Une méthode Simple et reproductible pour préparer les échantillons de la Membrane des microvaisseaux de cerveau de Rat fraîchement isolées

Résumé

Ici, on décrit une méthode pour l’isolement des microvaisseaux de cerveau de rat et pour la préparation des échantillons de la membrane. Ce protocole a l’avantage clair de produire des microvaisseaux enrichi échantillons avec la protéine acceptable donnent sur des animaux. Échantillons peuvent être ensuite utilisés pour les analyses de protéines robuste à l’endothélium microvasculaire cérébral.

Résumé

La barrière sang - encéphalique (BHE) est un tissu de barrière dynamique qui répond à divers stimuli physiopathologiques et pharmacologiques. Ces changements résultant de ces stimuli peuvent grandement modulent les medicaments au cerveau et, par extension, causer des problèmes considérables dans le traitement du système nerveux central (CNS) des maladies. Nombreux changements BBB qui affectent la pharmacothérapie, impliquent des protéines qui sont localisées et exprimés au niveau des cellules endothéliales. En effet, ces connaissances sur la physiologie BBB dans la santé et la maladie a suscité un intérêt considérable pour l’étude de ces protéines membranaires. Dans une perspective de recherche sciences fondamentales, cela implique une exigence pour une méthode simple mais robuste et reproductible pour isolation des microvaisseaux de tissu cérébral récolté sur des animaux de laboratoire. Afin de préparer les échantillons de la membrane des microvaisseaux fraîchement isolées, il est essentiel que les préparations être enrichies dans les cellules endothéliales mais limitées en présence d’autres types de cellules de l’unité neurovasculaire (p. ex., astrocytes, la microglie, neurones, péricytes). Un autre avantage est la possibilité de préparer les échantillons provenant d’animaux individuels afin de capturer la véritable variabilité d’expression de protéine dans une population expérimentale. Dans ce manuscrit, on trouvera des précisions concernant une méthode qui est utilisée pour l’isolement des microvaisseaux de cerveau de rat et préparation des échantillons de la membrane. Enrichissement des microvaisseaux, provenant d’échantillons dérivés, est obtenue en utilisant les quatre étapes de centrifugation à où le dextran est inclus dans la solution tampon. Ce protocole peut être facilement adapté par d’autres laboratoires pour leurs propres applications spécifiques. Échantillons produits de ce protocole ont été démontrés pour produire des données expérimentales fiables des expériences d’analyse de protéines qui peuvent grandement aider à la compréhension des réponses BBB à des stimuli physiologiques, physiopathologiques et pharmacologiques.

Introduction

La barrière sang - encéphalique (BHE) existe à l’interface entre le système nerveux central (SNC) et la circulation systémique et joue un rôle essentiel dans le maintien de l’homéostasie du cerveau. Plus précisément, les fonctions BBB précisément contrôle soluté à une concentration d’extracellulaire de cerveau pour alimenter efficacement les éléments nutritifs qui sont requis par les tissus du cerveau pour répondre aux exigences métaboliques considérables du CNS¹. Ces rôles impliquent que la BHE, qui existe principalement au niveau de la cellule endothéliale microvasculaire, doit posséder des mécanismes discrets qui permettent à certaines substances d’accéder le parenchyme du cerveau tout en s’assurant que des xénobiotiques potentiellement dangereux ne peut pas s’accumulent. En effet, les cellules endothéliales microvasculaires cérébrales ne sont pas fenêtrées et pièce limitée pinocytose, qui assure une absence de perméabilité non sélectif². En outre, les cellules endothéliales du cerveau microvaisseaux expriment les protéines serrés de jonction junction et adherens qui agissent pour former un physique « sceller » entre les cellules endothéliales adjacentes et considérablement restreindre la diffusion paracellulaire de substances véhiculées par le sang dans le cerveau parenchyme. En effet, la perméabilité sélective de substances endogènes et exogènes requiert une expression fonctionnelle de la captation et l’efflux de transporteurs³. Les jonctions dans l’ensemble, serrées, jonctions adherens et les transporteurs travaillent de concert pour maintenir les propriétés de barrière unique de la BHE.

