Eine einfache und reproduzierbare Methode, Membran-Proben von frisch isolierte Ratte Gehirn Mikrogefäßen vorzubereiten

Zusammenfassung

Hier wird eine Methode zur Isolierung der Ratte Gehirn mikrogefäßen und für die Vorbereitung der Membran Proben beschrieben. Dieses Protokoll hat den klaren Vorteil zur Herstellung von angereichertem kapilläre Proben mit akzeptablen Protein von einzelnen Tieren ergeben. Proben können dann für robuste Protein Analysen auf das Gehirn mikrovaskulären Endothel verwendet werden.

Zusammenfassung

Die Blut - Hirn-Schranke (BBB) ist eine dynamische Barriere-Gewebe, die auf verschiedenen pathophysiologischen und pharmakologische Reize reagiert. Solche Veränderungen, die durch diese Reize können stark modulieren Drug-Delivery zum Gehirn und durch Verlängerung, erhebliche Herausforderungen bei der Behandlung des zentralen Nervensystems (ZNS) Krankheiten verursachen. Viele BBB-Veränderungen, die Pharmakotherapie, beeinflussen beinhalten Proteine, die lokalisiert und auf der Ebene der Endothelzellen ausgedrückt. In der Tat hat dieses Wissen über die Physiologie der BBB in Gesundheit und Krankheit erhebliches Interesse an der Erforschung dieser Membran Proteine ausgelöst. Aus Sicht der wissenschaftlichen Grundlagen-Forschung bedeutet dies eine Anforderung für eine einfache, aber robuste und reproduzierbare Methode zur Isolierung von mikrogefäßen aus Hirngewebe von Versuchstieren geerntet. Um Membran Proben aus frisch isolierte mikrogefäßen vorzubereiten, ist es wichtig, dass Probe Vorbereitungen in Endothelzellen bereichert aber in Gegenwart von anderen Zelltypen der Neurovaskuläre Einheit (z.B. Astrozyten, Mikroglia, Neuronen begrenzt, perizyten). Ein weiterer Vorteil ist die Fähigkeit, Proben von einzelnen Tieren vorzubereiten, um die wahre Variabilität der Proteinexpression in einer experimentellen Bevölkerung zu erfassen. In dieser Handschrift sind Einzelheiten über eine Methode, die verwendet wird für die Isolierung der Ratte Gehirn mikrogefäßen und Vorbereitung der Membran-Proben zur Verfügung gestellt. Kapilläre Anreicherung von Proben abgeleitet, ist erreicht, indem vier Zentrifugation Schritte wo Dextran in den Probenpuffer aufgenommen. Dieses Protokoll kann leicht durch andere Labore für ihre eigenen spezifischen Anwendungen angepasst werden. Proben aus diesem Protokoll generiert wurden gezeigt, robuste Versuchsdaten aus Protein-Analyse Experimente liefern, die das Verständnis der BBB Reaktionen auf physiologische und pathophysiologische pharmakologische Reize sehr helfen können.

