ATAC-seq Assay с низкой митохондриальной ДНК загрязнения от первичного человека CD4 + Т-лимфоцитов

Резюме

Здесь мы представляем протокол для выполнения assay для виртуализации (ATAC-seq) активированный человека лимфоцитов CD4 + Транспозаза доступные хроматина. Протокол был изменен для сведения к минимуму загрязнения митохондриальной ДНК читает от 50% до 3% путем введения нового буфера lysis.

Аннотация

ATAC-seq стал широко используется методология в изучении эпигенетики из-за его быстрый и простой подход к картирования генома всей доступной хроматина. В этой статье мы представляем улучшение ATAC-seq протокол, который уменьшает загрязнение митохондриальной ДНК читает. В то время как предыдущие протоколы ATAC-seq боролись с читает в среднем на 50%, загрязняя митохондриальной ДНК, оптимизированный литического буфера, представил в настоящем Протоколе уменьшает загрязнение митохондриальной ДНК в среднем 3%. Это улучшение ATAC-seq протокол обеспечивает около 50% сокращение стоимости последовательности. Мы демонстрируем, как эти библиотеки ATAC-seq высокого качества могут быть получены из активированных CD4 + лимфоцитов, шаг за шагом инструкции от CD4 + лимфоцитов изоляции из цельной крови путем анализа данных. Этот улучшенный протокол ATAC-seq протестирована в широком диапазоне типов клеток и будет немедленно воспользоваться исследователи, изучая хроматина доступности.

Введение

Assay для Транспозаза доступные хроматина виртуализации (ATAC-seq) быстро стал ведущим методом для допроса хроматина архитектуры. ATAC-seq можно определить регионы доступны хроматина через процесс tagmentation, фрагментации и пометки ДНК же ферментом, производить библиотеки, с которыми последовательности можно определить доступность хроматина через весь геном. Этот процесс tagmentation при посредничестве гиперактивный Tn5 Транспозаза, который режет только открытые регионы хроматина из-за nucleosomic их пространственной помех. Как она режет, Tn5 Транспозаза также вставляет последовательность адаптеры, которые позволяют для быстрого библиотека строительство методом ПЦР и следующего поколения секвенирования генома всей доступной хроматина^1,2.

ATAC-seq стала предпочтительным методом для определения регионов хроматина доступности из-за относительно простой и быстрый протокол, качество и спектр информации, которая может быть определена из его результаты и небольшое количество исходного материала требуется. По сравнению с DNase-seq³ (который также измеряет генома общесистемной хроматина доступность), MNase-seq⁴ (который определяет нуклеосома позиции в регионах открытых генома), и формальдегида опосредованной Фэр seq⁵, ATAC-seq быстрее, дешевле и более воспроизводимые¹. Это также более чувствительным, работа с исходного материала всего лишь 500 ядер, по сравнению с 50 миллионов ядра, необходимые для DNase-seq³. ATAC-seq также имеет возможность предоставить дополнительные сведения об архитектуре хроматина чем другие методы, включая регионы привязки фактор транскрипции, нуклеосома позиционирования и открытые хроматина регионах¹. Эффективный, одноклеточных ATAC-seq протоколы были подтверждены, предоставляя информацию о архитектуры хроматина в одной ячейки уровня^6,7.

ATAC-seq используется для характеристики хроматина архитектуры через широкий спектр исследований и клетки типов, включая растения⁸,⁹людей и многих других организмов. Это также сыграло важную роль в идентификации эпигеномные регулирование болезни государств⁷. Однако наиболее широко используемый протокол ATAC-seq включает основным недостатком загрязнения гласит последовательности митохондриальной ДНК. В некоторых наборов данных этот уровень загрязнения может быть выше, чем 60% секвенирования результаты¹. В поле, чтобы уменьшить эти загрязняющие митохондриальной читает для обеспечения более эффективного применения ATAC-seq^7,10,11есть согласованные усилия. Здесь мы представляем улучшение ATAC-seq протокол, который снижает уровень загрязнения митохондриальной ДНК всего 3%, позволяя сокращение около 50% в последовательности по цене¹⁰. Это стало возможным путем упрощения процесса CD4 + лимфоцитов изоляции и активации и улучшение литического буфера, которая имеет решающее значение для сведения к минимуму загрязнения митохондриальной ДНК.

