Spheroids 3D derivados do paciente fisiológico para a seleção antineoplástica da droga para alvejar pilhas de haste do cancro

Resumo

Este protocolo descreve a geração de spheroids paciente-derivados, e a análise a jusante que inclui a quantificação da proliferação, do teste da citotoxicidade, da citometria do fluxo, da coloração da imunofluorescência e da imagem latente confocal, a fim avaliar a medicina potencial dos candidatos como terapêutica antineoplásica. Este protocolo suporta a medicina da precisão com identificação de drogas específicas para cada paciente e estágio da doença.

Resumo

Neste protocolo, nós esboçamos o procedimento para a geração de esferoides do tumor dentro das gotas de suspensão 384-well para permitir a seleção da elevado-produção de terapêutica anti-câncer em um microambiente fisiologicamente representativo. Nós esboçamos a formação de esferoides derivados pacientes da pilha de haste do cancro, assim como, a manipulação destes esferoides para a análise completa depois do tratamento da droga. Especificamente, nós descrevemos a coleção da morfologia do esferóide, da proliferação, da viabilidade, da toxicidade da droga, do phenotype da pilha e dos dados da localização da pilha. Este protocolo centra-se fortemente em técnicas de análise que são facilmente implementadas usando o 384-bem pendurado drop plataforma, tornando-o ideal para a triagem de drogas de alta taxa de transferência. Enquanto enfatizamos a importância deste modelo em estudos de câncer de ovário e pesquisa de células-tronco de câncer, a plataforma 384-well é capaz de pesquisa de outros tipos de câncer e modelos de doenças, estendendo a utilidade da plataforma para muitos campos. Ao melhorar a velocidade de triagem de drogas personalizado e a qualidade dos resultados de triagem através de facilmente implementado fisiologicamente representativas culturas 3D, esta plataforma está prevista para ajudar no desenvolvimento de novas terapêuticas e pacientes específicos estratégias de tratamento e, portanto, têm um impacto clínico de grande alcance.

Introdução

A mortalidade mundial relacionada ao câncer atingiu um pedágio de 9,8 milhões mortes em 2018¹, destacando a necessidade de desenvolvimento de terapêutica melhorada. Infelizmente, o custo do desenvolvimento de drogas cancerosas está aumentando, com o desenvolvimento de uma única droga custando aproximadamente 650 milhões USD² indicando a necessidade de estratégias melhoradas para desenvolver novos medicamentos anticancerígenos. Células-tronco cancerosas (CSCs), que são caracterizadas por aumento da quimiorresistência³, a capacidade de autorenovar, e a capacidade de semente de novos tumores⁴ são pensados para ser responsável pelo recidiva tumoral⁴, metástase⁵, e quimiorresistência^4,6, que todos contribuem à capacidade maligno do tumor e assim ao pedágio elevado da morte. No cancro ovariano, estas pilhas são encontradas enriquecidas no líquido maligno das ascite na cavidade peritoneaa, uma circunstância associada com os resultados clínicos pobres¹. Em conseqüência das capacidades malignos de CSCs, houve um impulso para desenvolver o CSC novo que alvejam drogas para usar-se conjuntamente com quimioterapias tradicionais. Existem vários desafios que acompanham o desenvolvimento da CSC visando drogas, incluindo: 1) dificuldade em expandir e manter CSCs in vitro; 2) escassez de amostras de pacientes; 3) relevância fisiológica da plataforma de cultura; e 4) heterogeneidade na sensibilidade medicamentosa entre os pacientes. Este protocolo descreve a implementação de uma plataforma de cultura 3D de alta taxa de transferência que pode superar cada um desses desafios. Em particular, este sistema permite a triagem rápida de drogas usando pequenos números de CSCs ovarianos derivados do paciente, e é altamente capaz de técnicas de análise a jusante. Embora seja ideal para estudar câncer de ovário e CSCs, nossa plataforma também é valiosa no estudo de outros cânceres e tipos de células diferenciadas em ambientes 3D complexos.

