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要約

この記事では、軟骨細胞圧縮のための空気作動性マイクロ流体デバイスを製造し、特徴付けるための詳細な方法を提供します。

要約

機械的刺激は、細胞や組織の生物学的機能を調節することが知られている。最近の研究は、圧縮応力が成長プレート軟骨アーキテクチャを変更し、子供の長い骨の成長変調をもたらすことを示唆しています。骨の成長における圧縮応力の役割を決定するために、我々は、アルギン酸ヒドロゲルシリンダに埋め込まれた成長プレート軟骨細胞を動的(または静的に)圧縮するために、空気圧によって作動するマイクロ流体装置を作成した。この記事では、このデバイスを製造および特性認識するための詳細な方法について説明します。私たちのプロトコルの利点は:1)単一のプラットフォームで5つの技術的な反復で圧縮応力の5つの異なる大きさを生成することができ、2)従来の光顕微鏡を介して細胞形態を視覚化することが容易であり、3)細胞は迅速に単離することができます下流アッセイを容易にする圧縮後のデバイスから、および4)プラットフォームは、ヒドロゲルで成長することができる任意の細胞タイプのメカノバイオロジーを研究するために適用することができます。

概要

マイクロエンジニアリングされたプラットフォームは、物理的および化学的微小環境1、2、3の両方の動的制御を可能にするため、分子、細胞、組織レベルの生物学を研究するための貴重なツールです。,4,5,6,7,8.したがって、複数の仮説を厳密に制御された方法で同時にテストすることができる。成長板軟骨の場合、成長板軟骨9、10、11上の作用を通じて骨の成長を調節する上で圧縮応力の重要な役割の証拠が増加している。 12,13,14,15,16,17,18,19,20, 21,22,23,24,25.しかし、圧縮応力の作用機序(特に、ストレスが成長プレートにおける軟骨細胞柱の形成を導く方法)は、あまり理解されていない。

このプロトコルの目的は、成長プレート軟骨細胞におけるメカノバイオロジーのメカニズムを解明するために、空気作動性マイクロ流体軟骨細胞圧縮装置26を作成することである(図1a-c)。装置は2つの部分から成っている:空気作動の単位およびアルギネートのゲルの構造。マイクロ流体空気作動ユニットは、フォトおよびソフトリソグラフィに基づいてポリジメチルシロキサン(PDMS)を使用して製造されます。この単位は直径に基づいて異なって膨張させることができる薄いPDMSの膜気球の5 x 5配列を含んでいる。アルギン酸ゲル構造体は、5 x 5配列のアルギン酸ゲルシリンダに埋め込まれた軟骨細胞から構成され、アルギン酸軟骨細胞構造全体が作動ユニットで組み立てられる。アルジンゲル構造体は、空気圧膨張PDMSバルーンによって圧縮される(図1b)。マイクロ流体デバイスは、PDMSバルーン径の違いに基づいて、単一のプラットフォームで5つの異なるレベルの圧縮応力を同時に生成できます。したがって、複数の圧縮条件下で軟骨細胞メカノバイオロジーのハイスループット試験が可能である。

このプロトコルに記載されているマイクロ流体デバイスは、外部固定装置14、21、23およびマクロスコピック圧縮装置16などの従来の圧縮装置に対して多くの利点を有する。19歳,27歳,28軟骨細胞メカノバイオロジーを研究するための:1)マイクロ流体デバイスは、マクロスコッキング圧縮装置よりもサンプルの量が少ないため、費用対効果が高く、2)マイクロ流体装置は複数のテストが可能であるため、時間効果が高い圧縮条件同時に、3)マイクロ流体装置は、マイクロチャネル内の限られた混合に基づいて化学物質の濃度勾配を形成することにより、機械的および化学的刺激を組み合わせることができ、4)様々な顕微鏡検査技術(時間経過)顕微鏡と蛍光共焦点顕微鏡)は、透明なPDMSで作られたマイクロ流体デバイスで適用することができます。

