ATAC-seq test ADN Mitochondrial faible contamination de primaires humaines CD4 + Lymphocytes T

Résumé

Nous présentons ici un protocole pour effectuer un test pour la transposase accessible chromatine séquençage (ATAC-seq) sur activé CD4 + lymphocytes humains. Le protocole a été modifié pour réduire au minimum la contamination mitochondrial DNA lectures de 50 % à 3 % grâce à l’introduction d’une nouvelle mémoire tampon de lyse.

Résumé

ATAC-seq est devenu une méthode largement utilisée dans l’étude de l’épigénétique en raison de son approche simple et rapide à la cartographie de la chromatine accessible de tout le génome. Dans cet article, nous présentons un protocole ATAC-seq amélioré qui réduit la contamination lectures d’ADN mitochondriales. Alors que les précédents protocoles ATAC-seq ont lutté avec une moyenne de 50 % la contamination de l’ADN mitochondrial se lit, le tampon de lyse optimisé présenté dans le présent protocole réduit la contamination d’ADN mitochondriale à une moyenne de 3 %. Ce protocole de ATAC-seq amélioré permet de presque 50 % de réduction dans le coût du séquençage. Nous démontrons comment ces bibliothèques ATAC-seq de haute qualité peuvent être préparés de lymphocytes CD4 + activés, fournissant des instructions étape par étape de CD4 + isolation de lymphocytes du sang total par le biais de l’analyse des données. Ce protocole ATAC-seq amélioré a été validé dans un large éventail de types de cellules et sera d’une utilité immédiate aux chercheurs qui étudient l’accessibilité de la chromatine.

Introduction

Le dosage pour la transposase accessible chromatine séquençage (ATAC-seq) est rapidement devenu la principale méthode pour interroger l’architecture de la chromatine. ATAC-seq peut identifier les régions de chromatine accessible à travers le processus de tagmentation, la fragmentation et le marquage de l’ADN par la même enzyme, pour produire des bibliothèques avec laquelle séquençage peut déterminer l’accessibilité de la chromatine dans un génome entier. Ce processus de tagmentation est médié par la transposase Tn5 hyperactif, qui ne coupe que les régions ouvertes de la chromatine en raison de l’encombrement stérique nucleosomic. Qui le touche, la transposase Tn5 insère également des adaptateurs de séquençage qui permettent la construction rapide de bibliothèque par PCR et génération séquençage du génome de chromatine accessible^1,2.

ATAC-seq est devenue la méthode préférée pour déterminer les régions de l’accessibilité de la chromatine en raison du protocole relativement simple et rapide, la qualité et la quantité d’information qui peut être déterminée de ses résultats et une petite quantité de matériel requis de départ. Par rapport à DNase-seq³ (qui mesure également l’accessibilité de la chromatine génome-large), MNase-seq⁴ (qui détermine les positions des nucléosomes dans régions génomiques ouvert), et le formaldéhyde-mediated FAIRE-seq⁵, ATAC-seq est plus rapide, moins cher et plus reproductible¹. Il est aussi plus sensible, avec matériel d’aussi peu que 500 noyaux, par rapport aux 50 millions requis pour DNase-seq³noyaux de départ. ATAC-seq a également la possibilité de fournir plus d’informations sur l’architecture de la chromatine que d’autres méthodes, y compris les régions de liaison de facteur de transcription, positionnement des nucléosomes et régions de chromatine ouverte¹. Efficaces, monocellulaires ATAC-seq protocoles ont été validés, fournissant des informations sur l’architecture de la chromatine à la cellule unique niveau^6,7.

ATAC-seq a été utilisé pour caractériser l’architecture de la chromatine dans un large éventail de types de cellules et de la recherche, y compris les plantes⁸humains⁹et beaucoup d’autres organismes. Il a également été essentiel dans l’identification de régulation épigénétique de la maladie États⁷. Cependant, le plus largement utilisé du protocole ATAC-seq inclut l’inconvénient majeur de contamination lectures de séquençage de l’ADN mitochondrial. Dans certaines bases de données, ce niveau de contamination peut être aussi haut que 60 % de séquencer les résultats¹. Il y a un effort concerté dans le domaine de réduire ces contaminants lectures mitochondriales afin de permettre l’application plus efficace de ATAC-seq^7,10,11. Nous présentons ici un protocole ATAC-seq amélioré qui réduit le taux de contamination de l’ADN mitochondrial, à seulement 3 %, permettant de réduire d’environ 50 % de coûts de séquençage¹⁰. Ceci est rendu possible par un processus simplifié de CD4 + lymphocytes d’isolement et d’activation et un tampon de lyse améliorée qui est essentielle pour réduire au minimum la contamination de l’ADN mitochondriale.