Os modelos 3-dimensionais complexos (3D) são críticos em estudar o microambiente do tumor (TME), que é um Niche 3D compo de pilhas de cancro, de pilhas suportando do não-cancro, e de proteínas extracelular da matriz (ECM)⁴. Este ambiente 3D resulta em morfologia celular única, interações célula-célula e matriz celular, diferenciação celular, migração celular, densidade celular e gradientes de difusão em comparação com a cultura de células 2D tradicional in vitro⁴. Todos estes fatores culminam na resposta diferencial da droga dentro das culturas 3D, exibindo a resistência aumentada da droga e a relevância physiological^7,8. Devido ao papel do TME 3D na diferenciação e na quimiorresistência do CSC, é vital para a tela para o CSC que alvejam drogas em microambientes fisiológicos. Melhorar a relevância fisiológica de plataformas de triagem de drogas CSC tem o potencial para melhorar a triagem de drogas específicas do paciente, desenvolvimento de medicamentos, formulação de estratégias de tratamento e, finalmente, resultados clínicos. É igualmente importante que a plataforma utilizada para a triagem de fármacos seja de alto débito e compatível com métodos de análise a jusante para minimizar o tempo de custo, tempo e tradução clínica de drogas promissoras⁹.

Atualmente, o complexo TME é melhor mantido para aplicações de triagem de fármacos através de modelos in vivo, como modelos de tumor singeneico murino, xenoenxertos derivados de linhagem celular e Xenoenxerto derivado do paciente (PDX) modelos¹², pois fornecem Condições. No entanto, a natureza de baixa taxa de transferência desses modelos, bem como, o custo, o tempo e os conjuntos de habilidades técnicas que eles exigem limitam sua utilidade em aplicações de triagem de drogas rápidas e de alta taxa de transferência¹³. Como alternativas a estes modelos in vivo, muitos modelos in vitro 3D que utilizam hidrogéis⁸, cultura dentro de dispositivos microfluídico ou ' órgão-em-um-chip ' dispositivos^10,14, e culturas não aderentes^3,8 também foram desenvolvidas, devido à sua baixa barreira à entrada em termos de custo, tempo e skillset exigido.

As plataformas da cultura do Hydrogel são vantajosas no controle fino proporcionado sobre a composição da matriz, as propriedades mecânicas, e a estrutura da matriz¹⁵; no entanto, eles podem inibir a cultura de células de alta densidade¹⁴. Adicionalmente, a colheita de células de hidrogéis pode complicar a análise a jusante, devido a efeitos potencialmente nocivos dos métodos de colheita¹⁵. Os dispositivos microfluílicos, por outro lado, são dispositivos de microescala que permitem a detecção de saída dentro do mesmo dispositivo e para a cultura celular em escalas fisiologicamente relevantes com consumo mínimo de reagentes, tempo de reação diminuído, desperdício minimizado e difusão rápida¹⁴. Estas características tornam-nas plataformas promissoras para investigar a toxicidade, eficácia e farmacocinética da droga. No entanto, os desafios de uma cultura de células 3D eficiente, quantificável, reprodutível e fácil de usar, bem como sistemas de bombeamento volumosos e caros restringiram aplicações microfluímicas em pesquisas de alta produtividade¹⁰. As configurações de detecção eficientes e a implementação potencialmente difícil nos campos também dificultaram a adoção generalizada de sistemas microfluílicos¹⁰.

De forma contrária, os esferóides gerados em condições não aderentes em misturadores rotativos (nutators), placas de fixação Ultrabaixa e gotas suspensas não incluem componentes de matriz definidos pelo usuário. Essas metodologias são especialmente relevantes para o estudo do câncer de ovário, pois as condições não aderentes são representativas das condições em que os esferóides crescem dentro da cavidade peritoneal⁵. Dentro destes métodos não aderentes da cultura, o pulverizador e os esferoides de gota de suspensão foram mostrados para apresentar uma compactação, uma remodelação, e um quimiorresistência mais elevados comparados aos esferoides gerados em placas ultra-low do acessório, sugerindo o aumento fisiológico relevância^16,17,18,19. Devido à capacidade aumentada para a seleção da elevado-produção dos tamanhos pequenos do poço e dos números de pilha exigidos mínimos, a geração do esferóide em placas de gota de suspensão é uma plataforma ideal para a seleção da droga. Aqui, apresentamos uma plataforma fisiológica 3D sintonável em placas suspensas 384-well penduradas, que é fácil de implementar e altamente receptável à análise a jusante, tornando-a ideal para a triagem de drogas de alto débito de câncer de ovário e CSCs ovariana.

