がん幹細胞を標的とする抗腫瘍性薬物スクリーニングのための生理学的患者由来3Dスフェロイド

要約

このプロトコルは、患者由来のスフェロイドの生成、および増殖の定量化、細胞傷害性試験、フローサイトメトリー、免疫蛍光染色および共焦点イメージングを含む下流分析を記述し、薬物を評価するために抗腫瘍治療薬としての候補者の可能性このプロトコルは、各患者および疾患の段階のための特定の薬物の同定と精密医学をサポートする。

要約

このプロトコルでは、生理的に代表的な微小環境における抗癌治療のハイスループットスクリーニングを可能にするために、384ウェルの吊り下げ液滴内で腫瘍スフェロイドを生成するための手順を概説する。患者由来のがん幹細胞スフェロイドの形成と、薬物治療後の徹底的な分析のためのこれらのスフェロイドの操作について概説する。具体的には、スフェロイド形態、増殖、生存率、薬物毒性、細胞表現型および細胞局在化データの収集について説明する。このプロトコルは、384ウェル吊り下げプラットフォームを使用して簡単に実装できる分析技術に重点を置き、高スループットの薬物スクリーニングに最適です。卵巣癌研究やがん幹細胞研究においてこのモデルの重要性を強調する一方で、384-wellプラットフォームは他のがんタイプや疾患モデルの研究に適しており、プラットフォームの有用性を多くの分野に広げています。生理学的に代表的な3D培養を容易に実施することで、個別化された薬物スクリーニングのスピードとスクリーニング結果の質を向上させることで、新しい治療薬や患者特異的な治療法の開発に役立てることを予測されます。治療戦略は、したがって、広範囲の臨床影響を持っています。

概要

世界のがん関連死亡率は、2018年1月に980万人の死者を出し、改善された治療法の開発の必要性を強調した。残念ながら、がん治療薬の開発コストは増加しており、1つの薬剤の開発コストは約6億5,000万米^ドル2であり、新しい抗がん剤を開発するための改善戦略の必要性を示しています。癌幹細胞(CSC)は、化学抵抗力3の増加を特徴とし、自己更新能力、および新しい腫瘍4を播種する能力が腫瘍再発4、転移5、および及び化学耐性4、6は、すべてが腫瘍の悪性容量に寄与し、したがって高い死亡者数に寄与する。卵巣癌では、これらの細胞は腹腔内の悪性腹水液中に濃縮され、臨床的結果の悪さに関連する状態^である1.CSCの悪性化により、従来の化学療法と組み合わせて使用する新しいCSCターゲティング薬の開発が進められている。CSCターゲティング薬の開発に伴ういくつかの課題があります:1)インビトロでのCSCの拡大と維持の難しさ。2)患者サンプルの不足;3)培養プラットフォームの生理学的関連性;4)患者間の薬物感受性における不均一性。このプロトコルは、これらの課題を克服できる高スループット 3D カルチャ プラットフォームの実装について概説します。特に、このシステムは、少数の患者由来卵巣CSCを用いて迅速な薬物スクリーニングを可能にし、下流分析技術に非常に適しています。卵巣癌やCSCの研究に最適ですが、当社のプラットフォームは、複雑な3D環境で他の癌や分化細胞タイプを研究する上でも価値があります。

複雑な3次元(3D)モデルは、癌細胞、非癌支持細胞、および細胞外マトリックス(ECM)タンパク質からなる3Dニッチである腫瘍微小環境(TME)の研究において重要である4。この3D環境は、インビトロ4の従来の2D細胞培養と比較して、独自の細胞形態、細胞細胞および細胞マトリックス相互作用、細胞分化、細胞移動、細胞密度、および拡散勾配をもたらす。これらの要因のすべては、3D培養内の差動薬物応答で終わり、薬剤耐性および生理学的関連性の増加^を示す7,8.CSC分化および化学耐性における3D TMEの役割のために、生理学的微小環境におけるCSCターゲティング薬のスクリーニングが不可欠です。CSC薬物スクリーニングプラットフォームの生理学的関連性の向上は、患者特異的な薬物スクリーニング、薬剤開発、治療戦略の処方、および最終的には臨床結果を改善する可能性を有する。医薬品スクリーニングに使用されるプラットフォームは、有望な薬剤のコスト、時間、および臨床翻訳時間を最小限に抑えるために、高スループットとダウンストリーム分析方法と互換性があることが同様に重要^です9.