Этот протокол modifiedATAC-seq протестирована с широкий спектр первичных элементов, включая первичный периферической крови человека мононуклеарных клеток (получения)¹⁰, человека первичной моноцитов и дендритные клетки мыши (Неизданное). Он также успешно используется допросить линии клетки меланомы в кластеризованный экране регулярно interspaced короткие палиндром повторяется (ТРИФОСФАТЫ)-кодирования элементы¹¹. Кроме того пакет анализа данных указанных в настоящем Протоколе и на GitHub предоставляет новым и опытным исследователей с инструментами для анализа данных ATAC-seq. ATAC-seq является наиболее эффективным методом для сопоставления хроматина доступность через весь геном, и изменения в существующий протокол, которые будут введены здесь позволит исследователям для производства высококачественных данных с низкой митохондриальной ДНК загрязнения, снижение издержек виртуализации и повышение ATAC-seq пропускную способность.

протокол

Эта улучшенная протокол предоставляет пошаговые инструкции для выполнения ATAC-seq CD4 + лимфоцитов, от исходного материала цельной крови через анализ данных (рис. 1).

1. изоляция CD4 + Т-клеток из цельной крови

Примечание: Исходным материалом для этого протокола — 15 мл свежей цельной крови, собранных с помощью стандартных процедур, позволяя источник исходного материала должен выбираться на основе требований к исследованиям. Масштаб протокол, при необходимости. Предварительно теплой-фосфатный буфер (PBS) + сыворотка (FCS) 2% плода теленка до комнатной температуры (RT) и отрегулируйте центрифуги для RT перед началом процедуры обогащения клеток CD4 + T.

1. 750 мкл человека CD4 + Т-клеток обогащения коктейль по 15 мл цельной крови в 50 мл Конические трубки и осторожно перемешать путем инверсии. Инкубируйте на RT на 20 мин. При завершении инкубации, добавляют 15 мл PBS + 2% FCS к трубе и осторожно перемешать путем инверсии.
2. Подготовьте свежие 50 мл Конические трубки с 15 мл плотности среды. Тщательно слой разбавленной крови на вершину средней плотности, будучи уверенным, чтобы не нарушить плотность среднего артериального интерфейс, который формирует. Центрифуги для 20 минут 1200 x g и RT с ускорением, равным 1 и нисходящая тормозная OFF.
   Примечание: Важно, чтобы задать ускорение 1 и нисходящие тормозные OFF на центрифуге, чтобы избежать нарушения слоя клеток в средней плотности.
3. Соберите обогащенного CD4 + Т-клеток от плотности среднего/плазмы интерфейса с помощью пипетки передачи узкие стволовых. Передавать собранные клетки свежие 50 мл Конические трубки. Центрифуга собранных CD4 + Т-клеток для 8 мин в 423 x g и RT.
   Примечание: Убедитесь в том, что возвращение центрифуги ускорение в 9 и нисходящей тормоз в ON для шага 1.3 и все из следующих действий.
4. Отбросить супернатант и помыть лепешка клетки дважды с 50 мл PBS + 2% FCS, центрифугирование 8 мин в 423 x g и RT. Discard окончательный супернатант мыть и приостановить Пелле мыть ячейки в 2 мл PBS + 2% FCS.
5. Подсчет количества ячеек с помощью Горяева. Чтобы продолжить ATAC-seq, переходите к шагу 2.3. Чтобы заморозить клетки для последующей обработки, перейдите к пункт 1.6.
6. Добавьте 1 mL свежих замораживания среды (FCS 90% + 10% диметилсульфоксида) за 1 миллион клеток. Аликвота 1 мл клеток в замораживания среды в криогенных безопасных трубок. Место труб на-80 ° C ночь в контейнере медленного замораживания. Следующий день, передачи трубки для жидкого азота для длительного хранения.
   Примечание: 1 миллион клеток CD4 + T будут изолированы на 2 мл первоначального объема цельной крови. Заморозить 500000 клеток в 1 мл аликвоты замораживания среды. Сделайте свежий замораживания среды при каждом использовании.