Nossa plataforma fisiológica 3D fornece todas as vantagens da cultura 3D, incluindo contatos fisiológicos de células celulares, gradientes de difusão, densidades de células e proteínas de ECM produzidas naturalmente, que podem contribuir para respostas realistas de drogas^{16, 17,18,19}. Adicionalmente, gerando estes esferoides com CSCS paciente-derivado, nós podemos determinar respostas específicas pacientes às drogas¹ com muitas repetições técnicas simultaneamente, para superar a heterogeneidade que pode ser encontrada dentro do tumor paciente amostras²⁰. Além disso, a cultura 3D demonstrou aumentar a manutenção das populações deCSC^,16 e^,portanto, é representativa de populações de CSC enriquecidas nas ascite⁷. Isto combinado com a análise a jusante fácil, incluindo a análise da citometria do fluxo da viabilidade e das proporções do CSC permite a avaliação óptima do CSC que Sega a eficácia da droga. Por fim, esta plataforma fisiológica é compatível com a imagem em múltiplos pontos temporais durante o experimento, avaliação da morte celular e proliferação, organização celular e morfologia com imunohistoquímica, sinalização solúvel com ELISA em condicionados meio, fenótipos da pilha com cytometry do fluxo, e expressão do gene que segue o PCR.

Protocolo

Todas as amostras do paciente são coletadas um protocolo de IRB aprovado dos pacientes de permite encontrem, cujas as amostras são desidentificadas após a coleção debulking e das ascite do tumor.

1. geração de Esferoides de pequenos números de células em 384-bem pendurado drop placas