現在、複雑なTMEは、マウス合成腫瘍モデル、細胞株由来異種移植片、および患者由来異種移植片(PDX)^モデル12などの生体内モデルを通じて薬物スクリーニングアプリケーションに最適です。条件。しかし、これらのモデルの低スループットの性質は、ならびに、彼らが必要とするコスト、時間、および技術的なスキルセットは、迅速かつ高スループットの薬物スクリーニングアプリケーション13でその有用性を制限する。生体内モデルでこれらに代わるものとして、ヒドロゲル8を利用した多くのインビトロ3Dモデル、マイクロ流体デバイス内の培養器10、14、および非付着培養3、8また、コスト、時間、必要なスキルセットの面で参入障壁が低いため、開発されています。

ヒドロゲル培養プラットフォームは、マトリックス組成、機械的特性、およびマトリックス^構造15に対して与えられる微細な制御において有利である。しかしながら、それらは高密度細胞培^養14を阻害することができる。さらに、ヒドロゲルからの細胞の採取は、収穫^方法15の潜在的に有害な影響のために、下流分析を複雑にしうる。一方、マイクロ流体デバイスは、試薬の消費量を最小限に抑え、反応時間を短縮し、廃棄物を最小限に抑えながら、同じデバイス内および細胞培養を生理学的に関連するスケールで出力検出を可能にするマイクロスケールデバイスです。急速な拡散¹⁴.これらの特性は、薬物毒性、有効性、および薬物動態学を調査するための有望なプラットフォームを作ります。しかし、効率的、定量化可能、再現性、およびユーザーフレンドリーな3D細胞培養の課題、ならびにかさばる高価なポンプシステムは、ハイスループット^研究10におけるマイクロ流体アプリケーションを制限しています。また、効率的な検出設定と、分野を越えた実装が困難になる可能性もあり、マイクロ流体^{システム10}の広範な採用を妨げている。

逆に、回転ミキサー(nutators)、超低アタッチメントプレート、および吊り下げ液滴の非付着状態で生成されたスフェロイドは、ユーザ定義のマトリックス成分を含まない。これらの方法論は、非付着性条件が精片腔内でスフェロイドが成長する条件の代表であるとして、卵巣癌の研究に特に関連する5.これらの非付着性培養法の中で、ヌタレータおよびぶら下げドロップスフェロイドは、超低アタッチメントプレートで生成されたスフェロイドと比較して、より高い圧縮、改造、および化学抵抗を示することが示されており、生理学的な増加を示唆している。関連性^16,17,18,19.より小さい井戸サイズおよび最低の必要な細胞数からのハイスループットスクリーニングのための容量の増加のために、吊り下げドロッププレートの球体生成は薬物スクリーニングのための理想的なプラットホームである。ここでは、実装が容易で、下流分析に非常に適した384ウェルの吊り下げドロッププレートで、卵巣癌および卵巣CSCの高スループット薬物スクリーニングに最適な、384ウェルの吊り下げドロッププレートでの整合可能な3D生理学的プラットフォームを提示します。

当社の3D生理学的プラットフォームは、生理細胞接点、拡散勾配、細胞密度、および自然に産生されるECMタンパク質を含む3D培養のすべての利点を提供し、現実的な薬物応答に寄与する可能性がある16、 ^17,18,19.さらに、患者由来のCSCでこれらのスフェロイドを生成することにより、多くの技術的反復を同時に行う^薬物1に対する患者特異的応答を決定し、患者腫瘍内で見られる可能性のある不均一性を克服することができる。サンプル²⁰.さらに、3D培養はCSC集団3、16の維持を強化することが示されており、従って腹水7における濃縮CSC集団の代表である。これにより、生存率のフローサイトメトリー分析やCSCプロポーションを含む下流分析が容易になり、CSCターゲティング薬効効の最適な評価が可能になります。最後に、この生理学的プラットフォームは、実験中の複数の時点でのイメージング、細胞死と増殖の評価、免疫組織化学による細胞組織および形態、ELISAによる可溶性シグナル伝達と互換性があります。培地、フローサイトメトリーを有する細胞表現型、およびPCRに続く遺伝子発現。