2. активировать и очистить CD4 + Т-клеток

Примечание: Этот быстрый протокол для активации и очистки CD4 + Т-клеток только требует 48 h и результаты в 95% жизнеспособным, активированный CD4 + Т-клеток. Прохладный центрифуге до 4 ° C перед началом протокол.

1. Размораживание 1 флакон (500 000) CD4 + Т-клеток в ванну воды 37 ° C, до тех пор, пока просто растаял лед. Аккуратно перенести 15 мл Конические трубки, содержащих 9 мл подогретым СМИ Розуэлл парк Мемориальный институт-1640 (RPMI 1640), дополнены 10% FCS, именуемый в дальнейшем полный RPMI клетки.
   Примечание: Не позволяйте клетки таять полностью избежать воздействия ДМСО.
2. Центрифуги для 6 мин на 1500 x g и 4 ° C. Отменить супернатант и осторожно приостановить гранулы в 2 мл полной RPMI. Повторите спин вниз, удалить супернатант и осторожно приостановить клетки в 0,5 мл полной RPMI.
3. Подсчет количества ячеек с помощью Горяева. Регулировка плотности суспензии клеток с полным RPMI для пластины 50 000 ячеек в 200 мкл на хорошо раунд 96-луночных нижней плиты.
   Примечание: Из одной замороженные трубы 500K CD4 + Т-клеток, лунках 10 50000 CD4 + Т-клеток в 200 мкл в колодец.
4. Подготовьте магнитные бусы, конъюгированных с человеческих антител анти CD3 и анти CD28 T-активатор.
   1. Аликвота 12,5 мкл человека T-активатор CD3/CD28 бусы на сэмпл ATAC-seq для 1.5 мл. Вымойте бусины с 1 мл раствора 1 x PBS и поместить трубку на магнит за 1 мин.
   2. Тщательно удалить отменить ясно супернатанта, извлеките трубку от магнита и приостановить бисер в 13 мкл завершить RPMI на ATAC-seq сэмпл.
      Примечание: Вычислить количество бисера необходимые основанные на количество выборок ATAC-seq, обрабатывается. Этот протокол требует 12,5 мкл CD3/CD28 бусы на 500000 клеток, которая представляет собой один ATAC-seq образца.
5. Активируйте CD4 + Т-клеток. Сбор 500 000 клеток в 2.1 мл полного среднего RPMI в 15 мл Конические трубки и 12,5 мкл предварительно выстиранные человека T-активатор бусины. Смешайте нежно инвертирование трубки.
6. Осторожно передать стерильные водохранилище и плита 200 мкл клеток с бисером в хорошо раунд 96-луночных днище с помощью многоканальных дозаторов клетки с бисером. Проинкубируйте 48 ч при 37 ° C, 5% CO₂ инкубатора.
7. После инкубации, центрифуга 96-луночных пластина для 8 мин в 423 x g и RT. удалить 100 мкл среды на колодец из 96-луночных пластины, собирая его коническая труба прежде чем выбросить для обеспечения без потери шарик. Ресуспензируйте Пелле ячейки в остальные 100 мкл и собирать все в 1,5 мл.
   Примечание: 10 скважин активированные Т-клеток будут собраны в томе 1 мл.
8. Выполните CD4 + изоляции. Добавьте 50 мкл предварительно выстиранные CD4 конъюгированных бусины 500000 клеток в 1 мл полной RPMI. Объединить бусы и клетки, пипетки. Проинкубируйте втечение 20 мин при температуре 4 ° C в холодильнике. Агитируйте бусы и ячейку смесь каждые 6 минут.
   Примечание: Этот протокол должен использоваться для одного образца 500000 клеток. Внести необходимые коррективы для двух или более образцов 500 000.
9. При завершении инкубации, место трубки на магните для 2 мин снимите и выбросьте супернатанта, когда ясно. Вымойте шарик прыгните клетки путем удаления трубки из магнита, приостановив шарик прыгните клеток в 1 мл PBS + 2% FCS, замена трубки на магните за 1 мин и отбрасывая ясно супернатант. Повторите этот процесс для в общей сложности 3 стирок.
   Примечание: Будьте осторожны, чтобы не отказаться от любой бисер во время мойки.
10. После окончательного вымыть поместить трубку на магните для 1 мин удалить и удалить супернатант и место гранулы на льду. Перейдите к разделу 3 (ATAC-seq).

