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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Questo articolo fornisce metodi dettagliati per la fabbricazione e la caratterizzazione di un dispositivo microfluidico azionato retice per la compressione condrocitica.

Abstract

Gli stimoli meccanici sono noti per modulare le funzioni biologiche di cellule e tessuti. Recenti studi hanno suggerito che lo stress compressivo altera l'architettura della cartilagine della piastra di crescita e si traduce nella modulazione della crescita di ossa lunghe di bambini. Per determinare il ruolo dello stress compressivo nella crescita ossea, abbiamo creato un dispositivo microfluidico azionato dalla pressione pneumatica, per comprimere dinamicamente (o staticamente) i condrociti delle lame di crescita incorporati nei cilindri idrogelali algonati. In questo articolo vengono descritti i metodi dettagliati per la fabbricazione e la caratterizzazione di questo dispositivo. I vantaggi del nostro protocollo sono: 1) Cinque diverse magnitudini di stress compressivo possono essere generate su cinque repliche tecniche in un'unica piattaforma, 2) È facile visualizzare la morfologia cellulare tramite un microscopio luminoso convenzionale, 3) Le cellule possono essere rapidamente isolate dal dispositivo dopo la compressione per facilitare i saggi a valle, e 4) La piattaforma può essere applicata per studiare la meccanobiologia di qualsiasi tipo di cellula che può crescere in idrogel.

Introduzione

Le piattaforme microingegnerizzate sono strumenti preziosi per studiare la biologia molecolare, cellulare e a livello tissutale perché consentono il controllo dinamico dei microambienti fisici e chimici1,2,3 ,4,5,6,7,8. Pertanto, più ipotesi possono essere testate contemporaneamente in modo strettamente controllato. Nel caso della cartilagine della piastra di crescita, ci sono sempre più prove di un ruolo importante di stress compressivo nella modulazione della crescita ossea attraverso l'azione sulla cartilagine della piastra di crescita9,10,11, 12,13,14,15,16,17,18,19,20, 21,22,23,24,25. Tuttavia, il meccanismo d'azione dello stress compressivo – in particolare, come lo stress guida la formazione di colonne condrociti nella piastra di crescita – è poco compreso.

L'obiettivo di questo protocollo è quello di creare un dispositivo di compressione condrocito microfluidico pneumaticamente azionante26 per chiarire i meccanismi di meccanobiologia nei condrociti della piastra di crescita (Figura 1a-c). Il dispositivo è costituito da due parti: l'unità di azionamento pneumatico e il costrutto gel algerato. L'unità di azionamento pneumatico microfluidico è fabbricata utilizzando polidimetilsiloxane (PDMS) basato sulla litografia foto e soft. Questa unità contiene una matrice 5 x 5 di sottili palloncini a membrana PDMS che possono essere gonfiati in modo diverso in base ai loro diametri. Il costrutto di gel alginato è costituito dai condrociti incorporati in una matrice 5 x 5 di cilindri di gel alginato, e tutti i costrutti algerino-condrocito sono assemblati con l'unità di azionamento. I costrutti di gel algerino sono compressi dai palloncini PDMS gonfiati pneumaticamente (Figura 1b). Il dispositivo microfluidico può generare contemporaneamente cinque diversi livelli di stress compressivo in un'unica piattaforma in base alle differenze nel diametro del palloncino PDMS. Pertanto, è possibile un test ad alto throughput di condrocite meccanobiologia in più condizioni di compressione.

Il dispositivo microfluidico descritto in questo protocollo ha molti vantaggi rispetto al dispositivo di compressione convenzionale come fissatori esterni14,21,23 e dispositivi di compressione macroscopica16, 19 del 12 , 27 mi lapiùdel , 28 per lo studio della condrocite meccanobiologia: 1) Il dispositivo microfluidico è conveniente perché consuma un volume di campioni inferiore rispetto al dispositivo di compressione macroscopica, 2) Il dispositivo microfluidico è efficace nel tempo perché può testare più condizioni di compressione simultanea, 3) Il dispositivo microfluidico può combinare stimoli meccanici e chimici formando un gradiente di concentrazione di sostanze chimiche basate sulla miscelazione limitata nei microcanali e 4) varie tecniche di microscopia (time-lapse microscopia e fluorescenza microscopia confocale) possono essere applicate con il dispositivo microfluidico in PDMS trasparente.