Einleitung

Die Blut - Hirn-Schranke (BBB) ist an der Schnittstelle zwischen dem zentralen Nervensystem (ZNS) und die systemische Zirkulation vorhanden und spielt eine wesentliche Rolle bei der Aufrechterhaltung der Homöostase des Gehirns. Insbesondere die BBB-Funktionen, um präzise Kontrolle gelösten Konzentrationen im Gehirn extrazellulären Flüssigkeit und effizient diese Nährstoffe liefern, die von Hirngewebe benötigt werden, um die erheblichen metabolischen Anforderungen der CNS¹zu erfüllen. Diese Rollen implizieren, dass die BBB, die in erster Linie auf der Ebene der mikrovaskuläre Endothelzellen existiert, diskrete Mechanismen besitzen muss, die es einige Substanzen in Anwesenheit von ermöglichen gleichzeitig sicherstellen, dass potenziell schädliche XENOBIOTIKA können nicht zugreifen akkumulieren. In der Tat Gehirn mikrovaskuläre Endothelzellen sind nicht gefenstert und begrenzten Pinozytose, sorgt für einen Mangel an nicht-selektive Durchlässigkeit²weisen. Darüber hinaus äußern Gehirn kapilläre Endothelzellen engen Kreuzung und Adherens Junction Proteine, die handeln in Form eine körperlichen "Siegel" zwischen benachbarten endothelial Zellen und parazellulär Diffusion von Blut übertragbare Substanzen ins Gehirn stark einschränken Parenchym. In der Tat erfordert selektive Durchlässigkeit der endogene und exogene Stoffe funktionelle Expression von Aufnahme und Efflux-Transporter³. Insgesamt, engen Kreuzungen, Adherens Junctions und Transportern arbeiten gemeinsam, um die einzigartige Barriereeigenschaften der BBB zu pflegen.

Die BBB ist eine dynamische Barriere, die auf physiologischen, pathophysiologischen und pharmakologische Reize reagiert. Z. B. Hypoxie/flussbettfilters Stress erwiesenermaßen modulieren Ausdruck der kritischen tight Junction-Proteine (z.B. occludin, Zonulae Occluden-1 (ZO-1)), die erhöhte parazellulär Durchlässigkeit für solche vaskuläre Marker zugeordnet ist als Saccharose^4,5,6. Ähnliche Beobachtungen wurden an der BBB in der Umgebung von Schädel-Hirn-Verletzung-⁷ und peripheren entzündliche Schmerzen^8,9. Diese gleichen Krankheiten können auch Transportmechanismen an der BBB^{10,11,12,13,14}modulieren. In der Tat, Hypoxie/flussbettfilters Verletzungen verbessert funktionelle Expression von Bio Anion Transport Polypeptid 1a4 (Oatp1a4) an der BBB führen kann zu einem signifikanten Anstieg in der Blut-Hirn-Transport von bestimmten Oatp Transport Substrate wie Taurocholate und Atorvastatin¹³. BBB-Eigenschaften können auch durch Pharmakotherapie selbst, einen Mechanismus geändert werden, die eine Grundlage für beide tief greifende Veränderungen in der Wirksamkeit der Droge im Gehirn und Wechselwirkungen bilden können. Z.B. Paracetamol Ziele nuklearen Rezeptoren Signalisierung Mechanismen im Gehirn der mikrovaskuläre Endothelzellen, erhöht die funktionelle Expression der kritischen Efflux-Transporter P-Glykoprotein (P-Gp), und ändert zeitabhängige Analgesie Übertragen von Morphin, transportieren ein opioid-Analgetikum und etablierten P-Gp Substrat¹⁵. Ein gründliches Verständnis der BBB-Änderungen, die durch Krankheiten oder durch Drogen induziert werden kann, erfordert auch die Identifizierung und Charakterisierung der spezifischen regulatorischen Mechanismen, die diese Änderungen zu kontrollieren. In der Tat, diskrete Signalwege wurden im Gehirn mikrovaskuläre Endothelzellen, die Steuern, die molekulare Ausdruck der engen Kreuzung Proteine^16,17 und Transporter^{15, 18,19}. Zusammengenommen zeigen diese Beobachtungen, dass komplexe Molekulare Signalwege in der Verordnung von BBB tight Junctions und Transporter in Gesundheit und Krankheit beteiligt sind.