3. ATAC-seq

Примечание: В этом шаге ядер изолированы от активированных клеток CD4 + T для ATAC-seq. Буфер lysis, используемые в настоящем протоколе была улучшена быть мягче на ядрах, что приводит к более эффективным пищеварение и более качественных результатов. Выполняются все действия центрифугирования в разделе 3 с фиксированным углом центрифуги, поддерживается на 4 ° C. Прохладный центрифуги перед началом протокол.

1. Выполняйте ядер изоляции. Ресуспензируйте бусы и клетки с холодной литического буфера (10 мм трис-HCl, рН 7,4, 10 мм NaCl, 3 MgCl2, полисорбат 20 0,03%). Центрифуга сразу на 500 x g 10 мин при 4 ° C. Снимите и выбросьте супернатант.
2. Выполните Транспозаза реакции. Приостановить действие отдельных ядер лепешка с 50 мкл Tn5 Транспозаза смеси (Таблица 1). Инкубируйте в Термоциклер на 30 минут при 37 ° C 40 ° C крышкой, держа на 4 ° C при полной.
3. После thermocycling немедленно выполнить быстрый настольная центрифуга спин вниз и поместить трубку на магните за 1 мин для удаления бусы из продукта.
4. Передавать четкое супернатант из трубки на магните столбец очистки ДНК. Промойте колонку с 250 мкл буфера PB и дважды с 750 мкл буфера PE. Элюировать образца в 10 мкл буфера. Перейти непосредственно к шагу 3.5.
   Примечание: Этот шаг усиливает фрагментов ДНК с перевязаны адаптеров, здесь называют ATAC-seq библиотеки. Чтобы Мультиплекс нескольких библиотек ATAC-seq для запуска на одном NGS Лейн, используйте неиндексированные грунтовка 1 для всех образцов и различные индексированные 2 праймера для отдельных образцов (Таблица 2). Праймеры используются в рабочей концентрации 1,25 мкм.
5. Настройка первоначального реакции амплификации PCR в свободной от нуклеиназы ПЦР-пробирку, объединяя компоненты в порядке и объеме, указанных в Таблица 3. Уложите Термоциклер ПЦР-пробирку и запустите программу амплификации PCR с велосипедного условия, указанные в таблице 4.
6. Отслеживать реакция, ПЦР. Настройка реакции ПЦР в свободной от нуклеиназы ПЦР-пробирку, объединяя компоненты в порядке и сумме, указанной в таблице 5. Место в машину ПЦР и цикл как указано в таблице 6.
   1. Чтобы определить, что оптимальное количество дополнительного усиления циклов для остальных 45 мкл реакции, создайте участок с номером цикла на оси x и относительной флуоресцирования (РФС) на оси y. Оптимальное количество дополнительного усиления циклов — одну треть количество циклов, которые он принимает для реакции ПЦР для достижения плато.
      Примечание: Мониторинг реакции ПЦР позволяет для определения оптимального числа циклов PCR, требуемой для получения оптимального библиотека фрагмент амплификации при сведении к минимуму GC содержание и размер смещения.
7. Завершите окончательный амплификации PCR оставшиеся 45 мкл реакции PCR. Место ПЦР-пробирку с усиление реакции от шаг 3.5 обратно в Термоциклер и запустить программу, как описано в таблице 7.
   Примечание: Для образцов, обрабатываются как описано в настоящем Протоколе оптимальное общее количество циклов амплификации PCR преисполнена решимости быть 12.
8. После завершения амплификации очищайте библиотеки, используя набор для очистки ПЦР после производителя протокол, элюирующие в 25 мкл буфера.
   Примечание: Усиленные библиотек можно хранить при 4 ° C до 48 ч или замороженные при температуре-20 ° C для длительного хранения.