Moraes et al.7,29の方法を採用し、単一のデバイスで異なる圧縮応力レベルを作成し、軟骨細胞圧縮のハイスループットメカノバイオロジー研究を可能にした。我々のアプローチは、3次元(3D)培養環境を必要とする細胞(例えば、軟ヶ月細胞)や細胞を圧縮した後の生物学的アッセイに適しています。一部のマイクロ流体細胞圧縮装置は、2次元(2D)基板30、31、32で培養した細胞を圧縮できるが、2D培養軟次郎であるため軟化細胞には使用できない。脱分化。光重合ヒドロゲル7、33の3D培養細胞を圧縮するためのマイクロ流体プラットフォームがありますが、光重合から細胞を分離するため、圧縮実験後の細胞の分離には限界があります。ヒドロゲルは容易ではありません。さらに、細胞に対する紫外線(UV)暴露および写真架橋イニシエータの影響を評価する必要があるかもしれません。対照的に、我々の方法は、アルギン酸ヒドロゲルがカルシウムキレート器によって迅速に脱重合することができるので、ポスト生物学的アッセイのための圧縮実験後の細胞の迅速な単離を可能にする。このプロトコルでは、詳細なデバイス製造および特性分類方法について説明します。マイクロ流体軟骨細胞圧縮装置を製造するための簡単な手順を図2に示す。

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プロトコル

注:このプロトコルのすべてのステップのために手袋やラボコートなどの個人用保護具(PPE)を着用してください。

1. マスターモールド製作

注: ヒュームフードでステップ 1.1 ~ 1.3 を実行します。

  1. ガラス処理
    注:ステップ1.1の場合は、フェイスシールド、手袋、ラボコートを着用してください。
    1. 硫酸(H2SO4)と過酸化水素(H2O2)を3:1の体積比で混合してピラニア溶液(60mL)を作ります。
      注意:爆発の危険性があるため、同じヒュームフードにピラニア溶液とアセトンを使用しないでください。
    2. ピラニア溶液にガラス板(50.8mm×76.2mm×1.2mm)を40°Cで30分間置きます。
    3. ガラス板を脱イオン水(diH2 O)ですすいでください。
    4. ガラス板を室温でアセトンに10分間置きます。
    5. ガラス板をイソプロパノールですすし、窒素(N2)ガスで乾燥させます。
    6. ガラス板を200°Cで20分間熱い皿で焼きます。後続のすべてのベーキングステップは、ホットプレートを使用します。
  2. ガラス板上のSU-8種層形成
    1. 使い捨てピペットでガラス板にSU-8-5を広げ、プレートの表面積の約2/3をカバーします。
    2. 35s(初期回転サイクル)の500 rpmでSU-8 5フォトレジストでガラスプレートを回転させ、スピンコーターを使用して40s(最終回転サイクル)で2,500 rpmを回転させます。後続のすべてのスピンコーティングステップには、同じ初期スピンサイクルが含まれます。
    3. SU-8 5コーティングガラスプレートを65°Cで2分間焼き、その後95°Cで5分間焼きます。
    4. SU-8 5コーティングガラス板を紫外線(60mW/cm2、UVランプとフォトマスク間の距離は20cm、紫外線エネルギーの総量=60mJ/cm2)を1sにします。
      注: UV 露出時間は、使用する UV 光の出力に応じて調整する必要があります。
    5. SU-8 5コーティングガラスプレートを65°Cで2分間、95°Cで5分間焼きます。
    6. 焼きガラス板をSU-8開発者に2分間置きます。
    7. SU-8 5コーティングガラスを180°Cで20分間焼きます。
  3. フォトリソグラフィーを用いてSU-8チャンネルパターン製作(図2aステップ1-3)
    1. SU-8 5シードガラスプレートにSU-8 100を注ぎ、プレートの表面積の約2/3をカバーします。
    2. 38 s (≥ 90 μm の厚さ) で SU-8 100 でガラスプレートを回転させます。
    3. SU-8 100コーティングガラスプレートを65°Cで10分間焼き、その後95°Cで30分間焼きます。SU-8 100がこの手順の後にまだ粘着性がある場合は、SU-8 100が非粘着性になるまで、95°Cで長い時間ガラス板を焼きます。
    4. 高解像度のマイクロチャネルフォトマスク(25,400 dpi、補足図1を参照)をSU-8 100コーティングガラス板に置き、フォトマスク覆われたガラス板を4秒(紫外線エネルギーの総量=240mJ/cm2)の紫外線にあしらいます。
      注: UV 露出時間は、使用する UV 光の出力に応じて調整する必要があります。
    5. ガラス板からフォトマスクを取り出し、65°Cで2分間、20分間95°Cで焼きます。
    6. 焼きガラス板を容器に入れ、アルミホイルで包んで光を遮断し、一晩硬化させます。
    7. SU-8開発者のガラス板上のSU-8 100チャンネルパターンを15分間開発します。
    8. SU-8パターンガラス板(マスターモールド)をイソプロピルアルコールで洗浄し、N2ガスで乾燥させます。このプロセス中に白色粒子が残っている場合は、ステップ7を5分間繰り返します。