プロトコル

すべての患者サンプルは、同意患者から承認されたIRBプロトコルの下で収集され、そのサンプルは腫瘍の増分および腹水の採取後に識別解除される。

1. 384ウェルハンギングドロッププレートにおける小細胞数からのスフェロイドの生成

1. 滅菌(DI)水で満たされたソニケーターに吊り下げドロッププレートを置き、20分間超音波処理します。
2. 手袋をした手で、ソニオレーターからプレートを取り出し、DI水を流して洗います。
3. プレートを0.1%のプルロン酸の浴槽に24時間座り、タンパク質の吸着と井戸へのスフェロイドの付着を防ぎます。
4. 手袋をした手でプレートを取り出し、DI水を十分に流してプレートの両側をすすいでください。
5. バイオセーフティキャビネット内のプレートを激しくタップまたは振り、無菌環境で井戸から水を取り除きます。
6. プレートをUV光の下に30~60分間置き、プレートを殺菌し、汚染を最小限に抑えます。
   注:プレートはまた殺菌のための部屋のエチレンオキシドガスに曝せることができる。
7. 無菌オートクレーブされたDI水の4〜5 mLで6ウェルプレートの各ウェルを充填し、6ウェルプレートの蓋と底部の間に吊り下げドロッププレートを挟みます。吊り下げドロッププレートの縁の周りに800~1,000 μLの無菌DI水を加え、湿気のある安定した無菌環境を提供し、蒸発によって失われる体積を最小限に抑えます(図1 A-C)。
8. 2D増殖細胞の場合、成長のログ段階で細胞を覆う吸引培地を吸引し、1xリン酸緩衝生理食生(PBS)で洗浄し、トリプシンの作用を妨げるため、成長培地中の胎児ウシ血清(FBS)の痕跡を除去する。
9. PBSを吸引し、100mm組織培養皿に0.25%トリプシン-EDTAの1.5-2 mLを追加します。37°Cに設定したインキュベーターで5分間細胞をインキュベートする。
   注:細胞は異なる速度で剥離する可能性があるため、5分後に細胞剥離を確実にするためにベンチトップ光顕微鏡でプレートをチェックする必要があります。
10. FBSまたは任意の血清を含む細胞培地の6〜8 mLを皿に加えてトリプシンを中和し、10mLの血清ピペで細胞を集め、15mL円錐形チューブに堆積させる。
11. ヘモサイトメーターの両側にセル懸濁液の10 μLをロードして細胞をカウントし、関連するカウントプロトコルに従います。
12. 原発性または転移性固形腫瘍または2D培養されていない腹水から採取した患者由来細胞については、前述の3に記載した血清フリー培地(SFM)に単細胞懸濁液を調製する。
13. 前述のように腫瘍組織を処理し、後で適切な凍結培^地21、22で使用するために単一細胞懸濁液を保存する。
    1. 固形腫瘍組織の場合、ミンチは、密度勾配21、22から所望の細胞を分離する前に、40 μmフィルターを介して得られた溶液をカミソリブレードで機械的に選別する。
    2. 腹水サンプルの場合、遠心分離により細胞を濃縮し、赤血球をアンモニウム-塩化カリウム(ACK)バッファーに入れ、1x PBSで洗浄し、次いで40μmフィルターと28G針を4^回22回通過する。
14. 卵巣CSCの単離については、以下に説明するようにフローサイトメトリーで細胞をソートする。
15. 新たに単一細胞を凍結して貯蔵し、実験に必要な場合は解凍します。
16. めっき用の細胞懸濁液を調付けるには、めっきに必要なセル溶液の所望体積を計算します:ドロップX当たり20μL/ドロップX総液数=必要な総溶液量。
17. 20 μL当たりの所望の細胞濃度に細胞濃度を希釈する(すなわち、20μL滴中の100細胞)。
18. メッキの前にピペを使用してセル懸濁液を穏やかに混合し、細胞の均質な分布を確保し、液滴間の均一性を向上させます。
    注:細胞懸濁液の過剰混合は、吊り下げドロップスフェロイド中の細胞死および破片につながる可能性がある。
19. ピペットの先端を約45°の角度で井戸に置き、セル溶液のピペット20μLを各吊り下げによく置きます。
    注:メッキパターンは、必要なスフェロイドの数に応じて調整することができます。他のすべての井戸のめっきスフェロイドは、液滴の偶発的なマージを防ぐため、実験で大量のスフェロイドが必要ない場合に安全です(図1D,E)。実験に大量のスフェロイドが必要な場合は、すべての井戸をプレートにして、すべての側面に境界線の井戸を1行残します(図1F)。
20. 6ウェルプレートの蓋を吊り下げドロッププレートの上に置き、水分損失に対して無感覚な伸縮性のある熱可塑性ストリップを使用して、エッジを密封し、液滴の追加蒸発を防ぎます。標準的なCO2加湿インキュベーター(5%CO2、37°C)でインキュベートします。
21. 飼料のぶら下がりは2~3日に1回、よく含む各スフェロイドに2~3μLを加えることで必要な栄養素の細胞培養培地を補充します。
    注:イメージング後、イメージング中の空気暴露は蒸発につながるので、常に吊り下げ滴を供給することをお勧めします。

2. ぶら下げスフェロイドプレートに細胞培養培地を添加する

1. バイオセーフティキャビネット内の熱可塑性ストリップと蓋を取り外し、吊り下げを含む各ウェルに適切な培養培地の2~3 μLを加えます。
   注:追加されるボリュームは、ドロップサイズと給餌間の時間によって異なります。
2. 給餌後、プレートを上部蓋で覆い、プレートをインキュベーターに戻す前に、外縁に新鮮な熱可塑性ストリップを適用します。

3. スフェロイド形態の位相コントラストイメージング

1. バイオセーフティキャビネットのプレートの端の周りから熱可塑性ストリップを取り外します。
2. 384ウェルの吊り下げドロップスフェロイドプレートをバイオセーフティキャビネットから慎重に取り外し、蓋をしたまま、蛍光顕微鏡で顕微鏡トレイに入れます。
3. 4x、10xまたは20xのイメージ投射ソフトウェアのライブイメージングオプションを使用して、吊り下げスフェロイドを観察し、所望の画像を撮影します。
4. 画像を保存した後、プレートをバイオセーフティキャビネットに戻し、上述のように細胞を供給します。
5. 新鮮な熱可塑性ストリップでプレートを再シールし、密封されたプレートをインキュベーターに戻します。