Abbiamo adottato e modificato il metodo di Moraes et al.7,29 per creare diversi livelli di stress compressivo in un unico dispositivo per consentire studi meccanobiologi ad alto throughput sulla compressione dei condrociti. Il nostro approccio è appropriato per le cellule (ad esempio, condrociti) che necessitano di ambiente di coltura tridimensionale (3D) e per i saggi biologici dopo la compressione delle cellule. Sebbene alcuni dispositivi di compressione delle cellule microfluidiche siano in grado di comprimere le cellule coltivate su substrati bidimensionali (2D)30,31,32, non possono essere utilizzati per i condrociti perché i condrociti coltivati in 2D disdifferenziare. Esistono piattaforme microfluidiche per la compressione di cellule coltivate 3D in idrogel fotopolimerizzati7,33, ma sono limitate nelle cellule di isolamento dopo esperimenti di compressione perché isolando le cellule da fotopolimerizzati idrogel non è facile. Inoltre, potrebbe essere necessario valutare gli effetti dell'esposizione agli ultravioletti (UV) e degli initatori foto-crosslinking sulle cellule. Al contrario, il nostro metodo consente un rapido isolamento delle cellule dopo esperimenti di compressione per saggi post-biologici perché gli idrogel alginati possono essere depolimerizzati rapidamente dai chelatori di calcio. I metodi dettagliati di fabbricazione e caratterizzazione del dispositivo sono descritti in questo protocollo. Nella figura 2è illustrata una breve procedura per la fabbricazione del dispositivo di compressione dei condrociti microfluidici.

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Protocollo

NOTA: Indossare dispositivi di protezione personale (PPE) come guanti e camice da laboratorio per ogni fase di questo protocollo.

1. Fabbricazione di stampi a master

NOTA: Eseguire il passaggio 1.1 - 1.3 in un cofano di fumi.

