主なヒト cd4 陽性 T リンパ球から低ミトコンドリア DNA 汚染 ATAC seq 試金

要約

ここでは、活性化 cd4 人間リンパ球を (ATAC seq) をシーケンス処理トランスポザーゼ アクセス クロマチンのアッセイを実行するプロトコルを提案します。プロトコルは、新しい換散バッファーの導入により 3% に 50% からミトコンドリア DNA の読み取りの汚染を最小限に変更されています。

要約

ATAC seq ゲノムワイド アクセス クロマチンのマッピングへの迅速かつ簡単なアプローチによるエピジェネティクスの研究で広く使われている方法論となっています。本稿ではミトコンドリア DNA の読み取りを汚染を減らす向上の ATAC seq プロトコルを提案する.以前の ATAC seq プロトコルに苦労している間ミトコンドリア DNA の汚染 50% の平均を読み取ると、この議定書で導入された最適化された換散バッファー 3% の平均にミトコンドリア DNA の汚染を軽減します。この改良の ATAC seq プロトコルは、シーケンシング コストに近い 50% 削減できます。データの分析を通じて全血からの cd 4 + リンパ球の隔離からのステップバイ ステップの手順を提供する活性化 cd4 リンパ球からこれらの高品質の ATAC seq ライブラリを準備できる方法を紹介します。改良されたこの ATAC seq プロトコルは細胞のタイプの広い範囲で検証されている、クロマチン接近性を勉強して研究者にすぐに使用されます。

概要

トランスポザーゼ アクセス クロマチン (ATAC seq) をシーケンス用急速にクロマチン アーキテクチャを尋問のため主要な方法となっています。ATAC seq は tagmentation、断片化、シーケンスが全ゲノムにわたってクロマチン アクセシビリティを判断できますライブラリを生成する、同じ酵素によって DNA のタグ付けのプロセスを介してアクセス可能なクロマチン領域を識別できます。この tagmentation プロセスは、のみ nucleosomic 立体障害によるクロマチンの開いている領域をカット非常に活発の Tn5 トランスポサーゼによって媒介されます。それはカット、Tn5 トランスポザーゼはまたを可能にする PCR による迅速なライブラリ構築およびゲノムワイド アクセス クロマチン^1,2次世代シーケンス シーケンス アダプターを挿入します。

ATAC seq クロマチン アクセシビリティ比較的単純で高速なプロトコル、品質とその結果、および開始に必要な材料の少量から判断できる情報の範囲のための領域を特定する最寄りの方法となっています。MNase seq⁴ (オープン ゲノム領域のヌクレオソームの位置が決まります)、(これはまたゲノム クロマチン接近性を測定) DNase seq³と比較して、ホルムアルデヒドを介した FAIRE seq⁵、ATAC seq はより速く、安く、そして再現性¹。また、出発の数として DNase seq³に必要な 5000 万の核と比較して 500 の核物質の使用より敏感です。ATAC seq クロマチン アーキテクチャの詳細については、転写因子結合、ヌクレオソームの配置、クロマチン領域¹の地域を含む他の方法よりもを提供することがあります。効果的な単一セルの ATAC seq プロトコルが検証されて、単一細胞レベル^6,7クロマチン アーキテクチャに関する情報の提供します。

ATAC seq はクロマチン アーキテクチャを特徴づける植物⁸人間⁹、および他の多くの有機体を含む研究と細胞のタイプの広い範囲にわたって使用されています。また病気状態⁷のエピジェネティック制御を識別するに重要だった。しかし、最も広く使用されている ATAC seq プロトコルには、ミトコンドリア DNA から汚染シーケンス読み込みの主な欠点が含まれています。一部のデータ セットでこの汚染レベルは配列結果¹の 60% と高いすることができます。ATAC seq^7,10,11のより効率的なアプリケーションを可能にするためにこれらの汚染のミトコンドリアの読み取りを削減するフィールドに協調された努力があります。ご紹介わずか 3% にミトコンドリアの DNA 混入率を減らす向上の ATAC seq プロトコル シーケンス コスト¹⁰で約 50% の削減をできるようにします。これはミトコンドリアの DNA 汚染を最小限に抑える重要な改善の換散バッファーと活性化 cd 4 + リンパ球の隔離の合理化されたプロセスによって可能です。