4. スフェロイド内の増殖と生存率の定量化

1. 十分な数のウェル内のプレートスフェロイドは、検査される各時点(すなわち、1日目および7日目)に対して>10の技術的反復を得る。
   注:このアッセイに使用されるウェルは、一般に、レサズリン色素からの潜在的な汚染物質のために再び使用されません。
2. 濾過されたレサズリンベースの溶液を、それらのウェルに供給するかのように増殖分析のために指定されたウェルに2 μLを加え、所定のインキュベーション期間にインキュベートします。
   注:このインキュベーション時間は、細胞の種類とスフェロイド内の細胞数によって異なる場合があります。増殖実験を開始する前に必要なインキュベーション時間を決定するには、1時間後のインキュベーション後に測定を開始し、制御ウェル高原で信号が読み出されるまで30分ごとに再測定することをお勧めします。アッセイの読み取り値は、必要な回数まで取得できます。インキュベーションは、通常、100の癌細胞で開始されたスフェロイドに対して4時間である。
3. マイクロプレートリーダーの電源を入れ、最初の読み取り前に少なくとも15分前に関連するプレートリーダーソフトウェアをオンにして、温度が測定値に影響を与える可能性があるため、機械が22°Cで内部温度をウォームアップして固定できるようにします。
4. 530/25 nm励起と590/35 nm発光波長を持つ384ウェルプレートプロトコルセットを開き、光学系を底に設定し、ゲインを35に設定し、読み取り速度を[標準]に設定し、読み取りタイプを蛍光に設定します。.
5. インキュベーション期間の後、バイオセーフティキャビネットの吊り下げドロップサンドイッチを開き、蓋が付いた384ウェルプレートをプレートリーダーに持ち込みます。
6. 蓋が付いた384ウェルプレートをプレートリーダートレイに置き、機械がウォームアップされたら延長し、[OK]をクリックしてプレートを読み取ります。
7. ウェルプレートを6ウェルベースに戻し、インキュベーターに入れます。すべての時間ポイントが1日に読み取られた場合は、プレートをインキュベーターに戻す前に再シールします。
8. ポップアップ ウィンドウにテストを保存し、[はい]をクリックし、[プレート 1 の PowerExports を実行しますか]をクリックして、プレート リーダー ソフトウェアから組織用のスプレッドシートにデータを出力します。
9. 各条件の平均蛍光値は、様々な実験条件における増殖の倍変化を報告する対照条件の平均によって正規化する。
10. 1日目と7日目を比較する場合、1日目の平均蛍光で割って正規化し、時間の経過に伴う増殖の折り目変化を得る。
11. 平均の標準誤差を使用して誤差バーを計算し、学生の両尾T検定のような適切な統計検定を持つ実験グループ間の統計的有意性を決定します。

5. スフェロイドにおける薬物毒性の評価

1. 薬物投与
   1. スフェロイド形成後の任意の時点で、2μL用量が所望の最終薬物濃度の10倍を含むような所望の濃度に希釈した薬物を提供する。
      注:これは、末積ポスト薬物治療が20μLであることを目的として、液滴から2μLの蒸発を仮定する。例えば、シスプラチンの50μM用量は、500 μMの調製溶液を持つことになります。液滴に20μLを超える値が含まれている場合は、それに応じて薬物および/または添加された体積の濃度を調整する必要があります。
   2. 細胞培養培地の2 μLでコントロールサンプルを処理します。
      注:シスプラチンは水に可溶化される。したがって、対照は細胞培養培地の2μLである。しかしながら、薬物培養物が異なる溶媒(例えば、DMSO)である場合、制御は薬物治療に用いられるのと同じ濃度のDMSOを有する細胞培養培地であるべきである。
   3. 薬物治療薬および対照スフェロイドを、薬物内視鏡検査を通じて引き続きモニタリングし、薬物毒性の効果の視覚的記録を有し、また、上記のようにレサズリン色素を用いて細胞の生存率を監視する。
      注:典型的には、薬物は48--72 hsの後に測定された吊り下げ滴および毒性の5〜7日後に加えられるが、これは実験に応じて変化させることができる。薬物は、安定したスフェロイドが形成されるとすぐに、通常1〜4日の間に追加することができる。
2. 細胞計数による薬物毒性定量
   1. 薬物治療の終了時点で、1,000 μLピペを使用してコントロールおよび薬物処理ウェルからそれぞれ10個のスフェロイドを収集し、各スフェロイドを独自のマイクロ遠心分離管に堆積させます。
   2. 繰り返しピペッティングを繰り返すことによって、スフェロイドを単一のセルに分解します。
      注:繰り返しピペッティングによる潜在的な細胞損傷を軽減するために、トリプシンなどの酵素による酵素消化は、ピペ^{ッティング23}の前に単一細胞溶液の生成を容易にするために行うことができる。ピペッティングによる細胞死の最小化は細胞タイプに依存し、それに応じて最適化する必要があります。解離による死亡が懸念される場合は、スフェロイド解離を必要としない代替方法のレサズリン色素と細胞毒性アッセイによる分析を参照してください。
   3. 400 x gでチューブを5分間遠心分離し、マイクロ遠心管の底部に細胞を集め、上清を吸引する。
   4. 各チューブに20μLの新鮮な培ったメディアまたは1x PBSを加え、よく混ぜます。
   5. トリパンブルーを2μLのトリパンブルーの比率で20μLの細胞懸濁液に加えます。
   6. 10 μLの細胞とトリパンブルー懸濁液を発血量計の各チャンバーにロードし、光顕微鏡下で細胞を数え、死細胞と未染色細胞を表す青い染色細胞を生細胞を表します。
      1. 生細胞 % = (生細胞数 ÷ 細胞の総数) x 100.