Le BBB est une barrière dynamique qui répond à des stimuli physiologiques, physiopathologiques et pharmacologiques. Par exemple, les contraintes d’hypoxie/réoxygénation s’est avéré modulent l’expression des protéines de jonction serrée critique (c.-à-d., occludin, zonulae occluden-1 (ZO-1)), qui est associé de la perméabilité paracellulaire accrue à des marqueurs vasculaires telles comme le saccharose^4,5,6. Des observations similaires ont été faites à la BHE dans le cadre du traumatisme cérébral lésion⁷ et douleur inflammatoire périphérique^8,9. Ces mêmes maladies peuvent également moduler les mécanismes de transport à la BBB^{10,11,12,13,14}. En effet, blessure d’hypoxie/réoxygénation améliore l’expression fonctionnelle des anions organiques transportant polypeptide 1 a 4 (Oatp1a4) à la BHE, qui peut conduire à une augmentation significative dans le transport de sang-de-cerveau des substrats spécifiques de transport Oatp tels que ¹³le taurocholate et l’atorvastatine. Propriétés BBB peuvent également être modifiées par pharmacothérapie lui-même, un mécanisme qui peut former une base pour les deux changements profonds dans l’efficacité du médicament dans le cerveau et interactions médicament-médicament. Par exemple, les mécanismes de signalisation acétaminophène cibles récepteur nucléaire dans les cellules endothéliales microvasculaires du cerveau, augmente l’expression fonctionnelle efflux critique du transporteur de la P-glycoprotéine (P-gp) et modifie l’analgésie dépendant du temps conféré par la morphine, un médicament analgésique opioïde et établi P-gp transportent substrat¹⁵. Une compréhension approfondie des changements BBB, qui peut être induite par des maladies ou par des drogues, exige également l’identification et caractérisation des mécanismes réglementaires spécifiques qui contrôlent ces modifications. En effet, les voies de signalisation discrets ont été identifiés dans les cellules endothéliales microvasculaires du cerveau qui contrôlent l’expression moléculaire de jonction serrée protéines^16,17 et transporteurs^{15, 18,},¹⁹. Pris ensemble, ces observations indiquent que les voies moléculaires complexes interviennent dans la régulation des jonctions serrées de BBB et transporteurs en santé et en maladie.

Un défi important dans l’étude de la BHE est l’absolue nécessité d’une méthode simple et efficace pour l’isolation des microvaisseaux de tissu cérébral provenant d’animaux de laboratoire et préparation ultérieure des échantillons de la membrane. Ces échantillons doivent être préparés, afin qu’ils sont enrichis en cellules endothéliales microvasculaires du cerveau et limités en présence d’autres types de cellules. Au cours des dernières années, plusieurs méthodes pour l’isolement des capillaires du cerveau de rongeur ont été signalés dans la littérature scientifique^13,20,21,22. Cet article décrit une simple, robuste et la méthode reproductible pour isolation des microvaisseaux du cerveau de rat et préparation des échantillons endothéliales de membrane enrichi qui peut être utilisé pour l’analyse de l’expression de la protéine. Un avantage de ce protocole d’isolement microvaisseaux est la possibilité d’obtenir des préparations de haute qualité et avec un rendement suffisant de protéines d’un animal expérimental. Cela permet l’examen des animale variabilité dans l’expression de la protéine. Cette avance dans le présent protocole a grandement amélioré la robustesse des études BBB car surestimation ou sous-estimation de l’ampleur réelle des changements de la protéine à la BHE peut désormais être évitée. En outre, l’inclusion de plusieurs étapes de centrifugation avec dextran permet enrichissement améliorée des microvaisseaux dans des échantillons de laboratoire tout en facilitant l’élimination des constituants cellulaires indésirables tels que les neurones.

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Protocole

Toutes les procédures décrites ci-dessous ont été approuvés par un Comité de l’emploi (IACUC) et d’institutionnels animalier et sont conformes aux National Institutes of Health (NIH) et de la recherche de l’Animal : notification In Vivo des expériences (arrivée). Le flux procédural pour le protocole est représenté dans la Figure 1.