4. ATAC-seq библиотека анализ качества

Примечание: Важно проверить качество и количество библиотек ATAC-seq до следующего поколения последовательности. Качество и количество библиотек должны оцениваться с использованием коммерчески доступные наборы (см. Таблицу материалы).

1. Оценить качество и количество библиотек ATAC-seq, используя микрофлюидика-платформа для калибровки, количественной оценки и контроля качества ДНК. Смотрите Рисунок 2 представителя качества оценки результатов.
   Примечание: Концентрация ATAC-seq библиотек должна быть > 1 нг/мкл для получения качественных результатов секвенирования. На среднем, 30 Нм в 25 мкл был получен.

5. последовательность и анализ данных

Примечание: Этот анализ конвейер позволяет пользователям контролировать качество чтения карт процедуры, изменить координаты для экспериментального дизайна и призываем пиков течению анализа. Ниже приведены команды линии и объяснение исполнения. Пакет анализа данных доступен в (https://github.com/s18692001/bulk_ATAC_seq).

1. Последовательность подготовленный библиотек на следующего поколения секвенсор для чтения средняя глубина 42 миллиона чтений на сэмпл.
2. Оцените качество чтения последовательности, проверяя файлы, созданные FastQC¹² программного пакета с помощью команды:
   fastqc -o < каталог с выходными данными >< fastq_file >
3. Трим основы читает Trimmomatic¹³ программного обеспечения, при необходимости, как определено FastQC проверки качества, используя команду (для пары закончился):
   Java-jar < путь к trimmomatic jar-файл > PE < input1 >< input2 >< парных output1 >< непарных output1 >< паре вып.2 >< непарных вып.2 > HEADCROP: < культур баз >
4. Выровняйте читает генома человека ссылки (hg38), Bowtie2¹⁴ программного обеспечения:
   bowtie2 - x < ссылка геном > -1 < входной пары 1 >< входного пара 2 > -S < выходной SAM файл >
   Примечание: Аргумент - x для базовое имя индекса для ведения генома, и -S для вывода формата Сэм.
5. Проверите thequality, сопоставленных с помощью пакета flagstat Samtools¹⁵ гласит:
   SAMtools flagstat < BAM файл >
6. Сортировать сопоставленных читает файл и удалить дубликаты, с помощью инструмента¹⁶ Picard:
   Java-jar picard.jar SortSam ввода = < имя входного файла SAM > вывода = < имя файла вывода отсортированы BAM > SORT_ORDER = координат» и «java-jar picard.jar MarkDuplicates ввода = < отсортированных BAM файл > вывода = < BAM выходной файл без дубликатов > REMOVE_DUPLICATES = TRUE
7. Файл индекса BAM, обрезать неиспользуемые хромосома читает и сдвиг координаты для экспериментальной причине ATAC-seq¹⁷:
   Java-jar picard.jar BuildBamIndex ввода = < BAM файл >
   SAMtools idxstats < Input BAM файл > | вырезать -f 1 | grep - v chrY | grep - v ЦПЧМ | grep - v chrUn | xargs samtools посмотреть -b < Input BAM файл >>< вывод обрезается BAM файл >
   bedtools bamtobed -i < Input подстриженные BAM файл >>< вывод обрезается кровать файл >
   awk ' начать {OFS = «\t»}; {Если ($6 == «+») печать $1, $2 + 4, $3 + 4, $4, $5, $6; напечатать еще $1, $2-5, 3-5 $, $4, $5, $6}' < Input подстриженные кровать файл >< Trimmed смещается кровать файл >
8. Удаление чтений, которые сдвигаются, чтобы негативные координации:
   awk «{если ($2 > 0) напечатать «\t» $2 «\t» $3 «\t» $4 «\t» $5 $1 «\t» $6}» < Input кровать файл >< файл кровать координации non отрицательного вывода >.
9. Преобразуйте файл кровати BAM файл для следующих DiffBind¹⁸ анализа:
   bedtools bedtobam -i < Input кровать файл > -g < ссылкой генома >< BAM выходной файл >
10. Выполнить вызов пик DiffBind¹⁸ программного пакета:
    macs2 callpeak -t < Input BAM файл > -f BAM -g hs - nomodel--nolambda--держать dup все--вызов саммиты--outdir < путь к каталогу выходных > - n < имя > -B - q 0,01--БДГ--сдвиг -100--extsize 200
    Примечание: После фильтрации, ожидать, что медиана 37 миллионов чтений на сэмпл. Митохондриальная ДНК загрязнение будет варьироваться от 0,30% – 5,39% (1,96% в среднем). Там будет низкий уровень умножить сопоставленных гласит (6,7% – 56%, 19% в среднем), и относительно высокий процент использования ядерных читает (60% – 92%, 79% в среднем).