6. 組織学的手法を使用した球体特性

注:イヴァノフら24:1)ウェル当たり28μLを保持できる20ウェルモールドと23ウェルモールドを保持できる20ウェルモールドを複製するために、生体適合性ポリマーに3Dプリントされた2つの金型オプションがあります(図2D)。

1. 70%のエタノールで拭き取り、金型の周りにしっかりと縁を取り付け、金型を直立させます。両方の金型は、流体の約3 mL(20スフェロイドアレイの場合は3.203 mL、63スフェロイドアレイでは3.196 mL)に適合します。
2. 尖った綿棒を使用して10,000 cSt Siオイルでスフェロイドアレイを軽くコーティングし、その後の工程で試料処理ゲルキャストの除去を容易にします。
3. キャップを緩めた上で10~20sのマイクロ波で液化するまで、試料処理ゲルを温めます。
4. 溶融処理ゲルの2.6と2.8 mLの間に、境界線の上部とほぼ同じレベルになるまで金型に追加します。
5. 数分後に固化したら、金型から境界線を分離し、配列金型を反転して処理ゲル鋳造物を除去します。
6. 金型と境界線の間につま先を挿入して慎重に分離し、すぐに取り外さない場合は、セルスクレーパーを使用して鋳型からキャストを取り外します。
7. 100または150ミリメートルのセルペトリ皿に単一の井戸の内容物を1,000 μLピペでピペでピペリングすることにより、吊り下げドロッププレートからスフェロイドを収穫し、目視でスフェロイドを分離します。
8. 配列が充填されるまで、同定されたスフェロイドを含むウェル内容物のピペ状5μLを配列ウェルの1つに入れる。
9. 3分待って、スフェロイドがアレイの底に落ち着いた状態に落ち着いた後、各井戸に溶融処理ゲルをゆっくりと配管し、スフェロイドを邪魔しないように注意してください。
10. アレイの上部から水平に追加の処理ゲルを追加し、冷却したら、固化したスフェロイドアレイをラベル付きカセットに入れて処理します。
11. ラベル付きカセットを4%ホルマリンで一晩浸し、4°Cでスフェロイドを固定し、処理の準備ができるまで70%エタノールを4°Cで保存します。
12. 標準的な1時間のパラフィンプログラムで処理し、処理された配列がブロック面に最も近いウェルの底に直立するように、スフェロイド配列を埋め込みます。
13. アレイが可能な限り平らに埋め込まれ、下面がブロックの底部と同じ高さになり、ブロックを氷の上に置きます。
14. ブロックをマイクロトームにロードし、ブレードがロードされたブロック面と平行になるようにブロックを調整します。
15. アレイの底部に達するまで、切断アレイ(サンプル深度= 15 μm)を切断し、切断サンプルに円形ウェルが表示されていることを確認します。
16. 5 μmのサンプル深さに切り替え、リボンをスライスして収集し続けます。顕微鏡で数枚のスライスごとに確認し、スフェロイドの深さに達したかどうかを確認します。スフェロイドに到達すると、スフェロイドが表示されなくなるまで、後続の各スライドを収集します。
17. 各スライドを標準の H&E プロトコルで汚します。

7. ライブデッド細胞毒性アッセイ

1. 各ハンギングドロップに、生細胞色素、カルセイン-AMを2μMの最終濃度に加え、死細胞色素、エチジウムホモディマー-1を4μMの最終濃度に加え、ドロップ量が20μLであることを念頭に置く。
   注:ボリュームを最小限に抑え、通常は 2 μL の染料を組み合わせて追加してください。
2. 蓋付きの6ウェルプレートにプレートを戻し、37°Cで45分間スフェロイドをインキュベートします。
   注:スフェロイドの大きさに応じて、このインキュベーション時間は著しく異なる。例えば、400 μm以下のスフェロイドは通常、インキュベーション時間の30~45分しか必要としないのに対し、800μmに近い大きなスフェロイドは最大90分のインキュベーション時間を必要とします。インキュベーション時間は、個人の実験に最適化する必要があります。
3. その後のイメージングでは、バイオセーフティキャビネットに1,000 μLピペを備えたスフェロイドを収穫し、各スフェロイドを事前に洗浄されたガラス顕微鏡スライドに堆積させます。
4. 画像スフェロイドは、ガラスを通して、反転共焦点顕微鏡上で。
   注:スフェロイドが収穫される実験室への共焦点顕微鏡の近接に応じて、スフェロイド輸送のためにより多くの安定性が必要な場合は、スフェロイドをスライド上に置かれた媒体の元の液滴で画像化するか、または2%アガロースに包まれることができます。
5. 顕微鏡ソフトウェアで多次元集録モードを使用して、10倍の倍率でDICイルミネーションを使用してスフェロイドを見つけ、Z面をスキャンしてスフェロイドを包含する高さを識別します。
6. Zシリーズをクリックし、Zスキャンの上限と下限をスフェロイドの上部よりわずかに高く、スフェロイドの底よりわずかに低く設定します。
7. カルセイン-AM(生細胞;緑)の488nmでスフェロイドを励起し、エチジウムホモジマー-1(死んだ細胞;赤)の561 nmをソフトウェアが推奨するステップサイズ、最大ゲイン、各色の最小暴露で励起します。
8. [取得]をクリックして、スフェロイド内の生細胞と死んだセルの合成 Z スタック イメージを取得します。
9. 画像処理ソフトウェアを使用して生きている/死んだ比率を定量化し、生細胞に対応するチャネルからのピクセル強度のパーセンテージと、コンポジットからの死んだ細胞に対応するチャネルからのピクセル強度のパーセンテージを定量化するZ 投影画像。
   注:2D投影で3D構造を定量化する際の制限により、ライブ蛍光と死んだ蛍光を定量する別の方法は、吊り下げドロッププレート内で、カルセイン-AMおよびエチジウムに含まれるプロトコルに従ってプレートリーダーを使用することです。ホモディマー-1キット。