Eine große Herausforderung in der Studie der BBB ist die absolute Voraussetzung für eine einfache und effektive Methode zur Isolierung von mikrogefäßen aus Hirngewebe von Versuchstieren und anschließende Aufbereitung der Membran Proben abgeleitet. Diese Proben müssen vorbereitet werden, so dass sie sowohl im Gehirn mikrovaskuläre Endothelzellen angereichert und in Anwesenheit von anderen Zelltypen begrenzt. In den vergangenen Jahren wurden mehrere Methoden zur Isolierung von Microvasculature von Nagetier Gehirn in der wissenschaftlichen Literatur^13,20,21,22beschrieben. Dieser Artikel beschreibt eine einfache, robuste, und reproduzierbare Methode zur Isolierung von mikrogefäßen aus rattengehirn und zur Vorbereitung von endothelialen Membran angereicherten Proben, die für die Analyse der Proteinexpression verwendet werden können. Vorteil dieses Protokolls kapilläre Isolierung ist die Fähigkeit, eine einzelne Versuchstier Probe Vorbereitungen von hoher Qualität und mit ausreichend Proteinausbeute einzuholen. Dies ermöglicht die Berücksichtigung der Inter Tier Variabilität der Proteinexpression. Solch ein Fortschritt in diesem Protokoll hat die Robustheit des BBB Studien erheblich verbessert, weil Überbewertung oder Unterbewertung das wahre Ausmaß der Protein Veränderungen an der BBB jetzt vermieden werden kann. Darüber hinaus ermöglicht die Aufnahme von mehreren Schritten der Zentrifugation mit Dextran verbesserte Anreicherung von mikrogefäßen im experimentellen Proben und erleichtert die Entfernung von unerwünschten zelluläre Bestandteile wie Neuronen.

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Protokoll

Alle unten beschriebene Verfahren durch eine institutionelle Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) genehmigt worden und entsprechen den National Institutes of Health (NIH) und Animal Research: In Vivo Experimente (Ankunft) Richtlinien zum Berichten. Der verfahrenstechnische Ablauf für das Protokoll ist in Abbildung 1dargestellt.

1. Set-up für das Verfahren

1. Bereiten Sie den Gehirn kapilläre Puffer (BMB). Starten Sie durch mit einem Gewicht von 54,66 g D-Mannit, 1,90 g EGTA und 1,46 g 2-amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol (d. h. Tris) Basis in ein sauberes Becherglas. 1,0 L entionisiertem Wasser hinzufügen. Mischen Sie die Komponenten des Puffers BMB mit einem Magnetrührer. Sobald die Lösung gründlich vermischt worden ist, passen Sie den pH auf 7,4 mit 1,0 M HCl.
2. Bereiten Sie 26 % Dextran (75.000 MW) Lösung (w/V) vor der Tiere zu betäuben. Bereiten Sie die Dextran-Lösung, wie in den folgenden Schritten beschrieben.
   Hinweis: Es ist von entscheidender Bedeutung, diese Lösung vor der Zeit vorzubereiten, da Dextran aufzulösen in wässrigen Puffer ca. 1,5-2 h dauern kann.
   1. Die pulverförmigen Dextran (26 g pro 100 mL Puffer) in ein sauberes Becherglas abwiegen.
   2. Das entsprechende Volumen der BMB abmessen und in eine separate, sauberes Becherglas zu verzichten.
   3. Gießen Sie langsam BMB in das Becherglas mit pulverförmigen Dextran. Manuell mischen Sie die pulverisierte Dextran in Gießen von BMB mit einem Glasstab umrühren.
   4. Anpassen des pH-Werts 7,4 mit 1,0 M HCl unmittelbar vor, zu verwenden.
      Hinweis: Eine typische Isolation des Gehirns mikrogefäßen aus 12 einzelnen Sprague-Dawley Ratten (männlich oder weiblich; 3 Monate alt, 200-250 g) 200 mL Dextran-Lösung (d. h. 52 g Dextran in 200 mL BMB) erfordert.

