを示します。

BBB の研究で重要な課題は、微小血管に由来する実験動物及びその後膜サンプルの脳組織からの分離のためのシンプルで効果的なメソッドの絶対要件です。これらのサンプルは、脳微小血管内皮細胞の濃縮し、他の細胞型の存在の限定、両方準備されなければなりません。過去数年間、齧歯動物の脳から血管の隔離のための複数の方法論は、科学文献13,20,21,22で報告されています。ここでは、シンプルで堅牢な再現可能な方法ラット脳から微小血管の分離および蛋白質の表現の分析に使用することができます内皮膜濃縮試料の調製をについて説明します。この微小血管の隔離のプロトコルの利点は、個々 の実験動物から十分な蛋白質収量と高品質のサンプル準備を取得する機能です。これにより、間動物可変性蛋白質の表現の検討。このプロトコルのような進歩は、BBB で蛋白質の変更の本当の大きさの推定過剰 (または過少評価) を回避できますので BBB 研究の堅牢性を大幅に改善が。また、デキストランの遠心分離手順で複数の包含は、ニューロンなど不要な細胞成分の除去を促進しながら実験サンプルの微小血管についての改良濃縮できます。

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プロトコル

下記すべての手続機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) によって承認されているし、国立衛生研究所 (NIH) と動物研究に準拠: In Vivo実験 (到着) ガイドラインを報告します。プロトコルの手順のフローは、図 1に描かれています。

1. セットアップ手順について

  1. 脳微小血管バッファー (BMB) を準備します。54.66 g D-マンニトール、1.90 g グリコールエーテルジアミン四酢酸、および 1.46 g 2-amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol (すなわち、トリス) ベースをきれいなビーカーに計量して起動します。1.0 L の脱イオン水を追加します。磁性攪拌器を使用して BMB バッファーのコンポーネントをミックスします。ソリューションが完全に混合されて、一度 7.4 1.0 M HCl を使用してに pH を調整します。
  2. 動物の麻酔前に 26% デキストラン (75,000 MW) ソリューション (w/v) を準備します。次の手順で説明するように、デキストラン ソリューションを準備します。
    注: それがデキストランは緩衝水溶液で分解する約 1.5-2 時間を取ることができるので、早めにこのソリューションを準備する重要です。
    1. きれいなビーカーに粉末デキストラン (100 mL バッファーあたり 26 g) を重量を量る。
    2. BMB の適切な量を測定し、独立した、きれいなビーカーに分注します。
    3. BMB を粉末デキストランを含むビーカーにゆっくりと注ぐ。手動で BMB ガラス攪拌棒を使用しての注入中に粉末のデキストランをミックスします。
    4. 使用してすぐに前 1.0 M HCl で 7.4 に pH を調整します。
      注: 12 個別 Sprague-dawley ラット脳微小血管の典型的な分離 (男性または女性; 生後 3 か月; 200-250 g 各) デキストラン溶液 (すなわち、BMB の 200 mL で 52 g デキストラン) 200 mL が必要です。

2. ラット脳組織の抽出

  1. (50 mg/kg; 2.5 mL/kg i. p.) ケタミン ・ キシラジンを使用してラットの麻酔希望の実験的治療 (10 mg/mL; 2.5 mL/kg I、p.)。それぞれケタミン ・ キシラジンの 20 mg/mL と 4.0 mg/mL の最終濃度 0.9% 生理食塩水で希釈します。斬罪に IACUC ガイドラインに従って削ったギロチンを使用して動物を安楽死します。男性と女性の両方の Sprague-dawley ラットの同じ手順を使用します。
  2. 外科はさみを使用して単一横カットすることによってラット頭蓋骨から皮膚を切除します。
  3. Rongeurs を使用して、慎重に頭蓋骨プレートを削除し、脳を公開します。
  4. ヘラを使って脳を削除します。大脳を外し、BMB の 5 mL を含む 50 mL の円錐管に隔離した脳細胞の場所します。プロテアーゼ阻害剤を使用する前にすぐに BMB のバッファーの 1.0 mL あたりカクテルの 1.0 μ L を追加します。