8. 免疫蛍光

1. 低融解2%アガロース溶液を加熱するので、溶液は粘性であり、ちょうど融点の上にあり、顕微鏡スライド上に置いて、アガロースの柔らかいベッドを作成します
2. 2%アガロースの柔らかいベッドにドロップを介してPBSの20 μLを押すことによって、スフェロイドを収穫します。
   注:これは、スフェロイドが埋め込まれる前にアガロースが固まらないように迅速に行う必要があります。
3. アガロースが冷却し、収穫したスフェロイドを(5分以内)に閉じ込めたゲルを、4%の中性緩衝ホルマリンを加えて、スフェロイドを固定します。または、氷冷メタノールを加え、アガロース埋め込みスフェロイドを-20°Cで30分間固定します。
4. 1x PBSでそれぞれ3xを5分間洗浄し、各洗浄後にPBSを廃棄する。
5. 1x PBSで10%の血清(すなわち、馬の血清)および0.15%の石鹸溶液(トリトンX-100)とRTで1時間のブロック。
6. 1x PBSでそれぞれ3xを5分間洗浄し、各洗浄後にPBSを廃棄する。
7. 推奨または予め決定された抗体希釈(すなわち、1:100希釈で蛍光標識ファロイジン)で所望の蛍光抗体を有するステインスフェロイドは、室温で少なくとも90分間インキュベートし、光から覆われる。
   注:プロトコルは抗体と標的によって異なり、抗体希釈は実験に応じて最適化する必要がある場合があります。
8. 蛍光染色されたスフェロイドを、前項で概説したスフェロイドイメージングの方法を用いて、反転共焦点顕微鏡で可視化します。
9. 複合Zスタック画像は、スフェロイドの3D形態を示します。