2. Gewinnung von Hirngewebe aus Sprague-Dawley Ratten

1. Nach der gewünschten experimentelle Behandlung betäuben Sprague-Dawley Ratten mit Ketamin (50 mg/kg; 2,5 mL/kg kg i.p.) und Xylazin (10 mg/mL; 2,5 mL/kg I, p.). Verdünnen Sie Ketamin und Xylazin in 0,9 % Kochsalzlösung zur endgültigen Konzentrationen von 20 mg/mL und 4,0 mg/mL bzw.. Einschläfern von Tieren durch Enthauptung mit einem geschärften Guillotine nach IACUC Richtlinien. Verwenden Sie das gleiche Verfahren für sowohl weibliche als auch männliche Sprague-Dawley Ratten.
2. Resezieren Sie die Haut von der Ratte-Schädel mit einem quer-Schnitt mit einer chirurgischen Schere.
3. Mit Rongeurs, sorgfältig entfernen Sie die schädelplatte und setzen Sie des Gehirns aus.
4. Entfernen Sie das Gehirn mit einem Spachtel. Lösen Sie das Großhirn und legen Sie das isolierte Hirngewebe in ein 50 mL konische Röhrchen mit 5 mL der BMB. Fügen Sie 1,0 μL der Protease-Inhibitor cocktail pro 1,0 mL BMB Puffer unmittelbar vor Gebrauch.

(3) Gehirn Verarbeitung

1. Übertragen Sie das Hirngewebe aus dem 50 mL konische Röhrchen auf eine saubere Petrischale.
2. Rollen Sie mit Pinzette, vorsichtig das Gehirn auf 12,5 cm Durchmesser Filterpapier äußeren Hirnhaut zu entfernen, die Lose der Großhirnrinde eingehalten werden. Sanft drücken Sie das Hirngewebe gegen Filterpapier und Rollen Sie das Gewebe wieder. Schalten Sie das Filterpapier häufig während dieser Schritt.
3. Der zerebralen Hemisphären mit Pinzette trennen Sie choroid Plexus.
   Hinweis: Das choroid Plexus erscheint als eine klare häutigen Gewebe an die Oberfläche der zerebralen Ventrikel lokalisiert.
4. Sanft glätten Sie das Hirngewebe und entfernen Sie verbleibenden Meningen und olfaktorischen Birnen mit Pinzette.
5. Legen Sie die kortikalen Hirngewebe in ein gekühltes Glas-Mörtel. Der Mörtel 5,0 mL BMB enthaltenden Proteaseinhibitor cocktail hinzufügen.
6. Mit einer Oberleitung Homogenisator, Homogenisieren Sie das Hirngewebe mit 15 nach oben und unten Schlaganfälle bei 3.700 u/min. Führen Sie Homogenisierung mit 10 mL Mörser und Stößel-Gewebe-Mahlwerk. Zwischen jeder einzelnen Probe Homogenisierung reinigen Sie die Stößel mit 70 % Ethanol.
   Hinweis: Homogenisierung Striche in Bezug auf Tempo entsprechen müssen und Größenordnung.
7. Gießen Sie das Homogenat in beschrifteten Zentrifuge Röhren.