この modifiedATAC seq プロトコルは、初代培養細胞、ひとの主な末梢血単核球 (PBMCs)¹⁰、人間の主要な球 (未発表) マウス樹状細胞などの広い範囲で検証されています。要素の非コード¹¹クラスター化定期的に空間の短い回文繰り返し (CRISPR) 画面の悪性黒色腫細胞を尋問する正常にそれ使用されているも。さらに、このプロトコルで記述されている、GitHub 上で提供されるデータ分析パッケージは、ATAC seq データを分析するツールと新しいと経験豊富な研究者を提供します。ATAC seq クロマチン接近性を全体のゲノム全体マップに最も効果的な試金、ここで紹介されている既存のプロトコルに変更になります低のミトコンドリア DNA 汚染と高品質なデータを生成する研究者シーケンス処理のコストを削減し、ATAC seq のスループットの向上します。

プロトコル

この改良されたプロトコルは、データ解析 (図 1) による全血の原料から cd4 陽性リンパ球の ATAC seq を実行するための手順を説明します。

1. 全血からの cd 4 + T 細胞の分離

注:このプロトコルのための開始材料は研究の要件に基づいて選択する開始材料の源の標準手続きを使用して収集した新鮮な全血の 15 mL です。必要に応じて、プロトコルをスケールします。リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) + 2% ウシ胎仔血清 (FCS) 部屋の温度 (RT) をあらかじめ暖かいし、cd4 陽性 T 細胞濃縮手順を開始する前に RT する遠心分離機を調整します。

1. 50 mL コニカル チューブにおける全血 15 mL に人間 cd 4 + T 細胞濃縮カクテル 750 μ L を追加、逆転で軽く混ぜます。室温で 20 分間インキュベートします。培養が完了したときは、チューブに 15 mL の PBS + 2% の FCS を追加、インバージョンによる軽く混ぜます。
2. 密度媒体の 15 mL と 50 mL の新鮮な円錐管を準備します。慎重に層形成密度媒体/血インターフェイスを混乱しないように確認して密度媒体の上に希釈した血液サンプル。設定 1 を降順のブレーキの加速gと RT × 1,200 で 20 分間遠心します。
   注:加速度を 1 と密度培地で細胞層の混乱を避けるために遠心分離機にオフ ブレーキを降順に設定するが重要です。
3. 狭い幹転送ピペットを使用して密度媒体/プラズマ インターフェイスから豊かな cd4 陽性 T 細胞を収集します。新鮮な 50 mL の円錐管に集められたセルを転送します。Gおよび RT x 423 で 8 分間収集した cd4 陽性 T 細胞を遠心分離します。
   注:手順 1.3 とすべて次の手順のために 9 と下降ブレーキに遠心加速度を返すことを確認します。
4. 上澄みを廃棄、PBS + 2% の FCS の 50 mL の 2 回細胞ペレットを洗浄、最終的な上澄み 423 x gで RT。 破棄 8 分間遠心分離を洗浄し、2 ml の PBS + 2% の FCS の洗浄細胞ペレットを中断します。
5. 診断を使用してセルをカウントします。ATAC seq を続行するには、2.3 の手順に進みます。後で処理のための細胞を凍結するには、1.6 をステップに進みます。
6. 新鮮な凍結媒体 (90% の FCS + 10% ジメチルスルホキシド) 100 万セルごとの 1 つの mL を追加します。中低温安全管の凍結細胞の分注 1 mL。遅い凍結コンテナーで一晩-80 ° c 管を配置します。次の日は、長期保存用液体窒素にチューブを転送します。
   注: 100 万の cd4 陽性 T 細胞は元全血量の 2 mL あたり隔離されます。凍結培地 1 mL 因数で 500,000 セルをフリーズします。使用するたびに新鮮な凍結媒体を作る。

2. アクティブにし、cd 4 + T 細胞を浄化

注:48 h なり、95%、活性化 cd 4 + T 細胞を活性化し、cd4 陽性 T 細胞のみを浄化のこの急速なプロトコルが必要です。プロトコルを開始する前に、4 ° C に遠心分離機をクールします。