3. 脳処理

  1. きれいなペトリ皿に 50 mL の円錐管から脳組織を転送します。
  2. 12.5 cm 径フィルター紙上大脳皮質に接着された疎外髄膜を削除する脳をロールバック鉗子を使用して、優しく。優しくフィルター ペーパーに対して脳組織を押しながら再び組織のロールします。この手順中に頻繁にろ紙をオンにします。
  3. 鉗子による大脳半球から脈絡叢を区切ります。
    注: 脈絡叢は、大脳の脳室の表面にローカライズされた明確な膜質の組織として表示されます。
  4. 優しく脳組織を平らにし、残りの髄膜と鉗子による嗅球を削除します。
  5. 冷えたグラスのモルタルに皮質の脳組織を配置します。モルタルに BMB 含むプロテアーゼ阻害剤カクテルの 5.0 mL を追加します。
  6. 頭上式の電力ホモジナイザーを使用して、3,700 rpm ストローク上下 15 を使用して脳組織をホモジナイズしてください。10 mL の乳鉢と乳棒組織グラインダーを使用して均質化を実行します。それぞれの個々 のサンプルの均質化、間 70% のエタノールを使用して杵をクリーンアップします。
    注: 均質化ペースの面で一貫しているべきストロークと大きさ。
  7. ラベル付き遠沈管に磨砕液を注ぐ。

4. 遠心分離の手順

  1. 脳のホモジネートを含む各ラベル付き遠心管に 26% デキストラン溶液 8.0 mL を追加します。
  2. 2 回チューブを反転し、徹底的に渦サンプル。脳ホモジネート液の 26% デキストランの徹底的な混合できるように複数のアングルを使用して各サンプルのボルテックスを実施します。
  3. 4 ° C で 15 分間 5,000 × gで遠心分離機サンプル
    注: いくつかの分析に便利です脳実質、脳微小循環を比較します。脳実質におけるタンパク質発現の評価すべき必要、この遠心分離のステップ (すなわち、脳実質分数) から清収集でき将来の使用に備えて-80 ° C で保存します。
  4. 真空吸引装置を使用して上清を除去し、パスツール ピペットをガラスです。
    注: ペレットを邪魔しないように注意する必要があります。そうでなければ、その大幅このプロシージャから蛋白質収量を低下させるが、収集した脳微小循環の量が削減されます。
  5. BMB 含むプロテアーゼ阻害剤のカクテル (すなわち、1.0 μ L プロテアーゼ抑制剤のカクテル BMB バッファーの 1.0 mL あたり) 5.0 mL にペレットを再懸濁します。渦ように徹底した混合ペレット。
  6. 各遠心管と渦このプロトコルの手順 4.1 4.2 で説明されているように 26% デキストランの 8.0 mL を追加します。
  7. 4 ° C で 15 分間 5,000 × gで遠心分離機サンプル
  8. 真空フラスコ、ガラス ピペットを使用して、上清を吸引、脳微小血管を含むそのペレットが中断されないことを確認します。
    注: 管壁に付着した余分な材料微小血管が含まれていないとする必要がありますが丁寧に掃除して削除します。
  9. 手順 4.5 4.8 追加を 2 回。
  10. 一度 4 デキストラン遠心分離手順が完了、各ペレットとサンプルを再懸濁しますに渦に BMB の 5.0 mL を追加します。
    注: 4.10 のステップが完了した後、タンパク質局在の解析の全体の微小血管を収集できます。これは、再浮遊微小ペレットの分注 50 μ L を取り、ガラス顕微鏡スライドの上に塗りつけによって実現できます。微小血管が冷たいエタノールで固定後に追加 10 分スライドは 4 ° c までのイメージングに必要な格納できる暖房のブロック上で 10 分間 95 ° C で熱固定になります。