9. フローサイトメトリーによる癌幹細胞集団の収集と解析

1. フローサイトメトリー解析用のスフェロイドの準備
   1. 1,000 μLピペを使用して吊り下げドロッププレートの各井戸からスフェロイドを収集し、繰り返しピペッティングで分解するために15 mL遠心チューブに堆積させます。
   2. トリパンブルーを使用してヘモサイトメーター上の生存細胞を数え、上記のように細胞数と濃度を決定します。
   3. アリコセル懸濁液を5本のマイクロ遠心管に懸濁させ、それぞれが最低50,000個の細胞を含む。
   4. マイクロ遠心分離機で5分間400 x gですべてのチューブを遠心分離します。
   5. 各チューブから上清を吸引し、100 μLのバッファーでペレットを再中断します。
   6. ラベルチューブは「未染色」「DAPI」「APC-iso」「DEAB」「ALDH/CD133」。
   7. シリアル希釈および製造業者の推奨によって決定されるALDH/CD133チューブにAPC-isotype抗体の0.5 μLとCD133抗体の1 μLをALDH/CD133チューブに添加します。
   8. DEAB試薬の5 μL と ALDH の 0.5 μL を DEAB チューブに、ALDH/CD133 チューブに ALDH の 1 μL を追加します。
   9. 渦は約2sのためのすべての管を、45分間37 °Cでインキュベートする。
   10. すべてのチューブを再び渦にし、マイクロ遠心分離機で5分間400 x gで遠心分離機を使用します。
   11. FACSチューブに「未染色」「DAPI」「APC-iso」「DEAB」「ALDH/CD133」とラベルを付け、絶縁発泡容器を充填して脇に置きます。
   12. 上清上清を吸引し、400 μL FACS バッファー(2% FBS で 1x PBS)および FACS DAPI バッファーの 400 μL 内のすべての他のすべてのチューブ (300 μM 4',6-diamidino-2-フェニリンドールを含む FACS バッファー) で「染色されていない」コントロールを再中断します。
   13. 流れ細胞計で分析されるまで、氷で容器にチューブを置きます。
       注:卵巣癌幹細胞をソートするには、0.5%の非特異的APCシグナルと0.15%の非特異的ALDH+シグナルを含むように設定されたゲートを持つCYTOmeterがALDH+およびCD133+に測定するすべての細胞を収集します。信頼性の高い結果を取得するには、少なくとも 10,000 の細胞を分析する必要があります。その他の詳細については、最近の出版物^3,17を参考にしてください。
2. FlowJoにおけるALDH+/CD133+母集団の分析
   1. FlowJoアイコンをダブルクリックしてプログラムを開き、フローサイトメトリー ソフトウェアから取得した .fcs ファイルをワークスペースにドラッグします。
   2. 汚れていないファイルをダブルクリックし、Y 軸からサイド スキャッタの高さ (SSC-H) と X 軸を前方散布高(FSC-H)に設定します。
   3. 各軸の横にあるTボタンをクリックして、スケールと変換を調整して、異なるセル母集団間の分離を最大化します。
   4. [ポリゴンゲーティング] ボタンをクリックし、セルの母集団の周囲にポリゴン ゲートを描画し、母集団に「セル」というラベルを付けます。
   5. ワークスペース内のセルの作成をダブルクリックして「セル」の母集団内のセルのみを表示し、FSC 軸をクリックして軸チャネルを FSC 幅に変更し、SSC 軸をクリックして軸チャネルを FSC-H に変更します。
   6. [長方形ゲート]ツールを選択し、Y 軸全体にまたがる最も密度の高いセルの左側に四角形を描画して、ウィンドウの右側に向かう潜在的な二重線を除外し、このゲートに「単一セル」というラベルを付けます。
   7. [セル] と[入れ子になった単一セル]ゲートを右クリックしてコピーし、ワークスペース内の各サンプルの下に貼り付けます。
   8. ワークスペースの DAPI サンプルの下にネストされた単一セルゲートをダブルクリックして、そのサンプル チューブから単一セルの母集団を表示し、FSC 軸をクリックし、軸チャネルを DAPI - エリア チャネルに変更します。
   9. SSC 軸をクリックし、軸チャネルをヒストグラムに変更します。
      注: ライブセルは DAPI を除外して左に向き、死んだセルは DAPI を取り込み、グラフの右側に表示されます。
   10. DAPI軸の横にあるTボタンをクリックし、[軸をカスタマイズ] をクリックしてスケールを調整し、DAPI 正と負のピークの間の分離を最大化します。
       注:ウィンドウがポップアップ表示され、スケーリング オプションが表示されます。多くの場合、[スケール]フィールドを Biex に設定し、余分な負の数十年と幅の基準を調整すると、最大の分離が得られます。
   11. [ポップアップ ウィンドウで適用] をクリックしてスケーリングの変更を適用し、[範囲ゲート] ボタンを選択し、ライブ セルの人口に対応する DAPI 負のピークに広がります。
   12. このゲートに「ライブセル」とラベルを付け、右クリックして「ライブセル」ゲートをコピーして、「APC-iso」「DEAB」「ALDH/CD133」チューブの下にある「シングルセル」ゲートの下に貼り付け、各サンプルチューブ内の生細胞の同じ部分を選択します。
   13. 次に、APC-iso サンプル ファイルの下にネストされたライブ セルの作成をダブルクリックし、X 軸を ALDH — エリア チャネルと Y 軸を APC - エリア チャネルに切り替えます。
   14. 繰り返しますが、各軸のTボタンと[軸をカスタマイズ]をクリックして軸スケールを調整し、イベントがプロットの左下の領域にローカライズされ、[四角形]オプションを選択し、プロット ウィンドウをクリックして象限ゲートを確立します。.
   15. 人口の約 0.5% がプロット ウィンドウの左上または 'APC 陽性' 象限に位置するゲートの交点を調整します。
       注:この0.5%は、APCアイソタイプの非特異的染色を表す。
   16. ワークスペース内の各作業領域ラベルを個別に右クリックし、適切に名前を変更します。コントロールまたはコマンドは、ワークスペース内の各象限ゲート ラベルをクリックしてコピーします。
       注:'Q1' は CD133+ セルを表します。'Q2' は CD133+ および ALDH+ ' セルを表します。'Q3' は ALDH+ セルを表します。'Q4' は CD133-および ALDH-セルを表します。
   17. 'DEAB' ファイルの下にネストされたライブ セルの母集団に象限ゲートを貼り付けます。セル母集団の約0.15%が水平線を動かないように注意して'ALDH+'象限内にあるので、垂直線を調整します。
       注:この0.15%は非特異的ALDH信号を表す。
       1. 水平線の位置が変わらないようにするには、DEAB ファイルの下にネストされた新しい象限ゲートをコピーし、APC iso ファイルの下のライブ セルに貼り付けます。既存の象限ゲートを置き換えるメッセージが表示された場合は、[はい]を選択します。
       2. ワークスペースで、'CD133+' パーセントが 'APC-iso' ファイルの下で約 0.5 のままであることを確認します。
   18. 「ALDH/CD133」ファイルの「ライブセル」の母集団に象限ゲートをコピーして貼り付けます。
       注:右上象限に存在する生存細胞母集団のパーセンテージは、サンプル内の ALDH+ および CD133+ ダブル陽性 CSC のパーセンテージになります。

結果

細胞株または患者由来CSCで形成されたスフェロイドは、吊り下げ液滴内の小さな細胞数の範囲で形成することができる(図2A)。スフェロイドは、ウェルあたりわずか10個の細胞で確実に形成され、希少な患者サンプルの保存が可能です。これらのスフェロイド内の細胞は、生体内と同様に3次元で他の細胞に囲まれ、生理細胞接触と拡散速度を可能にします。スフェロイド...