Ce protocole modifiedATAC-seq a été validé avec une large gamme de cellules primaires, y compris le sang périphérique primaire humain cellules mononucléaires (PBMC)¹⁰, des monocytes humains primaires et les cellules dendritiques de souris (non publiées). Il a également été utilisé avec succès pour interroger des lignées de cellules de mélanome dans un écran régulièrement dois‑je courts palindromes répétitions (CRISPR) en cluster de non-codage éléments¹¹. En outre, le progiciel d’analyse de données décrites dans le présent protocole et fourni sur GitHub fournit des chercheurs débutants et expérimentés avec des outils pour analyser les données de l’ATAC-seq. ATAC-seq est le dosage plus efficace pour cartographier l’accessibilité de la chromatine dans un génome entier, et les modifications au protocole existant qui sont introduites ici permettra aux chercheurs de produire des données de haute qualité avec une faible contamination de l’ADN mitochondriale, réduction des coûts de séquençage et améliorant le débit ATAC-seq.

Protocole

Ce protocole amélioré fournit des instructions détaillées pour l’exécution de ATAC-seq des lymphocytes CD4 +, de la matière première de sang grâce à l’analyse de données (Figure 1).

1. isolement des cellules de T CD4 + du sang total

Remarque : Le produit de départ pour ce protocole est de 15 mL de sang total frais prélevé à l’aide de procédures standards, permettant à la source des matières premières à être sélectionné issu des besoins de recherche. L’échelle du protocole selon les besoins. Réchauffez en solution saline tamponnée au phosphate (PBS) + sérum de veau foetal de 2 % (FCS) à température ambiante (RT) et ajustez la centrifugeuse pour RT avant de commencer la procédure d’enrichissement de cellules T CD4 +.

1. Ajouter 750 µL de CD4 + lymphocytes T enrichissement humain cocktail à 15 mL de sang dans un tube conique de 50 mL et mélanger doucement à l’inversion. Incuber 20 min à RT. Lors de l’incubation est terminée, ajouter 15 mL de PBS + 2 % FCS dans le tube et mélanger doucement à l’inversion.
2. Préparer un tube conique frais 50 mL 15 ml de milieu de densité. Soigneusement l’échantillon de sang dilué sur le dessus de la moyenne densité, étant sûr de ne pas perturber l’interface de support/sang de densité qui forme la couche. Centrifuger pendant 20 min à 1 200 x RT et g l’accélération de la valeur 1 et le frein décroissant au large.
   Remarque : Il est essentiel de définir l’accélération 1 et descendant de frein OFF sur la centrifugeuse à éviter des perturbations de la couche de cellules dans le milieu de la densité.
3. Recueillir les cellules T CD4 + enrichis depuis l’interface de support/plasma de densité à l’aide d’une pipette de transfert tige étroite. Transférer les cellules recueillies dans un tube conique frais 50 mL. Centrifuger les cellules T CD4 + collectées pendant 8 min à 423 x g et RT.
   Remarque : Assurez-vous de revenir l’accélération centrifuge frein 9 et descendant sur ON pour l’étape 1.3 et toutes les étapes suivantes.
4. Jeter le surnageant et laver le culot cellulaire deux fois avec 50 mL de PBS + 2 % FCS, centrifugation pendant 8 min à 423 x g et RT. jeter le surnageant final lavez et suspendre le culot cellulaire lavées dans 2 mL de PBS + 2 % FCS.
5. Compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre. Pour continuer avec ATAC-seq, passez à l’étape 2.3. Pour congeler les cellules pour un traitement ultérieur, passer au point 1.6.
6. Ajouter 1 mL de milieu frais glacial (FCS 90 % + 10 % de diméthyl sulfoxide) par 1 million de cellules. Aliquote 1 mL de cellules en gel en tubes sécurités cryogéniques. Placer les tubes à-80 ° C durant la nuit dans un récipient de ralentir au point de congélation. Le lendemain, transfert en tubes à l’azote liquide pour le stockage à long terme.
   Remarque : 1 million de cellules T CD4 + sera isolé par 2 mL de volume de sang d’origine. Congelez 500 000 cellules dans 1 ml de milieu de congélation. Faire un milieu gel frais à chaque utilisation.