  1. Trattamento del vetro
    NOTA: Indossare uno scudo per il viso, guanti e un camice da laboratorio per il passaggio 1.1.
    1. Fare la soluzione Piranha (60 mL) mescolando acido solforico (H2SO4) e perossido di idrogeno (H2O2) con un rapporto di volume di 3:1.
      AGGIORNAMENTO: Non utilizzare la soluzione Piranha e l'acetone nella stessa cappa di fumi a causa del pericolo di esplosione.
    2. Mettete una lastra di vetro (50,8 mm , 76,2 mm e 1,2 mm) nella soluzione Piranha per 30 min a 40 gradi centigradi.
    3. Sciacquare la lastra di vetro con acqua deionizzata (diH2O).
    4. Mettere la lastra di vetro in acetone a temperatura ambiente per 10 min.
    5. Sciacquare la lastra di vetro con l'isopropanolo e asciugarla con gas di azoto (N2).
    6. Cuocere la lastra di vetro a 200 gradi centigradi per 20 min su una piastra calda. Tutte le fasi successive di cottura utilizzano una piastra calda.
  2. Formazione dello strato di semi SU-8 sulla lastra di vetro
    1. Stendere SU-8 5 sulla lastra di vetro con una pipetta usa e getta per coprire circa 2/3 della superficie della piastra.
    2. Girare la lastra di vetro con SU-8 5 fotoresists a 500 rpm per 35 s (ciclo di filatura iniziale) e poi 2.500 rpm per 40 s (ciclo di filatura finale) utilizzando un rivestimento di spin. Tutte le successive fasi di rivestimento di rotazione includono lo stesso ciclo di filatura iniziale.
    3. Cuocere la lastra di vetro rivestita SU-8 5 a 65 gradi centigradi per 2 min e poi a 95 gradi centigradi per 5 min.
    4. Esporre la lastra di vetro rivestita SU-8 5 alla luce UV (60 mW/cm2, la distanza tra la lampada UV e la fotomaschera è di 20 cm, la quantità totale di energia luminosa UV , 60 mJ/cm2) per 1 s.
      NOTA: il tempo di esposizione ai raggi UV deve essere regolato in base alla potenza di una luce UV utilizzata.
    5. Cuocere la lastra di vetro rivestita SU-8 5 a 65 gradi centigradi per 2 min e a 95 gradi per 5 min.
    6. Posizionare la lastra di vetro al forno nello sviluppatore SU-8 per 2 min.
    7. Cuocere il VETRO rivestito SU-8 5 a 180 gradi centigradi per 20 min.
  3. Fabbricazione di pattern di canale SU-8 con fotolitografia(Figura 2a Passo 1-3)
    1. Versare il SU-8 100 sulla lastra di vetro di semi SU-8 5 per coprire circa 2/3 della superficie della piastra.
    2. Girare la lastra di vetro con SU-8 100 a 3.000 giri/m per 38 s (spesso 90 m).
    3. Cuocere la lastra di vetro rivestita SU-8 100 a 65 gradi centigradi per 10 min e poi a 95 gradi centigradi per 30 min. Se SU-8 100 è ancora appiccicoso dopo questa procedura, cuocere la lastra di vetro per un tempo più lungo a 95 gradi centigradi fino a quando SU-8 100 diventa antiappicio.
    4. Posizionare una fotomaschera a microcanale ad alta risoluzione (25.400 dpi, vedere Figura supplementare 1) sulla lala di vetro rivestita SU-8 100 ed esporre la lastra di vetro coperta da fotomaschera alla luce UV per 4 s (quantità totale di energia luminosa UV - 240 mJ/cm2).
      NOTA: il tempo di esposizione ai raggi UV deve essere regolato in base alla potenza di una luce UV utilizzata.
    5. Togliere la fotomaschera dalla lastra di vetro e cuocere la lastra di vetro a 65 gradi centigradi per 2 min e poi 95 gradi centigradi per 20 min.
    6. Tenere la lastra di vetro al forno in un contenitore, che è avvolto con un foglio di alluminio per bloccare qualsiasi luce, per la polimerizzazione notturna.
    7. Sviluppa modelli di canale SU-8 100 sulla lastra di vetro nello sviluppatore SU-8 per 15 min.
    8. Lavare la lastra di vetro con motivi SU-8 (muffa maestro) con alcool isopropile e asciugarla con gas N2. Se le particelle bianche rimangono durante questo processo, ripetere il passaggio 7 per 5 min.