1. Coloque a placa suspensa pendurada em um sonicador preenchido com água estéril deionizada (di) e proceda por 20 min.
2. Com uma mão enluvado, retire a placa do sonicador e lave-a com água de DI em funcionamento.
3. Permita que a placa se sente em um banho de 0,1% de ácido Plurônico para 24 h para evitar a adsorção de proteínas e aderência esferóide aos poços.
4. Retire as placas com uma mão enluvado e enxágüe ambos os lados da placa com água de DI running completamente.
5. Vigorosamente toque ou agitar a placa dentro de um gabinete de biossegurança para remover a água dos poços em um ambiente estéril.
6. Coloque a placa luz UV por 30 – 60 min de cada lado para esterilizar as placas e minimizar a contaminação.
   Nota: A placa pode igualmente ser expor ao gás do óxido de etileno em uma câmara para a esterilização.
7. Encha cada poço de uma placa de 6 poços com 4 – 5 mL de água autoclavada estéril de DI e sanduíche a placa de gota de suspensão entre a tampa e a parte inferior da placa de 6 poços. Adicione 800 – 1000 μL de água DI estéril ao redor da borda da chapa suspensa de suspensão para fornecer um ambiente úmido, estável e estéril para minimizar o volume perdido para a evaporação (Figura 1 a-C).
8. Para as células cultivadas em 2D, aspirar células de cobertura média em sua fase de log de crescimento e lavagem com 1x fosfato tampão salina (PBS) para remover vestígios de soro bovino fetal (FBS) no meio de crescimento, como dificulta a ação da tripsina.
9. Aspirar a PBS e adicionar 1,5-2 mL de 0,25% Trypsin-EDTA ao prato de cultura de tecido de 100 mm. Incubar células por 5 min em uma incubadora definida como 37 ° c.
   Nota: As pilhas podem separar-se em taxas diferentes, assim que as placas devem ser verific em um microscópio claro do de bancada para assegurar o destacamento da pilha após 5 minutos. Ajuste o protocolo do destacamento por instruções do fornecedor ao usar uma linha celular.
10. Adicione 6 – 8 mL de meio celular contendo FBS ou qualquer soro ao prato para neutralizar a tripsina, coletar células com um Pipet serológico de 10 mL e depositá-los em um tubo cônico de 15 mL.
11. Células de contagem carregando 10 μL da suspensão celular em cada lado de um hemocitômetro e siga o protocolo de contagem associado.
12. Para as células derivadas do paciente coletadas de tumores sólidos primários ou metastáticos ou de ascite que não tenham sido cultivadas em 2D, prepare suspensões de células únicas no meio livre de soro (SFM) descrito anteriormente³.
13. Processe tecidos do tumor como descrito previamente e armazene suspensões da única pilha para um uso mais atrasado no meio de congelação apropriado^21,22.
    1. Para o tecido do tumor sólido, triturar mecanicamente com uma lâmina de barbear e filtrar a solução resultante através de um filtro de 40 μm antes de isolar as células desejadas de um gradiente de densidade^21,22.
    2. Para amostras de ascite, concentrado de células por centrifugação, lyse glóbulos vermelhos em tampão de amônio-cloreto-potássio (ACK), lave em 1X PBS, e depois passar por um filtro de 40 μm e uma agulha de 28 G 4 vezes²².
14. Para a isolação de CSCS ovarianos, classifique pilhas com citometria do fluxo como descrito abaixo em detalhe.
15. As únicas pilhas isoladas recentemente são congeladas para o armazenamento e descongelado quando necessário para a experimentação.
16. Para preparar a suspensão da célula para o revestimento, calcule o volume desejado de solução celular necessária para o chapeamento: 20 μL por gota X número total de gotas = volume total da solução necessário.
17. Diluir a concentração celular para a concentração celular desejada por 20 μL (i.e., 100 células em uma gota de 20 μL).
18. Misture a suspensão celular suavemente usando um Pipet antes antes do revestimento para garantir a distribuição homogênea das células e melhorar a uniformidade entre as gotas.
    Nota: Overmixing da suspensão da pilha pode conduzir à morte e aos restos da pilha nos spheroids de gota de suspensão.
19. Coloc a ponta da pipeta no poço em um ângulo de aproximadamente 45 ° e Pipet 20 μL da solução da pilha em cada gota de suspensão bem.
    Nota: Os testes padrões do chapeamento podem ser ajustados dependendo do número de esferoides necessários. Chapeamento esferoides em todos os outros bem é mais seguro quando grandes quantidades de esferóides não são necessários em um experimento, porque impede a fusão acidental das gotas (Figura 1D, E). Se forem necessárias grandes quantidades de esferóides para um experimento, a placa cada poço deixando uma fileira de poços de fronteira em todos os lados (Figura 1F).
20. Coloc a tampa da placa 6-well para trás sobre a placa de gota de suspensão e use uma tira thermoplastic stretchy que seja insensível à perda de umidade, para selar as bordas e para impedir a evaporação adicional das gotas. Incubar em uma incubadora umidificada padrão do CO₂ (5% co₂, 37 ° c).
21. Alimentação gotas penduradas uma vez a cada 2 – 3 dias para repor o meio de cultura celular para os nutrientes necessários, adicionando 2 – 3 μL para cada esferóide contendo bem.
    Nota: Após a imagem, é sempre aconselhável alimentar as gotas penduradas, como a exposição ao ar durante a imagem leva à evaporação.

2. adicionando o meio de cultura de pilha às placas de suspensão do spheroid da gota

1. Retire a tira termoplástica e a tampa dentro de um gabinete de biossegurança e adicione 2 – 3 μL do meio de cultura apropriado a cada poço contendo uma gota pendurada.
   Nota: O volume adicionado dependerá do tamanho da gota e da quantidade de tempo entre alimentações.
2. Após a alimentação, cubra a placa com a tampa superior e aplique a tira thermoplastic fresca às bordas exteriores antes de põr a placa para trás na incubadora.