2. activer et purifier les cellules T CD4 +

Remarque : Ce protocole rapid pour l’activation et la purification de cellules T CD4 + seulement requiert 48 h et les résultats dans 95 % viable, activé les cellules T CD4 +. Cool le centrifuger à 4 ° C avant de commencer le protocole.

1. Décongeler 1 flacon (500 000) des cellules T CD4 + dans un bain-marie à 37 ° C jusqu'à ce que la glace a fondu juste. Cellules de transfert doucement dans un tube conique 15 mL contenant 9 mL de médias de Roswell Park Memorial Institute-1640 (RPMI-1640) pré chauffé additionné de 10 % de FCS, ci-après dénommé RPMI complet.
   Remarque : Ne laissez pas les cellules décongeler complètement pour éviter l’exposition au DMSO.
2. Centrifuger pendant 6 min à 1500 x g et 4 ° C. Jeter le surnageant et suspendez doucement le culot dans 2 mL de RPMI complet. Répéter le spin down, éliminer le surnageant et suspendez doucement les cellules dans 0,5 mL de RPMI complet.
3. Compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre. Ajuster la densité de la suspension cellulaire avec RPMI complet à 50 000 cellules dans 200 µL / puits d’une plaque de fond rond 96 puits de la plaque.
   Remarque : D’un tube congelé des cellules T CD4 + de 500K, puits de la plaque 10 des 50 000 cellules T CD4 + dans 200 µL / puits.
4. Préparer des billes magnétiques conjugués avec anticorps anti-CD3 et anti-CD28 humains de T-activator.
   1. Aliquote 12,5 µL d’humain T-activateur CD3/CD28 perles par ATAC-seq échantillon dans un tube de 1,5 mL. Laver les billes avec 1 mL de solution 1 PBS x et placer le tube sur un aimant pendant 1 min.
   2. Retirer et jeter le surnageant clair, retirez délicatement le tube d’aimant et suspendre les perles dans 13 µL terminer RPMI par échantillon ATAC-seq.
      Remarque : Calculer le montant de perles nécessaires selon le nombre d’échantillons de ATAC-seq en cours de traitement. Ce protocole requiert 12,5 µL de billes CD3/CD28 par 500 000 cellules, constituant un échantillon de ATAC-seq.
5. Activer les cellules T CD4 +. Prélever des 500 000 cellules en 2,1 mL du milieu RPMI complet dans un tube conique de 15 mL et ajouter 12,5 µL de perles de T-activateur humaines déjà lavées. Mélanger doucement en retournant le tube.
6. Transférer doucement les cellules avec des perles à une stérile réservoir et plaque 200 µL de cellules avec des perles / puits de la plaque à 96 puits fond rond à l’aide d’une pipette multi-canaux. Incuber pendant 48 h dans un 37 ° C, 5 % CO₂ incubateur.
7. Après incubation, centrifuger la plaque 96 puits pendant 8 min à 423 x g et RT. enlever 100 µL de milieu / puits de la plaque à 96 puits, il collecte dans un tube conique avant de le jeter pour assurer sans perte de perle. Resuspendre le culot dans les derniers 100 µL et recueillir tous dans un tube de 1,5 mL.
   Remarque : 10 puits de lymphocytes T activés seront rassemblées dans un volume de 1 mL.
8. Effectuer des CD4 + isolation. Ajouter 50 µL de Prélavée perles CD4 conjugué aux 500 000 cellules dans 1 mL de milieu RPMI complet. Combiner les perles et les cellules la pipette. Incuber pendant 20 min à 4 ° C dans le réfrigérateur. Agiter les perles et mélange toutes les 6 minutes de la cellule.
   Remarque : Ce protocole doit être utilisé que pour un échantillon de 500 000 cellules. Ajustez si nécessaire pour deux ou plusieurs échantillons de 500 000.
9. Lorsque l’incubation est terminée, placer le tube sur l’aimant pour 2 min. retirer et jeter le surnageant lorsque claire. Laver les cellules perle-bondissent en enlevant le tube de l’aimant, suspendant les cellules perle-bondissent dans 1 mL de PBS + 2 % FCS, remplaçant le tube sur l’aimant pendant 1 min et jeter le surnageant clair. Répétez ce processus pour un total de 3 lavages.
   Remarque : Veillez à ne pas jeter des perles lors de lavages.
10. Après le lavage final, placer le tube sur l’aimant pour 1 min. retirer et jeter le surnageant et placez la sur la glace. Passez à la section 3 (ATAC-seq).