2. 空気作動ユニット

  1. マイクロチャネル層(レイヤ1)
    注: ヒュームフードでステップ 2.1.1 ~ 2.1.2 を実行します。
    1. (トリデカフルオロ-1,1,2-テトラヒドロキジル)-1-トリクロロシランの200 μLをカバースリップに落とし、マスターモールドで真空チャンバに入れます。
    2. チャンバー内で2分間真空を適用し、金型のサイレン化のために6時間(または一晩)待ちます。
    3. PDMSを10:1(プレポリマー:硬化剤)で5分間混ぜます。
      注:後続のすべてのPDMS鋳造工程には、同じプレポリマーおよび硬化剤重量比(10:1)が含まれています。
    4. マスターモールドにPDMSを注ぎ、30分間真空チャンバにドガPDMSを注ぎます。
    5. 透明フィルムの一部とサンドイッチPDMS。
    6. ガラス板、フォームパッド、プレキシガラスプレートで上記のサンドイッチアセンブリをクランプします(図2aステップ4)。
    7. 6時間80°CのオーブンでPDMSを硬化させます。
    8. PDMS層(レイヤ1)を透明フィルムで挟んだ構造から分離する(図2aステップ5)。
    9. プラズマクリーナーを使用して、レイヤ1とクリーンなガラス板(ガラス板1;50.8mm×76.2mm×1.2mm)の表面を1分間活性化します。
      注:プラズマ洗浄時間は、使用済みのプラズマクリーナーの電源によって異なる場合があります。
    10. ボンド層1をガラス板1上に置き、80°Cのオーブンに30分間入れます。
    11. 透明フィルムをレイヤ 1 から取り外します。
  2. 薄いPDMS膜(層2)
    1. 1分間1,000rpmの透明フィルム上のスピンコート未硬化PDMSを1分間、60μm厚のPDMS層を得た。
    2. 部分的に20〜30分間80°CでオーブンでスピンコーティングされたPDMS(層2)を治します。
    3. プラズマクリーナーを使用して、ガラス板1とレイヤ2のレイヤ1を1分間アクティブにします。
      注:プラズマ洗浄時間は、使用済みのプラズマクリーナーの電源によって異なる場合があります。
    4. レイヤ2をレイヤ1に接し、一晩80°Cのオーブンに入れます。
  3. チューブブロック
    1. 金属チューブをペトリ皿の上に垂直に置きます。
    2. 皿にPDMSをそっと注ぎ、金属管の約3/4を沈める。
    3. 60 °CでオーブンでPDMSを6時間(または一晩)硬化させます。
    4. 1本の金属管を含むPDMSブロックを切ります。
    5. 入り込み用レイヤ 2 の穴をパンチします。
    6. プラズマクリーナーを使用してPDMSブロックとレイヤ2を1分間有効にします。
    7. PDMSブロックをレイヤ2の入り込み部分に取り付け、作動部全体をオーブンに一晩80°Cに入れます。