4. Zentrifugation Schritte

1. Jede beschriftete Zentrifugenröhrchen mit Gehirn Homogenat fügen Sie 8,0 mL 26 % Dextran-Lösung hinzu.
2. Invertieren die Röhre zweimal und dann gründlich Wirbel der Probe. Führen Sie den Vortexen jeder Probe mit mehreren Winkeln, gewährleisten eine gute Durchmischung des Gehirns Homogenat Lösung mit 26 % Dextran-Lösung.
3. Zentrifuge Proben bei 5.000 X g für 15 min bei 4 ° C.
   Hinweis: Für einige Analysen ist es sinnvoll, Gehirn mikrogefäßen mit in Anwesenheit von vergleichen. Die Beurteilung der Proteinexpression in Anwesenheit von sein sollte kann erforderlich, überstand aus dieser Zentrifugationsschritt (z. B. Gehirn parenchymatösen Bruch) werden gesammelt und bei-80 ° C für eine spätere Verwendung gespeichert.
4. Entfernen Sie den Überstand mit einer Vakuum-Sauger und Glas Pasteurpipette.
   Hinweis: Vorsicht muss genommen werden, um die Pellets nicht zu stören. Andernfalls wird Menge an das Gehirn mikrogefäßen gesammelt die verringert deutlich der Proteinausbeute aus diesem Verfahren reduziert werden.
5. Das Pellet in 5,0 mL BMB enthaltenden Proteaseinhibitor cocktail (d. h. 1,0 μl Protease-Inhibitor cocktail pro 1,0 mL BMB Puffer) aufzuwirbeln. Wirbel der Pellet um gute Durchmischung zu gewährleisten.
6. 8,0 mL 26 % Dextran hinzu kommen jedem Zentrifugenröhrchen und Wirbel wie 4.1-4.2 dieses Protokolls beschrieben.
7. Zentrifuge Proben bei 5.000 X g für 15 min bei 4 ° C.
8. Mit einer Thermoskanne und Glaspipette, Aspirieren überstand und stellen Sie sicher, dass Pellet mit Gehirn kapilläre nicht gestört wird.
   Hinweis: Überschüssige Material, das an der Rohrwand gehalten hat mikrogefäßen nicht enthalten und sollten sorgfältig gereinigt und entfernt.
9. Wiederholen Sie Schritte 4,5 bis 4,8 eine zusätzliche zwei Mal.
10. Einmal 4 Dextran Zentrifugation Schritte abgeschlossen wurden, 5,0 mL BMB zu jeder Pellet und Wirbel um die Probe erneut hinzufügen.
    Hinweis: Nach Abschluss von Schritt 4.10, können ganze mikrogefäßen für Analyse von Protein-Lokalisierung gesammelt werden. Dies kann erreicht werden, indem man eine 50 μL aliquoten neu suspendierten kapilläre Pellet und Verschmieren auf einen Glas-Objektträger. Mikrogefäßen sind dann Hitze fixiert, bei 95 ° C für 10 min auf einem Heizblock gefolgt von Fixierung in eiskaltem Ethanol für eine zusätzliche 10 min. Rutschen dann bei 4 ° C bis zur bildgebenden Verfahren erforderlich gespeichert werden können.

5. Ultrazentrifugation, Proben von insgesamt mikrovaskuläre Hirnhäute vorzubereiten

1. Übertragen Sie Proben auf den gekühlten Glas-Homogenisator.
2. Mit einer Oberleitung Homogenisator, Homogenisieren Sie Hirngewebe mit 8-10 nach oben und unten Schlaganfälle bei 3.000 u/min. Homogenisierung erfolgt mittels einer 10 mL-Mörser und Stößel Gewebe-Schleifmaschine. Reinigen Sie den Stößel mit 70 % Ethanol nach Homogenisierung jeder einzelnen Probe.
3. Übertragen Sie Proben Ultrazentrifugen Rohre zu reinigen. Nummer und wiegen jedes einzelne Rohr. Auszugleichen und die Rohre vor der Verladung in den Ultrazentrifugen Rotor zu koppeln.
   Hinweis: Alle wiegen und Paarung von Ultrazentrifugen Rohre müssen mit den Kappen auf durchgeführt werden um genaue Messung der Röhre Gewichte zu gewährleisten.
4. Zentrifuge Proben bei 150.000 X g für 1 h bei 4 ° C.
5. Mit einer Thermoskanne und Glas Pasteurpipette, Aspirieren überstand mit sorgen die Kapillare Membran Pellet zu stören.
6. Basierend auf der Größe der Pellets, fügen Sie eine entsprechende Volumen der Puffer speichern, die im Verhältnis 1:1 (V/V) von entionisiertem Wasser und BMB besteht. Pellets sind in der Regel in 400-500 μL der Puffer speichern Nukleinsäuretablette. Der Speicher-Puffer in einem Verhältnis von 1,0 μl pro 1,0 mL Puffer speichern Protease Inhibitor Cocktail hinzufügen.
7. Vortex Proben zu Pellets im Puffer speichern aufzuwirbeln.
8. Mit ein Glas Pasteurpipette übertragen Sie Kapillare Membran Proben zu einem beschrifteten 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch.
9. Pass-Probe durch eine Nadel Spritze 5 X, damit die Probe gut durchmischt ist und keine zelluläre Aggregate vorhanden sind.
10. Speichern Sie die Proben bei-80 ° C bis zur Analyse erforderlich.
    Hinweis: Proteingehalt der Samples kapilläre Membran bemisst sich nach der Methode von Bradford.