2. Unità di riattuazione pneumatica

  1. Strato di microcanali (livello 1)
    NOTA: Eseguire i passaggi 2.1.1 - 2.1.2 in un cofano di fumi.
    1. Spogli 200 l l (Tridecafluoro-1,1,2,2-Tetrahydrooctyl)-1-Trichlorosilane su un coperchio e metterlo in una camera a vuoto con lo stampo master.
    2. Applicare il vuoto per 2 min nella camera e attendere per 6 h (o durante la notte) per insabbiamento dello stampo.
    3. Mescolare PDMS con un rapporto di peso di 10:1 (prepolimero:agente curante) per 5 min.
      NOTA: Tutti i passaggi di colata PDMS successivi contengono lo stesso rapporto di peso del prepolimero e dell'agente di polimerazione (10:1).
    4. Versare il PDMS sullo stampo master e degas PDMS in una camera a vuoto per 30 min.
    5. Sandwich PDMS con un pezzo di pellicola trasparente.
    6. Clamp il suddetto assemblaggio sandwich con una piastra di vetro, pastiglie di schiuma e piastre di plexiglass (Figura 2a Passo 4).
    7. Curare pdMS in forno a 80 gradi centigradi per 6 h.
    8. Isolare il livello PDMS (Livello 1) con la pellicola trasparente dalla struttura a sandwich(Figura 2a Passo 5).
    9. Attivare le superfici di Layer 1 e una piastra di vetro pulita (piastra di vetro 1; 50,8 mm , 76,2 mm e 1,2 mm) utilizzando un detergente al plasma per 1 min.
      NOTA: Il tempo di pulizia del plasma può variare in base alla potenza di un detergente al plasma usato.
    10. Bond Layer 1 sulla piastra di vetro 1 e metterli in forno a 80 gradi centigradi per 30 min.
    11. Rimuovere la pellicola di trasparenza dal livello 1.
  2. Membrana PDMS sottile (Livello 2)
    1. Ruotare il PDMS non curato su un film di trasparenza a 1.000 giri/mm per 1 min per ottenere uno strato PDMS spesso 60 m.
    2. Curare parzialmente lo spin PDMS rivestito (Strato 2) in forno a 80 gradi centigradi per 20-30 min.
    3. Attivare layer 1 sulla piastra di vetro 1 e livello 2 utilizzando il detergente al plasma per 1 min.
      NOTA: Il tempo di pulizia del plasma può variare in base alla potenza di un detergente al plasma usato.
    4. Legare lo strato 2 sul livello 1 e metterli in forno a 80 gradi durante la notte.
  3. Blocco tubazione
    1. Posizionare i tubi metallici verticalmente su una piastra di Petri.
    2. Versare delicatamente PDMS nel piatto per immergere circa 3/4 dei tubi metallici.
    3. Curare il PDMS in forno a 60 gradi centigradi per 6 h (o pernottamento).
    4. Tagliare un pezzo di blocco PDMS contenente un tubo metallico.
    5. Per l'inseridio di un foro sul layer 2.
    6. Attivare il blocco PDMS e il livello 2 utilizzando il detergente al plasma per 1 min.
    7. Fissare il blocco PDMS sulla parte di entrata del livello 2 e mettere l'intera unità di entrata in forno a 80 gradi per una notte.

3. Costrutti algerino-condrocito (o perline)

  1. Piatto di vetro ammino-silanizzato
    1. Tagliare una lastra di vetro (50,8 mm , 76,2 mm , 1,2 mm) in due lastre di vetro di medie dimensioni (50,8 mm , 38,1 mm e 1,2 mm) utilizzando uno scribor di diamanti.
    2. Collocare le lastre di vetro in cloruro di idrogeno (HCl) da 0,2 m e agitarle delicatamente (ad esempio, 55 giri/m) durante la notte.
    3. Sciacquare le lastre di vetro con diH2O.
    4. Agitare le lastre di vetro in idrossido di sodio da 0,1 M (NaOH) per 1 ora a 55 giri e risciacquarle con diH2O.
    5. Agitare le lastre di vetro in 1% (v/v) 3-aminopropyltrimethoxysilane (APTES) per 1 h a 55 giri e risciacquarle con diH2O.
    6. Asciugare le lastre di vetro amino-silanizzato in una cappa di fumi durante la notte.
  2. Muffa gel agarose per costrutti di gel alginato
    1. Mescolare 5% (w/v) agarose e 200 mM di cloruro di calcio (CaCl2) in diH2O.
    2. Far bollire la soluzione di gel di agarose con un forno a microonde (o una piastra calda). Il tempo di ebollizione varia in base al volume della soluzione di gel di agarose e alla potenza del forno a microonde (o alla temperatura della piastra calda).
    3. Versare la soluzione di gel di agarose bollito su uno stampo in alluminio (vedere Figura supplementare S2),e sandwich con una piastra di vetro.
    4. Attendere 5 min e sformare il gel di agarose solidificata dallo stampo in alluminio.
  3. Raccolta condrociti di laliga di crescita
    1. Isolare le placche di crescita dagli arti posteriori dei topi neoooatali.
    2. Posizionare le piastre di crescita in 1 mL di 0,25% collagenasi per 3 h in un'incubatrice a 37 gradi centigradi e 8% di anidride carbonica (CO2),per rimuovere la matrice extracellulare (ECM).
    3. Centrifugare il campione digerito per 5 min a 125 x g per fare un pellet condrocito e rimuovere il supernatante dal campione. Qui, 1 x g è l'accelerazione della gravità.
    4. Risospendere il pellet condrocito in 1 mL del mezzo di Eagle modificato di Dulbecco (DMEM).
    5. Contare il numero di condrociti in DMEM utilizzando un contatore di celle.
    6. Centrifugare i condrociti in DMEM per 5 min a 125 x g per fare di nuovo un pellet condrocito e rimuovere il supernatante dal campione.
    7. Facoltativamente, risospendere il pellet condrocito nel supporto di coltura condrocite (CCM)34 contenente 2 calcein AM e incubare il campione a 37 gradi centigradi per 30 min. Ripetere il passaggio 3.3.6 e passare al passaggio 3.3.8.
    8. Risospendere il pellet condrocito in un volume desiderato di CCM e tenerlo nell'incubatrice a 37 e 8% CO2 prima dell'uso.
  4. Costrutti algerino-condrocito (o perline) (Figura 2c)
    1. Mescolare l'1,5% (w/v) algerino in salina tamponata da fosfati (PBS) con 5 mg/mL di solfo-NHS, 10 mg/mL di 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide idrocloruro (EDC).
    2. Aggiungere 8 x 106 condrociti nella soluzione di gel algerato di 1 mL [o aggiungere 3 -L di 1 xm-diameter perline fluorescenti (542/612 nm) in 1 mL di soluzione gel algerato (0,3% (v/v))].
    3. Posizionare 150 l della soluzione alginato-condrocito (o perline) sulla lastra di vetro amino-silanizzata fabbricata nel passaggio 3.1.
    4. Coprire la soluzione di gel alginato con lo stampo in gel agarose per 3 min.
    5. Rimuovere l'eccessiva soluzione di gel algerino che trabocca dalla muffa gel agarose con una lama di rasoio e rimuovere lo stampo in gel agarose. Quindi, i costrutti cilindrici alginati-condrociti (o perline) si ottengono sulla lastra di vetro ammino-silanizzata.
    6. Collocare i costrutti alginato-condrocite in soluzione di collegamento incrociato (50 mM CaCl2 / 140 mM NaCl in diH2O) per 1 min per un'ulteriore polimerizzazione.