1. mise en place de la procédure

1. Préparer le tampon microvaisseaux de cerveau (BMB). Commencez par peser 54,66 g D-mannitol, 1,90 g EGTA et base de 1,46 g 2-amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol (c.-à-d., Tris) dans un bécher propre. Ajouter 1,0 L d’eau déionisée. Mélanger les composants de la mémoire tampon BMB à l’aide d’un agitateur magnétique. Une fois que la solution a été bien mélangée, ajuster le pH à 7,4 avec 1,0 M HCl.
2. Préparer la solution de dextran (MW 75 000) de 26 % (p/v) avant d’anesthésier les animaux. Préparer la solution de dextran tel que décrit dans les étapes suivantes.
   Remarque : Il est essentiel pour préparer cette solution avance car dextran peut prendre environ 1,5 à 2 h à se dissoudre dans un tampon aqueux.
   1. Peser le dextran en poudre (26 g / 100 mL de tampon) dans un bécher propre.
   2. Mesurer le volume approprié de BMB et verser dans un bécher distinct, propre.
   3. Versez lentement BMB dans le bécher contenant dextran en poudre. Mélanger manuellement le dextran en poudre pendant la coulée de BMB à l’aide d’une baguette de verre remuer.
   4. Ajuster le pH à 7,4 avec 1,0 M HCl immédiatement avant utilisation.
      Remarque : Un isolement typique des microvaisseaux de 12 des rats Sprague-Dawley (mâle ou femelle ; âge de 3 mois ; 200-250 g chacun) nécessite 200 mL de solution de dextran (c.-à-d., le dextran 52 g dans 200 mL de BMB).

2. extraction des tissus du cerveau de Rats Sprague-Dawley

1. Après le traitement expérimental désiré, anesthésier les rats Sprague-Dawley à l’aide de kétamine (50 mg/kg ; 2,5 mL/kg i.p.) et xylazine (10 mg/mL, 2,5 mL/kg I, p.). Diluer la kétamine et xylazine dans salin de 0,9 % à la concentration finale de 20 mg/mL et 4,0 mg/mL respectivement. Euthanasier les animaux par décapitation à l’aide d’une guillotine aiguisée conformément aux lignes directrices IACUC. Utilisez la même procédure pour les rats mâles et femelles Sprague-Dawley.
2. Résection de la peau du crâne de rat en faisant une coupe transversale à l’aide de ciseaux chirurgicaux.
3. À l’aide de pinces-gouges, soigneusement retirer la plaque de crâne et exposer le cerveau.
4. Enlever le cerveau à l’aide d’une spatule. Détacher le cerveau et placez le tissu cérébral isolé dans un tube conique de 50 mL contenant 5 mL de BMB. Ajouter 1,0 μL d’inhibiteur de la protéase cocktail / 1,0 mL de tampon de BMB immédiatement avant utilisation.

3. cerveau traitement

1. Transférer le tissu cérébral du tube conique 50 mL pour une boîte de Petri propre.
2. À l’aide de pinces, rouler doucement le cerveau sur 12,5 cm diamètre filtre papier pour enlever les méninges externes, qui sont respectées sans serrer le cortex cérébral. Appuyez le tissu cérébral contre le papier filtre doucement et rouler le tissu à nouveau. Tournez le papier filtre fréquemment au cours de cette étape.
3. Séparer les plexus choroïdes des hémisphères cérébraux avec une pincette.
   Remarque : Le plexus choroïde apparaît comme un tissu membraneux clairement localisé à la surface des ventricules cérébraux.
4. Délicatement, aplatir le tissu cérébral et retirer les restants des méninges et des bulbes olfactifs avec une pincette.
5. Placez le tissu de cerveau cortical dans un mortier de verre. Ajouter 5,0 mL d’inhibiteur de protéase contenant BMB cocktail au mortier.
6. À l’aide d’un homogénéisateur électriques aériennes, homogénéiser le tissu cérébral moyen 15 monter et descendre des traits à 3 700 tr/min. Effectuer l’homogénéisation à l’aide d’un broyeur de tissu 10 mL mortier et un pilon. Entre homogénéisation de chaque échantillon individuel, nettoyer le pilon à l’aide d’éthanol à 70 %.
   NOTE : Homogénéisation traits soient cohérentes en termes de rythme et l’ampleur.
7. Versez l’homogénat dans des tubes à centrifuger étiquetées.