3. ATAC-seq

Remarque : Dans cette étape, les noyaux sont isolés de lymphocytes T CD4 + activés pour ATAC-suiv. Le tampon de lyse utilisé dans le présent protocole a été amélioré pour être plus doux sur les noyaux, ce qui entraîne une digestion plus efficace et des résultats de qualité supérieures. Toutes les étapes de centrifugation à l’article 3 sont effectuées avec une centrifugeuse à angle fixe maintenue à 4 ° C. Cool la centrifugeuse avant de commencer le protocole.

1. Effectuer l’isolation de noyaux. Remettre en suspension les cellules avec le tampon de lyse froid (10 mM Tris-HCl, pH 7,4, 10 mM NaCl, MgCl2, 0,03 % polysorbate 20 3 mM) et perles. Centrifuger immédiatement à 500 x g pendant 10 min à 4 ° C. Retirer et jeter le surnageant.
2. Effectuer la réaction de la transposase. Suspendre le culot de noyaux isolés avec 50 µL de Tn5 transposase mix (tableau 1). Incuber dans un thermocycleur pendant 30 min à 37 ° C, avec un couvercle de 40 ° C, tenant à 4 ° C lorsque vous avez terminé.
3. Après cyclage thermique, immédiatement effectuer une rotation de centrifugeuse de paillasse rapide vers le bas et placer le tube sur l’aimant pendant 1 min retirer les billes du produit.
4. Transférer le surnageant clair du tube sur l’aimant à une colonne de purification de l’ADN. Laver la colonne avec 250 µL de tampon de PB et deux fois avec 750 µL de tampon de PE. Éluer l’échantillon de 10 µL de tampon d’élution. Passer directement au point 3.5.
   Remarque : Cette étape amplifie les fragments d’ADN avec les adaptateurs ligaturés, dénommés ici la bibliothèque ATAC-seq. Pour multiplexer plusieurs bibliothèques ATAC-seq pour être exécuté sur une seule voie NGS, utilisez non indexées Primer 1 pour tous les échantillons et un 2 de Primer indexée différents pour des échantillons individuels (tableau 2). Amorces servent à travailler les concentrations de 1,25 µM.
5. Mettre en place la réaction d’amplification PCR initiale dans un tube PCR exempte de nucléase, combinant les composants dans l’ordre et le volume spécifié dans tableau 3. Placer le tube PCR dans le thermocycleur et exécutez le programme d’amplification PCR avec cyclisme conditions spécifiées dans le tableau 4.
6. Surveiller la réaction de qPCR. Mettre en place la réaction de qPCR dans un tube PCR exempte de nucléase, combinant les composants dans l’ordre et de la quantité spécifiée dans le tableau 5. Place dans la machine de qPCR et cycle comme spécifié au tableau 6.
   1. Pour déterminer que le nombre optimal d’amplification supplémentaire des cycles pour la réaction de 45 µL restants, créer un terrain avec le nombre de cycles sur l’axe des abscisses et la fluorescence relative (RFU) sur l’axe y. Le nombre optimal de cycles d’amplification supplémentaire est un tiers le nombre de cycles qu’il faut pour la réaction de qPCR atteindre le plateau.
      NOTE : Suivi de la réaction de qPCR permet pour déterminer le nombre optimal de cycles PCR désiré obtenir l’amplification de fragment de bibliothèque optimale tout en minimisant les GC contenu et biais de taille.
7. Compléter l’amplification PCR finale le µl 45 restantes de la réaction PCR. Replacez le tube PCR avec la réaction d’amplification de l’étape 3.5 dans le thermocycleur et exécuter le programme, tel que décrit dans le tableau 7.
   Remarque : Pour les échantillons traités tel que décrit dans le présent protocole, le nombre optimal de cycles d’amplification PCR a été déterminé à 12.
8. Une fois terminée l’amplification, purifier les bibliothèques à l’aide d’un kit de nettoyage PCR suivant le protocole du fabricant, à élution de 25 µL du tampon d’élution.
   Remarque : Amplifié bibliothèques peuvent être conservés à 4 ° C pendant 48 h ou congelés à-20 ° C pour le stockage à long terme.