1. 氷が溶けるだけまで、37 ° C の水浴中の cd4 陽性 T 細胞の 1 バイアル (500,000) を解凍します。優しく細胞を予め温めておいたロズウェル パーク記念研究所-1640 年 (RPMI 1640 年) 培地 10 %fcs、完全な RPMI として以下の 9 mL を含む 15 mL の円錐管に転送します。
   注: セル DMSO への暴露を避けるために完全に雪解けてはいけないです。
2. 1500 x gと 4 ° C で 6 分間遠心上澄みを廃棄し、優しく完全 RPMI 2 mL にペレットを中断します。下回転を繰り返す、上澄みを廃棄し、優しく完全 RPMI 0.5 ml を中断します。
3. 診断を使用してセルをカウントします。細胞懸濁液 200 μ L/96 ウェル丸底プレートのウェルに 50,000 の細胞をプレートに完全な RPMI の密度を調整します。
   注:1 から 500 K cd4 陽性 T 細胞、50,000 の cd4 陽性 T 細胞を 200 μ L/ウェルのプレート 10 井戸の管を凍結します。
4. 人間の T 活性化抗 CD28 と抗 CD3 抗体で共役磁気ビーズを準備します。
   1. 1.5 mL チューブに ATAC seq サンプルあたり人間 T 活性化 CD3/CD28 ビーズの分注 12.5 μ。1 ml の 1x PBS のビーズを洗浄し、1 分のための磁石にチューブを配置します。
   2. 慎重に削除しクリアの上澄みを廃棄、磁石からチューブを削除および 13 でビーズを中断 μ L は、ATAC seq サンプルあたり RPMI を完了します。
      注: は、処理されている ATAC seq サンプルの数に基づいて必要なビーズの量を計算します。このプロトコルでは、12.5 μ あたり 500,000 細胞 CD3/CD28 ビーズ ATAC seq サンプルを 1 つを構成する必要があります。
5. Cd4 陽性 T 細胞をアクティブにします。15 mL の円錐管に完全 RPMI 培地の 2.1 mL の 500,000 の細胞を収集し、事前洗浄人間 T 活性化ビーズの 12.5 μ L を追加します。チューブを反転で優しく混ぜます。
6. 優しくビーズと細胞を滅菌タンクとプレート 200 μ L/マルチ チャンネル ピペットを使用して丸底 96 ウェル プレートのウェルのビーズでセルに転送します。48 h 37 ° C、5% CO₂インキュベーターで孵化させなさい。
7. 423 x gと/ウェルの 96 ウェル プレート、ビーズの損失がないように破棄する前に円錐形の管にそれを収集から媒体のルート削除 100 μ L で 8 分の 96 ウェル プレートを遠心分離機、インキュベーションを投稿します。残り 100 μ L で細胞ペレットを再懸濁します、1.5 mL チューブのすべてを収集します。
   注:活性化 T 細胞の 10 の井戸は、1 mL のボリュームで収集されます。
8. Cd 4 + の分離を実行します。完全な RPMI の 1 mL の 500,000 セルに中古洗浄共役 CD4 ビーズの 50 μ L を追加します。ピペットによってビーズと細胞を結合します。冷蔵庫の中に 4 ° C で 20 分間インキュベートします。ビーズと混合セル 6 分毎を揺り動かしなさい。
   注:このプロトコルは 500,000 のセルの 1 つのサンプルに使用します。50万の 2 つ以上のサンプルを必要に応じて調整します。
9. 孵化が完了したら、2 分を削除、クリア時の上澄みを廃棄、磁石にチューブを置きます。磁石からチューブを削除する、1 mL の PBS + 2% の FCS のビード区切セルの中断、1 分のための磁石にチューブを取り付け、明確な上清を廃棄してビード区切細胞を洗浄します。3 洗浄の合計のためのこのプロセスを繰り返します。
   注:洗浄中に、ビーズを破棄しないように注意します。
10. 最終的な洗浄の後 1 分削除のための磁石にチューブを配置、上澄みを廃棄し、氷の上にペレットを配置します。3 (ATAC seq) に進みます。