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Ergebnisse

Der experimentelle Fluss zur Isolierung der Ratte Gehirn mikrogefäßen und für die Probenpräparation kapilläre Membran ist in Abbildung 1dargestellt. Bei der hier vorgestellten Verfahren erfolgreich Isolation intakt mikrogefäßen aus rattengehirn zeigt (Abbildung 2A). Diese Schiffe wurden nach Abschluss der Zentrifugation mit Dextran und unmittelbar vor Beginn der Ultrazentrifugation, Membran-Proben (d. h. nach Abschluss von...

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Diskussion

In diesem Artikel wird eine einfache und effektive Methode der Membrane Protein Probenvorbereitung von mikrogefäßen frisch von Ratte Gehirngewebe isoliert beschrieben. In der Literatur^13,20,21,22 wurden mehrere Ansätze zur Isolierung der Ratte Gehirn mikrogefäßen oder Generierung von Membran-Zubereitungen aus isolierten Microvasculature gemeldet. ^{, 24}. zw...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Protease Inhibitor Cocktail	Sigma-Aldrich	#P8340	Component of brain microvessel buffer
D-mannitol	Sigma-Aldrich	#M4125	Component of brain microvessel buffer
EGTA	Sigma-Aldrich	#E3889	Component of brain microvessel buffer
Trizma Base	Sigma-Aldrich	#T1503	Component of brain microvessel buffer
Dextran (MW 75,000)	Spectrum Chemical Mftg Corp	#DE125	Dextran used in centrifugation steps to separate microvessels from brain parenchyma
Zetamine	MWI Animal Health	#501072	General anesthetic
Xylazine	Western Medical Supply	#5530	General anesthetic
0.9% saline solution	Western Medical Supply	N/A	General anesthetic diluent
Filter Paper (12.5 cm diameter)	VWR	#28320-100	Used for removal of meninges from brain tissue
Centrifuge Tubes	Sarstedt	#60.540.386	Disposable tubes used for dextran centrifugation steps
Pierce™ Coomassie Plus (Bradford) Assay	ThermoFisher Scientific	#23236	Measurement of protein concentration in membrane preparations
Wheaton Overhead Power Homogenizer	DWK Life Sciences	#903475	Required for homogenization of samples
10.0ml glass mortar and pestle tissue grinder	DWK Life Sciences	#358039	Required for homogenization of samples
Hydrochloric Acid	Sigma-Aldrich	#H1758	Required for pH adjustment of buffers
Bovine Serum Albumin	ThermoFisher Scientific	#23210	Protein standard for Bradford Assay
Standard Forceps	Fine Science Tools	#91100-12	Used for dissection of brain tissue
Friedman-Pearson Rongeurs	Fine Science Tools	#16020-14	Used for opening skull to isolate brain
50 ml conical centrifuge tubes	ThermoFisher Scientific	#352070	Used for collection of brain tissue following isolation
Glass Pasteur Pipets	ThermoFisher Scientific	#13-678-20C	Used for aspiration of cellular debris following dextran spins
Ethanol, anhydrous	Sigma-Aldrich	#459836	Used for cleaning tissue grinder; diluted to 70% with distilled water
Ultracentrifuge tubes	Beckman-Coulter	#41121703	Used for ultracentrifugation of samples