4. ATAC-seq bibliothèque analyse de la qualité

Remarque : Il est important de valider la qualité et la quantité des bibliothèques ATAC-seq avant séquençage nouvelle génération. La qualité et la quantité des bibliothèques devraient être évalués à l’aide de trousses disponibles dans le commerce (voir Table des matières).

1. Évaluer la qualité et la quantité des bibliothèques ATAC-seq en utilisant une plate-forme microfluidique de dimensionnement, de quantification et de contrôle de la qualité de l’ADN. Voir la Figure 2 pour les résultats de l’évaluation qualité représentatif.
   Remarque : La concentration des bibliothèques ATAC-seq doit être > 1 ng/µL à obtenir des résultats de séquençage de qualité. Le moyen, 30 nM à 25 µL ont été obtenus.

5. le séquençage et l’analyse des données

Remarque : Ce pipeline analyse permet aux utilisateurs de contrôler la qualité des lectures mappage de procédure, ajuster les coordonnées pour la conception expérimentale et appeler les pics pour l’analyse en aval. Voici les lignes de commandes et l’explication de l’exécution. Le package d’analyse de données est disponible à (https://github.com/s18692001/bulk_ATAC_seq).

1. Séquencer les bibliothèques de prêts sur un séquenceur de prochaine génération à une profondeur moyenne de 42 millions de lectures par exemple.
2. Estimer la qualité des lectures de séquençage en vérifiant les fichiers générés par FastQC¹² progiciel à l’aide de la commande :
   fastqc -o < output_directory >< fastq_file >
3. Couper les bases des lectures par Trimmomatic¹³ logiciel, le cas échéant, tel que déterminé par le contrôle de qualité de FastQC, à l’aide de la commande (à paire asymétrique) :
   Java-jar < chemin d’accès au fichier jar trimmomatic > PE < input1 >< input2 >< appariés output1 >< non apparié output1 >< appariés output2 >< non apparié output2 > HEADCROP : < recadrer les bases >
4. Aligner les lectures au génome humain de référence (hg38) par Bowtie2¹⁴ software :
   bowtie2 - x < génome de référence > -1 < paire d’entrée 1 >< paire d’entrée 2 > -S < fichier de sortie SAM >
   Remarque : L’argument - x est pour le nom de la base de l’indice pour le génome de référence, et est -S pour la sortie de format SAM.
5. Vérifiez telsqueles mappé se lit à l’aide de Samtools¹⁵ flagstat package :
   SamTools flagstat < fichier BAM >
6. Trier le fichier mappé lectures et supprimer les doublons en utilisant outil¹⁶ Picard :
   Java-jar picard.jar d’entrée SortSam = < nom du fichier d’entrée SAM > sortie = < nom du fichier sortie tri BAM > SORT_ORDER = coordonnée » et « java-jar picard.jar MarkDuplicates entrée = < fichier trié de BAM > sortie = < fichier de sortie BAM sans doublons > REMOVE_DUPLICATES = TRUE
7. Fichier index BAM, tailler les lectures de chromosome inutilisés et passer les coordonnées pour la raison expérimentale de ATAC-seq¹⁷:
   Java-jar picard.jar BuildBamIndex entrée = < fichier BAM >
   SamTools idxstats < fichier entrée BAM > | couper -f 1 | grep - v chrY | grep - v chrM | grep - v chrUn | xargs samtools découvre -b < fichier entrée BAM >>< garnis de sortie fichier BAM >
   BEDTools bamtobed -i < Input garnis de fichier BAM >>< garnis de sortie fichier lit >
   awk ' BEGIN {OFS = « \t »} ; {Si (6 $ == « + ») print $1, $2 + 4, 3 + 4 $, 4 $, 5 $, 6 $; else print $1, $2-5, 3-5 $, 4 $, 5 $, 6 $} ' < Input garnis de fichier lit >< boîte décalé fichier lit >
8. Supprimez les lectures qui sont décalés vers la coordination négative :
   awk « {if ($2 > 0) print $1 « \t » $2 « \t » $3 « \t » $4 « \t » $5 « \t » $6} » < fichier entrée lit >< fichier de sortie non négatif coordination lit >.
9. Convertir le fichier lit vers BAM pour analyse de¹⁸ DiffBind suivante :
   BEDTools bedtobam -i < Input lit dossier > -g < référence génome >< fichier de sortie BAM >
10. Effectuer des appels de crête par DiffBind¹⁸ progiciel :
    macs2 callpeak -t < fichier entrée BAM > f - BAM -g hs - nomodel--nolambda--keep-dup tous--appel-sommets--outdir < chemin de répertoire de sortie > - n < nom de sortie > -B - q 0,01--bdg--Maj -100--extsize 200
    Remarque : Après filtrage, s’attendre à une moyenne de 37 millions de lectures par exemple. Contamination de l’ADN mitochondriale variera de 0,30 % à 5,39 % (1,96 % en moyenne). Il y aura un faible taux de multiplier mappés lectures (6,7 % à 56 %, 19 % en moyenne) et un pourcentage relativement élevé d’utilisables nucléaire lit (60 % à 92 %, 79 % en moyenne).