3. imagem de contraste de fase da morfologia esferóide

1. Retire a tira termoplástica em torno das bordas da placa em um gabinete de biossegurança.
2. Remova com cuidado a placa de suspensão do esferoides da gota 384-well do armário do biossegurança com a tampa ainda no lugar e coloc a na bandeja do microscópio em um microscópio epifluorescente.
3. Use a opção de imagem ao vivo no software de imagem em 4x, 10x ou 20x para observar os esferoides suspensos e tirar as imagens desejadas.
4. Depois de salvar as imagens, leve a placa de volta para o gabinete de biossegurança e células de alimentação, como descrito acima.
5. Placa reseal com uma tira thermoplastic fresca e coloc a placa selada para trás na incubadora.

4. quantificação da proliferação e viabilidade dentro de spheroids

1. Esferóides de placa em um número suficiente de poços para obter > 10 repetições técnicas para cada ponto de tempo (ou seja, dia 1 e dia 7) que deve ser examinado.
   Nota: Os poços que são usados para este ensaio não são usados geralmente outra vez devido aos contaminadores potenciais do corante do resazurin.
2. Adicionar 2 μL de solução filtrada com base em resazurina aos poços designados para análise de proliferação, como se alimentando os poços e incubar para um período de incubação pré-determinado.
   Nota: Este tempo de incubação pode variar com base no tipo de célula e o número de células no spheroid. É aconselhável determinar o tempo necessário de incubação necessário antes de iniciar experimentos de proliferação iniciando as medições após 1 hora de incubação e depois remedindo a cada 30 min até que as leituras de sinal nos poços de controle sejam platinadas. As leituras do ensaio podem ser tomadas quantas vezes desejar. A incubação é tipicamente 4 h para esferóides iniciados com 100 células cancerosas.
3. Gire sobre o leitor da microplaca seguido primeiramente pelo software associado do leitor da placa pelo menos 15 minutos antes da primeira leitura para permitir que a máquina aqueça acima e fixe a temperatura interna em 22 ° c enquanto a temperatura pode afetar as leituras.
4. Abra um 384-bem placa de protocolo conjunto com 530/25 nm excitação e 590/35 Nm emissão comprimentos de onda com óptica definida para baixo, ganho definido para 35, leitura de velocidade definida como normal, e ler o tipo definido para fluorescência .
5. Após o período de incubação, abra o sanduíche pendurado da gota em um armário da biossegurança e traga a placa 384-well com a tampa ainda no lugar ao leitor da placa.
6. Coloc a placa 384-well com a tampa ainda no lugar na bandeja do leitor da placa, que será prolongada uma vez que a máquina é aquecida acima e clique a aprovação para ler a placa.
7. Retorne a placa de poço para a base de 6 poços e coloque-a na incubadora. Se todos os pontos do tempo foram lidos para o dia, reseal a placa antes de coloc a para trás na incubadora.
8. Salve o experimento na janela pop-up e, em seguida, clique em Sim quando solicitado você deseja executar powerexports para placa 1 para dados de saída do software de leitor de chapa em uma planilha para organização.
9. Valores médios de fluorescência para cada condição e normalizar pela média da condição de controle para relatar mudança de dobra na proliferação em várias condições experimentais.
10. Ao comparar o dia 1 ao dia 7, normalizar dividindo pela fluorescência média do dia 1 para obter a mudança da dobra na proliferação sobre o tempo.
11. Calcule as barras de erro usando o erro padrão da média e determine a significância estatística entre os grupos experimentais com um teste estatístico adequado, como o teste T bicaudal do aluno.