ディスカッション

3Dスフェロイド形成のための384ウェルの吊り下げドロッププレートプラットフォームは、あらゆる細胞生物学または癌生物学研究室に簡単に実装されたツールです。この生理学的なプラットホームは高いスループットの薬物スクリーニングを可能にする間生理学的に関連する3D培養内の細胞株および主要な患者のサンプルの研究を可能にする。また、このプラットフォームは、培養条件が高度...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% trypsin-EDTA	Gibco	ILT25200056
10 mL serological pipet	Fisher Scientific	13-678-11E
10,000 cSt Si oil	Millipore Sigma	63148-62-9	Used to coat spheroid array mold to facilitate removal of tissue processing gels, like Histogel, from the mold.
100 mm tissue culture dish	Thermo Scientific	130182
15 mL conical tube	Celltreat	FL4021
1x DMEM for Serum Free Medium	Gibco	11965-092
1x F12 for Serum Free Medium	Gibco	11765-054
1x phosphate buffered saline (PBS)	Gibco	ILT10010023
4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Thermo Fisher	D1306
40 µm filter	Fisher Scientific	22363547
6-well plate	Fisher Scientific	353046
Accutase	Innovative Cell Technologies Inc.	1449	A gentle cell detachment enzyme composed of proteolytic and collagenolytic enzymes.
ACK Lysing Buffer	Thermo Scientific	A1049201
alamarBlue	Invitrogen	DAL1025	Resazurin dye used to measure viability and proliferation of cells based on their ability to reduce resazurin to resorufin, which is highly fluorescent.
ALDEFLUOR assay kit	Stem Cell Tech	1700	Kit to identify stem and progenitor cells that express high levels of aldehyde dehydrogenase , an indicator of cancer stem cells. The kit is composed of ALDEFLUOR Reagent, DEAB, Hydrochloric Acid, Dimethylsulphoxide, and ALDEFLUOR Assay Buffer.
ALDEFLUOR Diethylaminobenzaldehyde (DEAB)	Stem Cell Tech	1705	Diethylaminobenzaldehyde (DEAB) is an inhibitor of ALDH isozymes, used to determine non-specific ALDH staining.
Andor iXon x3 CCD Camera	Oxford Instruments	-
Antibiotics and Antimycotics	Gibco	15240-062
APC-isotype IgG2b	Miltenyi biotec	130-092-217	Isotype control to quantify non-specific staining of IgG2b antibodies.
B27 Supplement	Gibco	17504044
basic Fibroblast Growth Factor	Stem Cell Technologies	78003.1
BD Lo-Dose U-100 Insulin Syringes	Fisher Scientific	14-826-79
BioTek Synergy HT Microplate Reader	BioTek	7091000
CD133-APC	Miltenyi biotec	130-113-184	Fluorescent antibody targeting CD133, a cancer stem cell marker.
cellSens Dimension Software	Olympus
Cisplatin	Sigma-Aldrich	P4394	Platinum based chemotherapy agent that functions as an alkylating agent that disrupts DNA.
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)	Invitrogen	D1306
Epidermal Growth Factor	Gibco	PHG0311
EVOS XL Core Cell Imaging System	Life Technologies	AME3300
Fetal Bovine Serum - premium (FBS)	Atlanta Biologicals	S11150
Ficoll 400	Sigma-Aldrich	F4375
Hemacytometer	Hausser Scientific	1490
Histogel	Thermo Scientific	HG-4000-012	Tissue processing gel that can penetrate and hold the specimen within the gel while preventing discoloration around the specimen upon staining.
Human Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells	Lonza	PT-5006
Human Microvascular Endothelial Cells	Lonza	CC2543
Insulin-Transferrin-Selenium Supplement	Gibco	51500-056
Live/Dead viability kit	Invitrogen	L3224	Kit for the fluorescence based detection of live (calcein-AM) and dead cells (Ethidium Homodimer-1).
MEM Non-essential Amino Acids	Gibco	11140-050
MetaMorph 7.8 Software	Molecular Devices	-
Olympus IX81 Inverted Confocal Microscope	Olympus	-
Olympus IX83 Research Inverted Microscope	Olympus
Parafilm M	Thomas Scientific	7315D35	Thermoplastic polymer strips that serve to limit droplet evaporation in hanging drop plates while still allowing for gas exchange.
Perfecta 3D 384 Well Hanging Drop Plates	3D Biomatrix	HDP1384-8	Available through Sigma-Aldrich
phalloidin AlexaFluor488	Invitrogen	A12379	Phalloidin is a peptide to fluorescently label F-actin in fixed cells.
ProJet 3500 HD Max	3D Systems	-	3D printer
Sterile DI water	Fisher Scientific	353046
Trypan Blue	Gibco	15250061	Azo dye used to differentiate between live and dead cells based on its ability to pass through the damaged membrane of dead cells, but not the intact membrane of live cells.
VisiJet M3 Crystal	3D Systems	-	A biocompatible polymer material for 3D printing.
Yokogawa CSU-X1 Confocal Scanner Unit	Yokogawa	-