4. Assemblaggio del dispositivo (Figura 2d)

NOTA: i distanziali PDMS e i morsetti stampati in 3D devono essere preparati separatamente.

  1. Posizionare quattro distanziali PDMS spessi 1 mm sui quattro angoli dello strato 2 dell'unità di esercitata.
  2. Collocare 700 l di CCM per coprire le camere d'aria di Strato 2.
  3. Posizionare i costrutti alginato-condrocito (o perline) sullo strato 2, allineando accuratamente i costrutti con le camere d'aria.
  4. Bloccare il dispositivo con morsetti stampati in 3D (Figura 1c).

5. Attuazione del dispositivo

  1. Collegare l'uscita di una pompa d'aria (vedi Tabella dei materiali) con l'inseglio di una valvola solenoide con un tubo di silicio.
  2. Collegare la presa della valvola solenoide con l'inserimento del dispositivo assemblato con un tubo di silicio.
  3. Collegare la valvola solenoide con un generatore di funzioni.
  4. Manipolare la valvola solenoide con un'onda quadra (ad esempio, 1 Hz) generata dal generatore di funzioni.
  5. Accendere la pompa dell'aria per azionare il dispositivo in modo pneumatico.

6. Imaging di condrociti nel dispositivo

NOTA: Per ottenere una buona qualità dell'immagine, le immagini condrociti (o perline fluorescenti) in gel alginato attraverso la piastra di vetro 2 perché palloncini PDMS espansi e camere d'aria possono distorcere immagini ottiche. Se per l'imaging viene utilizzato un microscopio invertito, il dispositivo deve essere configurato in modo che la piastra di vetro 2 sia rivolta verso il basso.