5. avaliação da toxicidade medicamentosa em esferóides

1. Administração de medicamentos
   1. A qualquer momento após a formação de esferóide, entregue a droga diluída na concentração desejada, de forma que uma dose de 2 μL contenha 10x a concentração final desejada de drogas.
      Nota: Isso está assumindo uma evaporação de 2 μL da gota para que o volume final pós-tratamento medicamentoso seja de 20 μL. Por exemplo, uma dose de 50 μM de cisplatina terá uma solução preparada de 500 μM. Se as gotas contêm mais de 20 μL, a concentração da medicina e/ou o volume adicionado devem ser ajustados conformemente.
   2. Trate amostras de controle com 2 μL de meio de cultura celular.
      Nota: A cisplatina é solubilizada em água. Portanto, os controles são 2 μL de meio de cultura celular; Entretanto, se o veículo da droga é um solvente diferente (por exemplo, DMSO), a seguir os controles devem ser meio de cultura da pilha com uma concentração igual de DMSO como usado no tratamento da droga.
   3. Continue a monitorar a droga tratada e os esferoides do controle durante todo o período da incubação da droga com microscopia de fase para ter um registro visual do efeito da toxicidade da droga assim como com a tintura do resazurin como descrito acima para monitorar a viabilidade celular.
      Nota: Normalmente, os medicamentos são adicionados após 5 – 7 dias nas gotas suspensas e toxicidade medido após 48 –-72 hs, mas isso pode ser variado dependendo do experimento. As drogas podem ser adicionadas assim que os esferóides estáveis se formaram, geralmente entre 1 – 4 dias.
2. Quantificação da toxicidade medicamentosa por contagem celular
   1. No ponto do tempo do fim do tratamento da droga, colete 10 esferoides cada um do controle e os poços tratados droga usando um Pipet de 1.000 μl e deposite cada jogo dos esferoides em seu próprio tubo do microcentrifugador.
   2. Quebre os esferóides em células individuais por pipetagem repetida.
      Nota: Para reduzir o potencial dano celular devido à pipetagem repetida, a digestão enzimática com uma enzima como a tripsina pode ser realizada para facilitar a geração de soluções de células únicas antes da pipetagem²³. A minimização da morte celular devido à pipetagem dependerá do tipo de célula e deve ser otimizada de acordo. Se estiver preocupado com a morte devido à desagregação, consulte a análise com corante de resazurina e o ensaio de citotoxicidade para métodos alternativos que não necessitam de desagregação esferóide.
   3. Centrifugue os tubos durante 5 min a 400 x g para recolher as células na parte inferior dos tubos de microcentrífuga e aspirar o sobrenadante.
   4. Adicione 20 μL de mídia fresca ou 1X PBS a cada tubo e misture bem.
   5. Adicione o azul de trypan a uma proporção de 2 μL de mancha azul de trypan a 20 μL de suspensão celular.
   6. Carregar 10 μL de células e suspensão azul de trypan em cada câmara do hemociômetro e contar células um microscópio de luz, com células manchadas de azul representando células mortas e células não manchadas representando células ao vivo.
      1. A célula ao vivo% = (número de células ao vivo ÷ número total de células) x 100.

6. caracterização esferóide com técnicas histológicas

Nota: Existem duas opções de molde 3D impressos em um polímero biocompatível para replicar moldes de matriz esferoidal feita por Ivanov et al.²⁴: 1) 20 molde bem que pode conter 28 μl por poço e 2) 63 molde bem que pode conter 9 μl por poço (Figura 2D).