5. 遠心合計脳微小血管膜のサンプルを準備するには

  1. 冷えたグラス ホモジナイザーにサンプルを転送します。
  2. 頭上式の電力ホモジナイザーを使用して、3,000 rpm で 8-10 上下のストロークを使用して脳組織をホモジナイズしてください。均質化は、10 mL の乳鉢と乳棒組織グラインダーを使用して行われています。次のそれぞれの個別のサンプルの均質化 70% エタノールを使用して杵をクリーンアップします。
  3. 超遠心機チューブをきれいにするサンプルを転送します。数し、それぞれの個々 のチューブの重量を量る。超遠心機のローターに読み込む前にチューブのペアし、のバランスします。
    注: すべての重さと遠心チューブの組み合わせ実施しなければならないキャップと上管重量の正確な測定を確保します。
  4. 4 ° C で 1 時間 150,000 × gで遠心分離機サンプル
  5. 上清を吸引真空フラスコとガラス パスツール ピペットを使用して中空糸膜ペレットを妨害しないように気を使っています。
  6. ペレットのサイズに基づいては脱イオン水と BMB の 1:1 (v/v) 比で構成されるストレージ バッファーの適切なボリュームを追加します。通常、ペレットはストレージ バッファーの 400-500 μ L で再停止されます。プロテアーゼ阻害剤カクテルをストレージ バッファーの 1.0 mL あたり 1.0 μ L の割合でストレージ バッファーに追加します。
  7. 渦サンプル ストレージ バッファーでペレットを再懸濁します。
  8. ガラス パスツール ピペットを使用すると、ラベル付きの 1.5 mL 遠心チューブに中空糸膜サンプルを転送します。
  9. 針を通して渡すサンプルは、サンプルが完全に混合し、細胞凝集体が存在しないことを確保するため 5 x を注射器します。
  10. -80 ° c まで解析に必要なサンプルを格納します。
    注: 各微小血管膜サンプルのタンパク質含量は、ブラッドフォード法を使って測定します。

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結果

ラット脳微小血管の分離と微小血管膜試料の準備のための実験の流れは図 1に示します。ここに示す手順を使用して、ラットの脳からそのまま微小血管の正常な分離を示す (図 2 a)。これらの血管は、デキストランと膜サンプル (すなわち、完了ステップ 4.10) を準備する遠心を開始する前にすぐに遠心分離が完了できた。こ?...

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ディスカッション

この記事では新鮮なラット脳組織から分離された微小血管からの膜蛋白質のサンプルの準備のシンプルで効果的な方法を説明します。文献13,20,21,22で孤立した血管からラット脳微小血管の分離および/または膜の準備世代のためのいくつかの方法が報告されています。,24. ...

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開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

この作品は、PTR に健康の国民の協会 (R01 NS084941)、(ADHS16-162406) アリゾナ州医学研究委員会からの補助金によって支えられました。ワシントン州は、過去の国家機関の健康研修助成金 (T32 HL007249) 博士前期予定からサポート受けています。

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資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Protease Inhibitor CocktailSigma-Aldrich#P8340Component of brain microvessel buffer
D-mannitolSigma-Aldrich#M4125Component of brain microvessel buffer
EGTASigma-Aldrich#E3889Component of brain microvessel buffer
Trizma BaseSigma-Aldrich#T1503Component of brain microvessel buffer
Dextran (MW 75,000)Spectrum Chemical Mftg Corp#DE125Dextran used in centrifugation steps to separate microvessels from brain parenchyma
ZetamineMWI Animal Health#501072General anesthetic
XylazineWestern Medical Supply#5530General anesthetic
0.9% saline solutionWestern Medical SupplyN/AGeneral anesthetic diluent
Filter Paper (12.5 cm diameter)VWR#28320-100Used for removal of meninges from brain tissue
Centrifuge TubesSarstedt#60.540.386Disposable tubes used for dextran centrifugation steps
Pierce™ Coomassie Plus (Bradford) AssayThermoFisher Scientific#23236Measurement of protein concentration in membrane preparations
Wheaton Overhead Power HomogenizerDWK Life Sciences#903475Required for homogenization of samples
10.0ml glass mortar and pestle tissue grinderDWK Life Sciences#358039Required for homogenization of samples
Hydrochloric AcidSigma-Aldrich#H1758Required for pH adjustment of buffers
Bovine Serum AlbuminThermoFisher Scientific#23210Protein standard for Bradford Assay
Standard ForcepsFine Science Tools#91100-12Used for dissection of brain tissue
Friedman-Pearson RongeursFine Science Tools#16020-14Used for opening skull to isolate brain
50 ml conical centrifuge tubesThermoFisher Scientific#352070Used for collection of brain tissue following isolation
Glass Pasteur PipetsThermoFisher Scientific#13-678-20CUsed for aspiration of cellular debris following dextran spins
Ethanol, anhydrousSigma-Aldrich#459836Used for cleaning tissue grinder; diluted to 70% with distilled water
Ultracentrifuge tubesBeckman-Coulter#41121703Used for ultracentrifugation of samples

参考文献

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