3. アルギネート軟骨細胞(またはビーズ)の構造体

  1. アミノシラン化ガラス板
    1. ダイヤモンドスクライバーを使用して、ガラス板(50.8mm×76.2mm×1.2mm)を2枚のハーフサイズのガラス板(50.8mm×38.1mm×1.2mm)に切ります。
    2. ガラス板を0.2M塩化水素(HCl)に入れ、一晩振ります(例えば、55rpm)。
    3. ガラス板をdiH2Oですすいで下します。
    4. 0.1M水酸化ナトリウム(NaOH)で1時間55rpmでガラス板を振り、diH2Oですすいでください。
    5. ガラス板を1%(v/v)3-アミノプロピルトリメトキシシラン(APTES)で55rpmで1時間振り、diH2Oですすいでください。
    6. アミノシラミ化ガラス板を一晩ヒュームフードで乾かします。
  2. アルギネートゲル構造のアガロースゲル金型
    1. 5%(w/v)アガロースと200mM塩化カルシウム(CaCl2)をdiH2Oに混ぜます。
    2. アガロースゲル溶液を電子レンジ(またはホットプレート)で沸騰させます。沸騰時間は、アガロースゲル溶液の体積と電子レンジのパワー(またはホットプレートの温度)によって異なります。
    3. ゆでたアガロースゲル溶液をアルミ金型に注ぎ(補足図S2参照)、ガラス板で挟みます。
    4. 5分間待って、アルミニウム金型から固化アガロースゲルを成形解除します。
  3. 成長プレート軟骨細胞収穫
    1. 新生児マウスの後肢から成長プレートを分離する。
    2. 成長プレートを37°Cおよび8%の二酸化炭素(CO2)でインキュベーターに3時間0.25%コラゲナーゼの1mLに入れ、細胞外マトリックス(ECM)を除去する。
    3. 消化されたサンプルを125 x gで5分間遠心分離し、軟骨細胞ペレットを作り、サンプルから上清を取り除きます。ここで、1 x gは重力の加速度である。
    4. ダルベッコの改変イーグル培地(DMEM)の1mLで軟骨細胞ペレットを再中断する。
    5. セル カウンタを使用して DMEM の軟骨髄細胞の数をカウントします。
    6. 125 x gで5分間DMEMの軟骨細胞を遠心分離し、軟骨細胞ペレットを再び作り、サンプルから上清を取り除きます。
    7. 任意に、2 μMカルセインAMを含む軟骨細胞培養培養培養培養剤(CCM)34に軟骨細胞ペレットを再ステーペンスし、30分間37°Cで試料をインキュベートし、ステップ3.3.6を繰り返しステップ3.3.8に移動する。
    8. 軟骨細胞ペレットをCCMの所望の体積で再ステーペンし、使用前に37°Cおよび8%CO2でインキュベーターに保管してください。
  4. アルギネート軟骨細胞(またはビーズ)の構築物(図2c)
    1. リン酸緩衝生理食塩水(PBS)に1.5%(w/v)のアルギン酸塩をスルフォ-NHSの5mg/mL、1-エチル-3の10mg/mL(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジミド塩酸塩(EDC)を混合する。
    2. アルギン酸ゲル溶液の1 mLに8 x 106軟約子を加え(または1μm径蛍光ビーズ(542/612 nm)の3μLをアルギン酸ゲル溶液の1mL(0.3%(v/v))で加えます。
    3. ステップ3.1で製造されたアミノシラン化ガラス板上にアルギン酸軟骨細胞(またはビーズ)溶液の150 μLを配置します。
    4. アルギン酸ゲル溶液をアガロースゲル型で3分間覆います。
    5. カミソリの刃でアガロースゲル金型から溢れる過剰なアルギネートゲル溶液を取り除き、アガロースゲル型を取り除きます。次いで、円筒状のアルギネート軟骨細胞(またはビーズ)の構築物がアミノシラン化ガラス板上で得られる。
    6. アルギン酸軟骨細胞構造体を架橋液(diH2 Oで50 mM CaCl2/140 mMNaCl)に1分間置き、さらなる重合を行う。

4. デバイスアセンブリ(図2d)

注:PDMSスペーサーと3Dプリントクランプは別途用意する必要があります。

  1. 作動装置のレイヤ 2 の 4 つのコーナーに、1 mm の厚さの PDMS スペーサを 4 つ見つけます。
  2. 700 μL の CCM を配置して、レイヤ 2 の空気室をカバーします。
  3. アルギネート軟骨細胞(またはビーズ)をレイヤ2に配置し、構成物を空気室に慎重に位置合わせします。
  4. 3Dプリントクランプ(図1c)でデバイスをクランプします。

5. デバイスの作動

  1. エアポンプの出口(材料の表を参照)を、シリコンチューブでソレノイドバルブの入口に接続します。
  2. ソレノイドバルブの出口を、組み立てられたデバイスの入口にシリコンチューブで接続します。
  3. ソレノイドバルブをファンクションジェネレータで接続します。
  4. ファンクションジェネレータによって生成された正方形波(例えば、1 Hz)でソレノイドバルブを操作します。
  5. エアポンプをオンにして、デバイスを空気圧で作動させます。

6. デバイス内の軟内細胞のイメージング

注:良好な画質を得るために、拡大されたPDMSバルーンおよび空気室は光学画像を歪めることができるので、ガラス板2を通してアルギン酸ゲル中の画像軟化症(または蛍光ビーズ)。反転顕微鏡を使用してイメージングを行う場合は、ガラス板2が下向きに向かるように装置をセットアップする必要があります。