4. étapes de centrifugation

1. Ajouter 8,0 mL de solution de dextran de 26 % dans chaque tube à centrifuger étiquetés contenant l’homogénat de cerveau.
2. Inverser le tube deux fois, puis soigneusement vortex l’échantillon. Procéder à l’utilisation du vortex de chaque échantillon à l’aide des angles multiples pour assurer un mélange intime de la solution de l’homogénat de cerveau avec une solution de dextran de 26 %.
3. Centrifuger les échantillons à 5 000 x g pendant 15 min à 4 ° C.
   Remarque : Pour certaines analyses, il est utile de comparer les microvaisseaux avec parenchyme du cerveau. L’évaluation de l’expression de la protéine dans le parenchyme du cerveau soient nécessaires, le surnageant de cette étape de centrifugation (c.-à-d., fraction parenchymateuses de cerveau) soient collecté et stocké à-80 ° C pour une utilisation future.
4. Retirez le surnageant à l’aide d’un aspirateur vide et pipette Pasteur en verre.
   Remarque : Attention il faut ne pas déranger le culot. Dans le cas contraire, quantité des microvaisseaux recueillis sera réduite, qui va considérablement diminuer le rendement de protéine de cette procédure.
5. Resuspendre le culot dans 5,0 mL de BMB contenant inhibiteur de protéase cocktail (c.-à-d. 1,0 μL inhibiteur de protéase cocktail / 1,0 mL de tampon de BMB). Vortex du culot pour assurer un mélange complet.
6. Ajouter 8,0 mL de dextran de 26 % dans chaque tube à centrifuger et vortex comme décrit aux points 4.1-4.2 du présent protocole.
7. Centrifuger les échantillons à 5 000 x g pendant 15 min à 4 ° C.
8. À l’aide d’une fiole à vide et la pipette en verre, aspirer le surnageant et veiller à ce que granulés contenant des microvaisseaux de cerveau n’est pas perturbé.
   Remarque : Matériel d’excès qui adhère à la paroi du tube ne contient pas les microvaisseaux et soigneusement Nettoyez et enlevé.
9. Répétez les étapes 4,5 à 4,8 an supplémentaires deux fois.
10. Une fois 4 étapes de centrifugation de dextran sont terminés, ajouter 5,0 mL de BMB à chaque boulette et vortex pour remettre en suspension l’échantillon.
    Remarque : Après l’achèvement de l’étape 4.10, microvaisseaux ensemble peuvent être collectées pour l’analyse de la localisation de la protéine. Cela est possible en prenant un 50 μL aliquote de remises en suspension microvaisseaux pellet et étalement sur une lame de microscope. Microvaisseaux sont ensuite fixés à 95 ° C pendant 10 min sur un bloc de chauffage suivi par fixation dans l’éthanol glacé pour une supplémentaire de 10 min. de diapositives peuvent ensuite être stockés à 4 ° C jusqu'à leur utilisation pour les études d’imagerie thermique.