3. ATAC seq

注:この手順では、核は、atac 試験シーケンスの活性化 cd4 陽性 T 細胞から分離このプロトコルで使用する換散バッファーはより効率的な消化と質の高い成果の結果、核で穏やかに改善されました。4 ° C で維持固定角度の遠心分離機のセクション 3 ですべての遠心分離手順を実行します。プロトコルを開始する前に、遠心分離機をクールします。

1. 核の分離を実行します。ビーズと冷たい換散バッファー (トリス-HCl、pH 7.4 では、10 mM の NaCl、3 mM MgCl2、0.03% ポリソルベート 20 10 mM) で細胞を再懸濁します。すぐに 4 ° C で 10 分間 500 × gで遠心します。削除し、上澄みを廃棄します。
2. 転移反応を行います。Tn5 トランスポザーゼ ミックス (表 1) の 50 μ L で隔離された核ペレットを中断します。完了の 4 ° C で 40 ° C のふた付きの 37 ° C で 30 分間たちで孵化させなさい。
3. 熱サイクル後、すぐにダウン クイック ベンチトップ遠心分離機スピンを実行し、製品からビーズを削除する 1 分のための磁石にチューブを配置します。
4. DNA 精製カラムをチューブから磁石上の明確な上澄みを転送します。列バッファー PB の 250 μ L で 1 回と 2 回バッファー PE の 750 μ L を洗います。溶出バッファーの 10 μ L のサンプルを溶出します。3.5 の手順に進みます。
   注:この手順は、結紮のアダプターは、ここで ATAC seq ライブラリというと DNA のフラグメントを増幅します。NGS 片側一車線上で実行するいくつかの ATAC seq ライブラリを多重化するためにすべてのサンプルの個々 のサンプル (表 2) の異なるインデックス付きプライマー 2 インデックス プライマー 1 を使用します。プライマーは、1.25 μ M の濃度の作業で使用されます。
5. ヌクレアーゼ フリー PCR チューブ、順序で指定したボリュームのコンポーネントを組み合わせることで初期の PCR 増幅反応を表 3.PCR チューブをたちに置き、表 4に指定したとサイクリング条件で PCR 増幅プログラムを実行します。
6. QPCR による反応を監視します。ヌクレアーゼ フリー PCR チューブ、順序および表 5 に指定された量のコンポーネントを組み合わせることで qPCR 反応を設定します。QPCR 機械・ サイクルで指定した表 6 としての場所。
   1. 残り 45 μ L 反応サイクル追加の増幅の最適な数を調べるには、x 軸と y 軸に相対的な蛍光 (RFU) にサイクル数をプロットを作成します。最適な追加の増幅サイクル数は、高原に到達する qPCR 反応にかかるサイクル数の 3 分の 1 です。
      注: は qPCR による反応をモニタリング PCR サイクル GC コンテンツとサイズ バイアスを最小限に抑えながら最適なライブラリ フラグメントの増幅を取得するための最適な数を決定するためにことができます。
7. PCR の反作用の残り 45 μ L の最終的な PCR 増幅を完了します。たちに戻ってステップ 3.5 から増幅反応と PCR チューブを置き、テーブル 7で説明したように、プログラムを実行します。
   注:サンプルはこのプロトコルで記述されているように処理、12 に最適な総 PCR 増幅サイクル数を求めた。
8. 増幅の完了後、次の製造元のプロトコル、25 μ L の溶出バッファーで溶出 PCR クリーンアップ キットを使用してライブラリを浄化します。
   注:増幅されたライブラリを 48 h までの 4 ° C で保存または長期保管のための-20 ° C で凍結できます。

4. ATAC seq ライブラリの品質分析

注:次世代シーケンスの前に ATAC seq ライブラリの量と質を検証することが重要です。ライブラリの量と質は、市販キット (材料の表を参照) を使用して評価する必要があります。