  1. Preparare il dispositivo con condrociti (o perline fluorescenti) come mostrato nelle sezioni precedenti.
  2. Prendere z-stack immagini di condrociti (o perline fluorescenti) con un microscopio confocale prima e sotto compressione, rispettivamente. Scegliere una dimensione z-stepin base alla profondità di campo di un sistema di imaging confocale utilizzato.
  3. L'altezza dei condrociti (o di un costrutto algerino-perline) può essere misurata con il metodo di elaborazione automatica delle immagini mostrato nelle precedenti letteratura26,35.

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Risultati

In questo articolo vengono illustrate le procedure dettagliate della fabbricazione del dispositivo di compressione dei condrociti microfluidici(Figura 2). Il dispositivo contiene un 5 x 5 matrici di costrutti alginato-condrocito cilindrico e questi costrutti possono essere compressi con cinque diverse magnitudini di compressione (Figura 1, Figura 3 e Figura 4). L'altezza del microcanale pneumatico è di...

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Discussione

Per testare gli effetti dello stress compressivo sui condrociti della piastra di crescita, abbiamo sviluppato il dispositivo di compressione condrociti microfluidico (Figura 1) per applicare vari livelli di stress compressivo ai condrociti nell'scaffold idrogel algerino per il 3D cultura in modo ad alta produttività. Per aiutare altri ricercatori ad adottare il nostro dispositivo o a sviluppare dispositivi simili, abbiamo fornito dettagli sulle fasi di fabbricazione del dispositivo in quest...

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Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Riconoscimenti

Ringraziamo i dottori Christopher Moraes e Stephen A. Morin per il loro supporto per la progettazione e la fabbricazione dei dispositivi. Questo studio è stato sostenuto da Bioingegneria per la Salute Umana sovvenzione dall'Università del Nebraska-Lincoln (UNL) e l'Università del Nebraska Medical Center (UNMC), e concedere AR070242 dal NIH/ NIAMS. Ringraziamo Janice A. Taylor e James R. Talaska dell'Advanced Microscopy Core Facility presso l'University of Nebraska Medical Center per aver fornito assistenza con microscopia confocale.

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Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
(3-Aminopropyl)triethoxysilane (ATPES)Sigma-Aldrich741442-100ML
(Tridecafluoro-1, 1, 2, 2-Tetrahydrooctyl)-1-TrichlorosilaneUnited Chemical TechnologiesT2492-KG
Acrylic sheetMcMaster-Carr8560K354
Air pumpSchwarzer PrecisionSP 500 EC-LC4.5V DCWe used the model purchased in 2015. The internal design and performance of air pump (SP 500 EC-LC) changed in early 2016. Also, air pump performance has changed in the course of time. Thus, air pressure generated by an SP 500 EC-LC air pump should be calibrated before use.
Alginate powderFMC CorporationPronova UP MVG
Barb Straight Connectors (Metal tube)PneumadyneEB40-250
Calcein AMInvitrogenC3100MP
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Gibco11960-044
Dyed red aqueous fluorescent particlesThermo Fisher ScientificR0100
EDC (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride)Thermo Fisher Scientific22980
Foam padGRAINGERItem # 5GCE8
Function / Arbitrary Waveform GeneratorKeysight Technologies33210A
Hydrochloric acidFisher ChemicalA144-500
Hydrogen peroxideFisher BioReagentsBP2633500
Isopropyl alcoholBDH1174-4LPVWR
Microscope slidesThermo Fisher Scientific22-267-013
Plasma cleanerHarrick PlasmaPDC-001
Polydimethylsiloxane (PDMS)Dow Corning184 SIL ELAST KIT 0.5KG
Power supplyKeysight TechnologiesE3630A
SeaKem LE AgaroseLonza50004
Sodium hydroxideFisher ChemicalS318-1
Solenoid manifoldPneumadyneMSV10-1
Solenoid valvePneumadyneS10MM-30-12-3
Spin coaterLaurell TechnologiesWS-650Mz-23NPPB
SU8 DeveloperMicroChem Corp.Y020100 4000L1PE
SU8-100MicroChem Corp.Y131273 0500L1GL
SU8-5MicroChem Corp.Y131252 0500L1GL
Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide)Thermo Fisher Scientific24510
Sulfuric acidEMD MilliporeMSX12445

Riferimenti

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