  1. 前のセクションに示すように軟部細胞(または蛍光ビーズ)で装置を準備する。
  2. コンドロサイト(または蛍光ビーズ)のz-stack画像を、圧縮前および圧縮下の共焦点顕微鏡で撮影する。使用する共焦点イメージング システムの被写界深度に基づいてzステップ サイズを選択します。
  3. 軟内細胞の高さ(またはアルギン酸ビーズ構造)は、以前の文献26,35に示す自動画像処理方法で測定することができる。

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結果

この記事では、マイクロ流体軟骨細胞圧縮装置製造の詳細な手順を示しています(図2)。このデバイスには、5 x 5 の円筒形アルギネート軟骨細胞構造体が含まれており、これらの構成物は 5 つの異なる大きさの圧縮で圧縮できます (図 1、図 3、図 4)。空気マイクロチャネルの高さは約90 μmであり、PDMSバル...

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ディスカッション

成長プレート軟骨細胞に対する圧縮応力の影響をテストするために、3D用アルギン酸ヒドロゲル足場の軟骨細胞に様々なレベルの圧縮応力を適用するマイクロ流体軟骨細胞圧縮装置(図1)を開発した。高スループットの方法で文化。他の研究者が当社のデバイスを採用したり、同様のデバイスを開発したりするのを支援するために、このプロトコルの記事でデバイス製造?...

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開示事項

著者は何も開示していない。

謝辞

クリストファー・モラエス博士とスティーブン・A・モリン博士のデバイス設計と製作支援に感謝します。この研究は、ネブラスカ大学リンカーン校(UNL)とネブラスカ大学医療センター(UNMC)からのヒト健康補助金のバイオエンジニアリングと、NIH/NIAMSからAR070242を助成しました。私たちは、ネブラスカ大学医療センターの高度顕微鏡コア施設のジャニス・A・テイラーとジェームズ・R・タスカスに、共焦点顕微鏡検査の支援を提供してくれたことに感謝します。

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資料

NameCompanyCatalog NumberComments
(3-Aminopropyl)triethoxysilane (ATPES)Sigma-Aldrich741442-100ML
(Tridecafluoro-1, 1, 2, 2-Tetrahydrooctyl)-1-TrichlorosilaneUnited Chemical TechnologiesT2492-KG
Acrylic sheetMcMaster-Carr8560K354
Air pumpSchwarzer PrecisionSP 500 EC-LC4.5V DCWe used the model purchased in 2015. The internal design and performance of air pump (SP 500 EC-LC) changed in early 2016. Also, air pump performance has changed in the course of time. Thus, air pressure generated by an SP 500 EC-LC air pump should be calibrated before use.
Alginate powderFMC CorporationPronova UP MVG
Barb Straight Connectors (Metal tube)PneumadyneEB40-250
Calcein AMInvitrogenC3100MP
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Gibco11960-044
Dyed red aqueous fluorescent particlesThermo Fisher ScientificR0100
EDC (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride)Thermo Fisher Scientific22980
Foam padGRAINGERItem # 5GCE8
Function / Arbitrary Waveform GeneratorKeysight Technologies33210A
Hydrochloric acidFisher ChemicalA144-500
Hydrogen peroxideFisher BioReagentsBP2633500
Isopropyl alcoholBDH1174-4LPVWR
Microscope slidesThermo Fisher Scientific22-267-013
Plasma cleanerHarrick PlasmaPDC-001
Polydimethylsiloxane (PDMS)Dow Corning184 SIL ELAST KIT 0.5KG
Power supplyKeysight TechnologiesE3630A
SeaKem LE AgaroseLonza50004
Sodium hydroxideFisher ChemicalS318-1
Solenoid manifoldPneumadyneMSV10-1
Solenoid valvePneumadyneS10MM-30-12-3
Spin coaterLaurell TechnologiesWS-650Mz-23NPPB
SU8 DeveloperMicroChem Corp.Y020100 4000L1PE
SU8-100MicroChem Corp.Y131273 0500L1GL
SU8-5MicroChem Corp.Y131252 0500L1GL
Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide)Thermo Fisher Scientific24510
Sulfuric acidEMD MilliporeMSX12445

参考文献

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