1. マイクロ ベースのプラットフォームを使用してサイズ変更、定量化および DNA の品質管理のため ATAC seq ライブラリの量と質を評価します。代表的な品質評価の結果は、図 2を参照してください。
   注:ATAC seq ライブラリの集中する必要があります > 1 ng/μ L 品質シーケンス処理の結果を取得します。平均、30 日 25 μ L で nM が得られました。

5. シーケンス データ解析

注:この解析パイプラインでは、手順のマッピングの読み取りの品質を制御し、実験的なデザインの座標を調整する下流解析のためのピークを呼び出すことができます。コマンド行と実行の説明を次に示します。データ分析パッケージ (https://github.com/s18692001/bulk_ATAC_seq) で可能です。

1. サンプルあたり 4200 万読み取りの平均読み取り深度に次世代シーケンサーに準備されたライブラリをシーケンスします。
2. コマンドを使用して FastQC¹²ソフトウェア パッケージによって生成されたファイルを確認することによって配列読み取りの品質を推定します。
   fastqc -o < output_directory >< fastq_file >
3. コマンドを使用して、FastQC 品質チェックによって決定される、必要な場合に Trimmomatic¹³ソフトウェアによって読み取りの拠点をトリム (のペア終了)。
   java-jar ファイル < trimmomatic jar ファイルへのパス > < input1 >< PE input2 >< ペア output1 >< 不対 output1 >< ペア output2 >< 不対 output2 > HEADCROP: < トリミング拠点 >
4. Bowtie2¹⁴ソフトウェアによって人間の参照ゲノム (hg38) に対する読み取りを配置します。
   bowtie2 - x < 参照ゲノム >-1 < 入力ペア 1 >< 入力ペア 2 > S < 出力 SAM ファイル >
   注:引数 x は参照ゲノムのインデックスのベース、サム形式出力の -S です。
5. Samtools¹⁵ flagstat パッケージを使用してマップされたリードの質を確認します。
   samtools flagstat < BAM ファイル >
6. マップされた読み取りファイルを並べ替えるし、ピカード¹⁶ツールを使用して重複の削除します。
   java-jar picard.jar SortSam 入力 = < 入力 SAM ファイル名 > 出力 = < 出力をソート BAM ファイル名 > 並べ替え順序 = 座標」と「java-jar picard.jar MarkDuplicates 入力 = < 並べ替えられた BAM ファイル > 出力 = < 出力 BAM ファイル重複なし >REMOVE_DUPLICATES = TRUE
7. インデックス BAM ファイル未使用染色体の読み取りをトリミングし、ATAC seq¹⁷の実験のための座標のシフトします。
   java の jar picard.jar BuildBamIndex 入力 = < BAM ファイル >
   samtools idxstats < 入力 BAM ファイル > |カット -f 1 |grep-v 詳細 |grep-v いる |grep-v chrUn |xargs samtools -b < 入力 BAM ファイル >>< を表示出力は、BAM ファイルをトリミングされます >
   bedtools bamtobed -i < 入力トリム BAM ファイル >>< 出力トリミング ベッド ファイル >
   awk ' 開始 {OFS ="\t"};{場合 ($6 = =「+」) 印刷 $1、$2 + 4、$3 + 4、$4、$5、$6; 他印刷 $1、$2-5、$3-5、$4、$5、$6}' < 入力トリム ベッド ファイル >< トリム シフト ベッド ファイル >
8. 負の協調にシフトされて読み取りを削除します。
   awk '{if ($2 > 0) 印刷 $1"\t"$2"\t"$3"\t"$4"\t"5 ドル"\t"$6}' < ファイル入力ベッド >< 出力非負調整ベッド ファイル >。
9. ベッド ファイルを次の DiffBind¹⁸分析用の BAM ファイルに変換します。
   bedtools bedtobam-i < 入力ベッド ファイル >-g < 参照ゲノム >< 出力 BAM ファイル >
10. ピーク呼び出しを実行 DiffBind¹⁸ソフトウェア パッケージによって。
    macs2 callpeak -t < 入力 BAM ファイル >-f BAM g hs - nomodel-nolambda - 維持 dup すべて呼び出しサミット-outdir < 出力ディレクトリ パス > n < 出力名 > B-q 0.01 - bdg - シフト-100 - extsize 200
    注:フィルタ リング後、3700 万読み取りサンプルごとの中央値を予想します。ミトコンドリア DNA 汚染 0.30%-5.39% (平均 1.96%) からの範囲です。乗算マップリード (平均 6.7%-56%、19%) の率が低い、核使用の比較的高い割合 (60%-92%、平均 79%) を読み取ります。