1. Esterilize o molde da histologia e sua beira limpando os para baixo com o etanol 70% e prenda a beira firmemente em torno do molde e coloque o molde ereto. Ambos os moldes cabem aproximadamente 3 ml do líquido (3,203 ml para a disposição 20 esferóide e 3,196 ml para a disposição do esferóide 63).
2. Bata levemente a matriz esferóide com 10.000 CST si óleo usando um cotonete de algodão apontado para facilitar a remoção da amostra de processamento de gel fundido em etapas subsequentes.
3. Aqueça o gel de processamento de amostras até ser liquefeito via microondas por 10 – 20 s com a tampa solta.
4. Adicione entre 2,6 e 2,8 mL do gel de processamento derretido no molde até aproximadamente nivelar com a parte superior da beira.
5. Em poucos minutos, uma vez solidificada, retire o gel de processamento fundido, separando a borda do molde e, em seguida, invertendo o molde de matriz.
6. Insira a ponta da pinça entre o molde e a borda para separá-las cuidadosamente e, em seguida, use um raspador de células para ajudar a desalojar o elenco do molde se ele não se separar imediatamente.
7. Colha os esferoides da placa de gota de suspensão introduzindo com pipting o índice de um único poço em um prato de Petri da pilha de 100 ou de 150 milímetros com um Pipet de 1.000 μl, e isole o esferóide visualmente.
8. Pipet 5 μl do conteúdo do poço, incluindo o esferóide identificado em um dos poços da matriz, até que a matriz seja preenchida.
9. Aguarde 3 min para garantir que os esferóides se estabeleceram no fundo da matriz antes de Pipetar suavemente o gel de processamento derretido em cada um dos poços, sendo cuidadoso para não perturbar os esferóides.
10. Adicione o gel Processando adicional para nivelar fora da parte superior da disposição e uma vez que esfriou, coloc a disposição do esferóide solidificado em um Cassette etiquetado para processar.
11. Submerge a gaveta etiquetada em formalina de 4% durante a noite para fixar os esferoides em 4 ° c e para armazenar então em 70% etanol em 4 ° c até pronto para processar.
12. Processo com padrão 1 h programa de parafina e, em seguida, incorporar as matrizes esferóide de tal forma que as matrizes processadas estão enfrentando verticalmente com a parte inferior dos poços mais próximos da face do bloco.
13. Assegure-se de que as matrizes estejam incorporadas tão horizontalmente quanto possível, com a face inferior nivelada com a parte inferior dos blocos do bloco e do lugar no gelo.
14. Coloque o bloco no micrótomo e ajuste o bloco de tal forma que a lâmina esteja paralela à face do bloco carregado.
15. Matriz de corte (profundidade da amostra = 15 μm) até que a parte inferior dos poços da matriz seja alcançada certificando-se de que os poços circulares são visíveis em amostras de corte.
16. Mude para uma profundidade de amostra de 5 μm e continue a cortar e a recolher fitas. Verific o microscópio cada poucas fatias para determinar se a profundidade do esferóide estêve alcançada. Uma vez que os esferoides são alcançados recolhem cada corrediça subseqüente até que os esferoides sejam já não visíveis.
17. Manchar cada slide com o protocolo padrão H & E.

7. ensaio de citotoxicidade morta ao vivo

1. A cada gota de suspensão, adicione o corante vivo da pilha, calcein-am à concentração final de 2 μm, e a tintura da pilha inoperante, homodimer-1 do etídio à concentração final de 4 μm, tendo em mente que o volume da gota é 20 μl.
   Nota: Tente manter os volumes adicionados ao mínimo e, normalmente, adicione 2 μL dos corantes combinados.
2. Coloc as placas para trás na incubadora imprensada em uma placa de 6 poços com uma tampa e incubar os esferoides para 45 minutos em 37 ° c.
   Nota: Dependendo do tamanho dos esferóides, este tempo de incubação varia significativamente. Por exemplo, os esferoides 400 μm tipicamente exigem somente 30 – 45 minutos do tempo da incubação, visto que os esferoides maiores mais perto de 800 μm exigiram até 90 minutos do tempo da incubação. Os tempos de incubação devem ser otimizados para o experimento de um indivíduo.
3. Para a imagem latente subseqüente, esferoides da colheita com um Pipet de 1.000 μl em um armário do biossegurança e deposite cada esferóide em corrediças de vidro pre-limpadas do microscópio.
4. Esferoides da imagem através do vidro, em um microscópio confocal invertido.
   Nota: Dependendo da proximidade do microscópio confocal ao laboratório em que os esferoides são colhidos, os esferoides podem ou ser imaged na gota original do meio coloc na corrediça ou encerrado no agarose de 2% se mais estabilidade é exigida para o transporte do esferóide.
5. Usando o modo de aquisição multidimensional no software do microscópio, localize o esferóide usando a iluminação de DIC na ampliação 10x e então Escaneie o z-Plane para identificar as alturas que abrangem o esferóide.
6. Clique na série z e defina o limite superior e inferior do z-Scan ligeiramente superior ao da parte superior do esferóide e ligeiramente inferior à parte inferior do esferoide.
7. Excite os esferóides em 488 nm para calceina-am (células ao vivo; verde) e 561 nm para etídio homodimer-1 (células mortas; vermelho) com o tamanho da etapa recomendado pelo software, ganho máximo e exposição mínima para cada cor.
8. Clique em adquirir para obter uma imagem de pilha z composta de células mortas e ao vivo dentro do spheroid.
9. Quantifique Live/Dead proporções usando o software de processamento de imagem para quantificar uma porcentagem de intensidade de pixel do canal correspondente a células ao vivo versus a porcentagem de intensidade de pixel do canal correspondente a células mortas do composto imagens de projeção z.
   Nota: Devido às limitações na quantificação de uma estrutura 3D com uma projeção 2D, um método alternativo para quantificar a fluorescência viva versus morta, dentro das placas suspensas é usar um leitor de placas seguindo o protocolo incluído com o calcein-am e o etídio Kit homodimer-1.