Результаты

От 15 мл свежей цельной крови этот протокол генерирует в среднем 1 миллион клеток CD4 + T. Эти могут быть заморожены для последующей обработки или использовать немедленно. Жизнеспособность клеток CD4 + T, свежие или талой, был последовательно > 95%. Этот метод изоляции клеток CD4 ...

Обсуждение

Измененный Протокол ATAC-seq, представленные в этой статье обеспечивает воспроизводимость результатов с минимальными митохондриальной ДНК загрязнения. Протокол была использована для успешно характеризуют хроматина архитектура человека первичного получения¹⁰, человека мон...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1X PBS, Sterile	Gibco	10010023	Can use other comparable products.
5810/5810 R Swing Bucket Refrigerated Centrifuge with 50 mL, 15 mL, and 1.5 mL Tube Buckets	Eppendorf	22625501	Can use other comparable products.
96 Well Round Bottom Plate	Thermo Scientific	163320	Can use other comparable products.
Agilent 4200 Tape Station System	Agilent	G2991AA	Suggested for quality assessment.
Cryotubes	Thermo Scientific	374081	Can use other comparable products.
DMSO	Sigma	D8418	Can use other comparable products.
Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28	Invitrogen Life Technologies	11131D	Critical Component
Dynabeads Untouched Human CD4 T Cells Kit	Invitrogen Life Technologies	11346D	Critical Component
Dynamagnet	Invitrogen Life Technologies	12321D	Critical Component
FCS	Gemini Bio Products	100-500	Can use other comparable products.
High Sensitivity DNA Kit	Agilent	50674626	Suggested for quality assessment.
Magnesium Chloride, Hexahydrate, Molecular Biology Grade	Sigma	M2393	Can use other comparable products.
MinElute PCR Purification Kit (Buffer PB, Buffer PE, Elution Buffer)	Qiagen	28004	Critical Component
Mr. Frosty	Thermo Scientific	5100-0001	Can use other comparable products.
NaCl, Molecular Biology Grade	Sigma	S3014	Can use other comparable products.
NEBNext High Fidelity 2X PCR Master Mix	New England BioLabs	M0541	Critical Component
Nextera DNA Library Preparation Kit (2X TD Buffer, Tn5 Enzyme)	Illumina	FC1211030	Critical Component
Nuclease Free Sterile dH20	Gibco	10977015	Can use other comparable products.
Polysorbate 20 (Tween20)	Sigma	P9416	Can use other comparable products.
PowerUp SYBR Green Master Mix	Applied Biosystems	A25780	Critical Component
Precision Water Bath	Thermo Scientific	TSGP02	Can use other comparable products.
QIAquick PCR Purification Kit	Qiagen	28104	Critical Component
Qubit dsDNA HS Assay Kit	Invitrogen Life Technologies	Q32851	Suggested for quality assessment.
Qubit FlouroMeter	Invitrogen Life Technologies	Q33226	Suggested for quality assessment.
Rosette Sep Human CD4+ Density Medium	Stem Cell Technologies	15705	Critical Component
Rosette Sep Human CD4+ Enrichment Cocktail	Stem Cell Technologies	15022	Critical Component
RPMI-1640	Gibco	11875093	Can use other comparable products.
Sterile Resevoir	Thermo Scientific	8096-11	Can use other comparable products.
T100 Thermocycler with Heated Lid	BioRad	1861096	Can use other comparable products.
Tris-HCL	Sigma	T5941	Can use other comparable products.