5. Ultracentrifugation pour préparer des échantillons de cerveau Total Membranes microvasculaire

1. Transfert des échantillons à l’homogénéisateur verre réfrigéré.
2. À l’aide d’un homogénéisateur électriques aériennes, homogénéiser les tissus cérébraux à l’aide de 8-10 et descendre de coups à 3 000 tr/min. L’homogénéisation est effectuée à l’aide d’un broyeur de tissu 10 mL mortier et un pilon. Nettoyer le pilon à l’aide d’éthanol à 70 % après homogénéisation de chaque échantillon individuel.
3. Transférer les échantillons pour nettoyer les tubes ultracentrifugeuse. Le nombre et la peser chaque tube individuel. Équilibre et apparier les tubes avant le chargement dans le rotor ultracentrifugeuse.
   Remarque : Tous les pesant et appariement des tubes ultracentrifugeuse doivent être effectués avec les bouchons sur pour assurer une mesure précise du poids du tube.
4. Centrifuger les échantillons à 150 000 x g pendant 1 h à 4 ° C.
5. À l’aide d’une fiole à vide et la pipette Pasteur en verre, aspirer le surnageant à l’aide de soin de ne pas perturber la pastille de la membrane capillaire.
6. Selon la taille de granule, ajouter un volume suffisant de tampon de stockage, ce qui comprend l’eau désionisée et BMB dans un ratio de 1:1 (v/v). En général, granulés sont resuspendues dans 400-500 μL de tampon de stockage. Ajouter cocktail inhibiteur de protéase au stockage tampon dans une proportion de 1,0 μL / 1,0 mL de tampon de stockage.
7. Échantillons de vortex de resuspendre le culot dans un tampon de stockage.
8. À l’aide d’une pipette Pasteur en verre, transférer les échantillons de membrane capillaire dans un tube de microcentrifuge d’étiquetées 1,5 mL.
9. Échantillon de passage à travers une aiguille seringue 5 x pour s’assurer que l’échantillon est bien mélangé et qu’aucun agrégat cellulaire n’existence.
10. Conserver les échantillons à-80 ° C jusqu'à leur utilisation pour l’analyse.
    NOTE : La teneur en protéines de chaque échantillon de membrane des microvaisseaux est mesurée à l’aide de la méthode de Bradford.

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Résultats

L’écoulement expérimental pour l’isolement des microvaisseaux de cerveau de rat et pour la préparation des échantillons de membrane microvaisseaux est montré dans la Figure 1. À l’aide de la procédure présentée ici, réussite de l’isolement des microvaisseaux intacts du cerveau de rat est démontrée (Figure 2 a). Ces navires ont été obtenus à l’issue de la centrifugation avec dextran et immédiatement avant...

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Discussion

Dans cet article, on décrit une méthode simple et efficace de préparation des échantillons de protéines de membrane des microvaisseaux fraîchement isolées du tissu de cerveau de rat. Plusieurs approches pour l’isolement des microvaisseaux de cerveau de rat ou de la génération des préparations membranaires de microcirculation isolée ont été signalés dans la littérature^13,20,21,22

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Protease Inhibitor Cocktail	Sigma-Aldrich	#P8340	Component of brain microvessel buffer
D-mannitol	Sigma-Aldrich	#M4125	Component of brain microvessel buffer
EGTA	Sigma-Aldrich	#E3889	Component of brain microvessel buffer
Trizma Base	Sigma-Aldrich	#T1503	Component of brain microvessel buffer
Dextran (MW 75,000)	Spectrum Chemical Mftg Corp	#DE125	Dextran used in centrifugation steps to separate microvessels from brain parenchyma
Zetamine	MWI Animal Health	#501072	General anesthetic
Xylazine	Western Medical Supply	#5530	General anesthetic
0.9% saline solution	Western Medical Supply	N/A	General anesthetic diluent
Filter Paper (12.5 cm diameter)	VWR	#28320-100	Used for removal of meninges from brain tissue
Centrifuge Tubes	Sarstedt	#60.540.386	Disposable tubes used for dextran centrifugation steps
Pierce™ Coomassie Plus (Bradford) Assay	ThermoFisher Scientific	#23236	Measurement of protein concentration in membrane preparations
Wheaton Overhead Power Homogenizer	DWK Life Sciences	#903475	Required for homogenization of samples
10.0ml glass mortar and pestle tissue grinder	DWK Life Sciences	#358039	Required for homogenization of samples
Hydrochloric Acid	Sigma-Aldrich	#H1758	Required for pH adjustment of buffers
Bovine Serum Albumin	ThermoFisher Scientific	#23210	Protein standard for Bradford Assay
Standard Forceps	Fine Science Tools	#91100-12	Used for dissection of brain tissue
Friedman-Pearson Rongeurs	Fine Science Tools	#16020-14	Used for opening skull to isolate brain
50 ml conical centrifuge tubes	ThermoFisher Scientific	#352070	Used for collection of brain tissue following isolation
Glass Pasteur Pipets	ThermoFisher Scientific	#13-678-20C	Used for aspiration of cellular debris following dextran spins
Ethanol, anhydrous	Sigma-Aldrich	#459836	Used for cleaning tissue grinder; diluted to 70% with distilled water
Ultracentrifuge tubes	Beckman-Coulter	#41121703	Used for ultracentrifugation of samples