結果

新鮮な全血の 15 mL からは、このプロトコルは 100 万の cd4 陽性 T 細胞の平均を生成します。これらは、後で処理するため冷凍またはすぐに使用できます。新鮮なまたは解凍、cd 4 + T 細胞の生存率は一貫して > 95%。Cd4 陽性 T 細胞分離のこの方法は、柔軟性、ソースの材料とコレクションの時間この改良の ATAC seq プロトコル シーケンスの 1 ng/μ L を超える最後のライブラ...

ディスカッション

この記事で紹介した修正の ATAC seq プロトコルは、最小限のミトコンドリア DNA 汚染で再現性のある結果を提供します。人間プライマリ PBMCs¹⁰、ひと単球 (未発表) マウス樹状細胞のクロマチン アーキテクチャの特性し、培養メラノーマ細胞線¹¹正常にプロトコルが使用されています。この改良の換散を見込んで条件他のセルタイプのために働く可能性があり?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x PBS, Sterile	Gibco	10010023	Can use other comparable products.
5810/5810 R Swing Bucket Refrigerated Centrifuge with 50 mL, 15 mL, and 1.5 mL Tube Buckets	Eppendorf	22625501	Can use other comparable products.
96 Well Round Bottom Plate	Thermo Scientific	163320	Can use other comparable products.
Agilent 4200 Tape Station System	Agilent	G2991AA	Suggested for quality assessment.
Cryotubes	Thermo Scientific	374081	Can use other comparable products.
DMSO	Sigma	D8418	Can use other comparable products.
Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28	Invitrogen Life Technologies	11131D	Critical Component
Dynabeads Untouched Human CD4 T Cells Kit	Invitrogen Life Technologies	11346D	Critical Component
Dynamagnet	Invitrogen Life Technologies	12321D	Critical Component
FCS	Gemini Bio Products	100-500	Can use other comparable products.
High Sensitivity DNA Kit	Agilent	50674626	Suggested for quality assessment.
Magnesium Chloride, Hexahydrate, Molecular Biology Grade	Sigma	M2393	Can use other comparable products.
MinElute PCR Purification Kit (Buffer PB, Buffer PE, Elution Buffer)	Qiagen	28004	Critical Component
Mr. Frosty	Thermo Scientific	5100-0001	Can use other comparable products.
NaCl, Molecular Biology Grade	Sigma	S3014	Can use other comparable products.
NEBNext High Fidelity 2x PCR Master Mix	New England BioLabs	M0541	Critical Component
Nextera DNA Library Preparation Kit (2x TD Buffer, Tn5 Enzyme)	Illumina	FC1211030	Critical Component
Nuclease Free Sterile dH20	Gibco	10977015	Can use other comparable products.
Polysorbate 20 (Tween20)	Sigma	P9416	Can use other comparable products.
PowerUp SYBR Green Master Mix	Applied Biosystems	A25780	Critical Component
Precision Water Bath	Thermo Scientific	TSGP02	Can use other comparable products.
QIAquick PCR Purification Kit	Qiagen	28104	Critical Component
Qubit dsDNA HS Assay Kit	Invitrogen Life Technologies	Q32851	Suggested for quality assessment.
Qubit FlouroMeter	Invitrogen Life Technologies	Q33226	Suggested for quality assessment.
Rosette Sep Human CD4+ Density Medium	Stem Cell Technologies	15705	Critical Component
Rosette Sep Human CD4+ Enrichment Cocktail	Stem Cell Technologies	15022	Critical Component
RPMI-1640	Gibco	11875093	Can use other comparable products.
Sterile Resevoir	Thermo Scientific	8096-11	Can use other comparable products.
T100 Thermocycler with Heated Lid	BioRad	1861096	Can use other comparable products.
Tris-HCL	Sigma	T5941	Can use other comparable products.