Résultats

A partir de 15 mL de sang total frais, ce protocole génère une moyenne de 1 million de cellules T CD4 +. Ceux-ci peuvent être congelés pour un traitement ultérieur ou utilisés immédiatement. La viabilité des cellules T CD4 +, fraîches ou décongelées, était systématiquement > 95 %. Cette méthode d’isolement de cellules T CD4 + permet une flexibilité dans le temps de matériel et de la collection source. Ce protocole ATAC-seq amélioré produit une bibliothèque finale sup?...

Discussion

ATAC-seq mis à jour le protocole présenté dans cet article fournit des résultats reproductibles avec une contamination ADN mitochondriale minimale. Le protocole a été avec succès utilisé pour caractériser l’architecture de la chromatine des humains primaires PBMC¹⁰, des monocytes, cellules dendritiques de souris (non publiées) et cellules de mélanome cultivées les lignes¹¹. Nous prévoyons que cette amélioration lyse condition a la possibilité de travailler ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1X PBS, Sterile	Gibco	10010023	Can use other comparable products.
5810/5810 R Swing Bucket Refrigerated Centrifuge with 50 mL, 15 mL, and 1.5 mL Tube Buckets	Eppendorf	22625501	Can use other comparable products.
96 Well Round Bottom Plate	Thermo Scientific	163320	Can use other comparable products.
Agilent 4200 Tape Station System	Agilent	G2991AA	Suggested for quality assessment.
Cryotubes	Thermo Scientific	374081	Can use other comparable products.
DMSO	Sigma	D8418	Can use other comparable products.
Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28	Invitrogen Life Technologies	11131D	Critical Component
Dynabeads Untouched Human CD4 T Cells Kit	Invitrogen Life Technologies	11346D	Critical Component
Dynamagnet	Invitrogen Life Technologies	12321D	Critical Component
FCS	Gemini Bio Products	100-500	Can use other comparable products.
High Sensitivity DNA Kit	Agilent	50674626	Suggested for quality assessment.
Magnesium Chloride, Hexahydrate, Molecular Biology Grade	Sigma	M2393	Can use other comparable products.
MinElute PCR Purification Kit (Buffer PB, Buffer PE, Elution Buffer)	Qiagen	28004	Critical Component
Mr. Frosty	Thermo Scientific	5100-0001	Can use other comparable products.
NaCl, Molecular Biology Grade	Sigma	S3014	Can use other comparable products.
NEBNext High Fidelity 2X PCR Master Mix	New England BioLabs	M0541	Critical Component
Nextera DNA Library Preparation Kit (2X TD Buffer, Tn5 Enzyme)	Illumina	FC1211030	Critical Component
Nuclease Free Sterile dH20	Gibco	10977015	Can use other comparable products.
Polysorbate 20 (Tween20)	Sigma	P9416	Can use other comparable products.
PowerUp SYBR Green Master Mix	Applied Biosystems	A25780	Critical Component
Precision Water Bath	Thermo Scientific	TSGP02	Can use other comparable products.
QIAquick PCR Purification Kit	Qiagen	28104	Critical Component
Qubit dsDNA HS Assay Kit	Invitrogen Life Technologies	Q32851	Suggested for quality assessment.
Qubit FlouroMeter	Invitrogen Life Technologies	Q33226	Suggested for quality assessment.
Rosette Sep Human CD4+ Density Medium	Stem Cell Technologies	15705	Critical Component
Rosette Sep Human CD4+ Enrichment Cocktail	Stem Cell Technologies	15022	Critical Component
RPMI-1640	Gibco	11875093	Can use other comparable products.
Sterile Resevoir	Thermo Scientific	8096-11	Can use other comparable products.
T100 Thermocycler with Heated Lid	BioRad	1861096	Can use other comparable products.
Tris-HCL	Sigma	T5941	Can use other comparable products.