8. imunofluorescência

1. Aqueça uma solução do agarose da baixa fusão 2%, assim que a solução é viscosa e apenas acima do ponto de derretimento e coloc em uma corrediça do microscópio para criar uma cama macia do agarose
2. Colher esferóides empurrando 20 μL de PBS através da gota sobre a cama macia de 2% agarose.
   Nota: Isto deve ser feito rapidamente de modo que o agarose não solidificar antes que os esferoides estejam incorporados.
3. Uma vez que o agarose arrefece e géis com o esferóide colhido preso dentro (menos de 5 min), adicione 4% de formalina tamponada neutra para fixar os esferóides. Alternativamente, adicione o metanol frio do gelo, e fixe os esferoides agarose-incorporados em-20 ° c por 30 minutos.
4. Lave 3x por 5 min cada um com 1X PBS, descartando PBS após cada lavagem.
5. Bloco para 1 h em RT com soro de 10% (i.e., soro de cavalo) e solução de sabão de 0,15% (Triton X-100) em 1X PBS.
6. Lave 3x por 5 min cada um com 1X PBS, descartando PBS após cada lavagem.
7. Esferoides da mancha com o anticorpo fluorescente desejado na diluição recomendada ou pre-determinada do anticorpo (isto é, faloidina cDNAs etiquetado em uma diluição 1:100), incubando pelo menos 90 minutos na temperatura ambiente, coberto da luz.
   Nota: Os protocolos variarão dependendo do anticorpo e a diluição do alvo e do anticorpo pode precisar de ser aperfeiçoado dependendo do experimento.
8. Visualize esferoides cDNAs manchados com o microscópio confocal invertido usando os métodos esboçados na seção precedente para esferoides da imagem latente.
9. As imagens de pilha z compostas demonstrarão a morfologia 3D nos esferóides.

9. coleta e análise de populações de células-tronco cancerosas com citometria de fluxo

1. Preparando esferóides para análise de citometria de fluxo
   1. Colete esferóides de cada poço nas placas suspensas usando um Pipet de 1.000 μL e deposite-os em um tubo de centrífuga de 15 mL para desagregação com pipetagem repetida.
   2. Contagem de células viáveis em um hemocitômetro usando trypan azul para determinar o número da célula e concentração como descrito acima.
   3. Suspensão da célula alíquota em cinco tubos de microcentrífuga, de forma que cada um contenha um mínimo de 50.000 células.
   4. Centrifugue todos os tubos a 400 x g durante 5 min num microcentrifugador.
   5. Aspirar o sobrenadante de cada tubo e resuspender pelotas em 100 μL de tampão.
   6. Tubos de etiquetas "não manchados", "DAPI", "APC-ISO", "DEAB" e "ALDH/CD133", respectivamente.
   7. Adicionar 0,5 μL de anticorpo APC-isotipo ao tubo APC-ISO e 1 μL de anticorpo CD133 ao tubo ALDH/CD133 conforme determinado pela diluição em série e recomendação dos fabricantes.
   8. Adicionar 5 μL de reagente de DEAB e 0,5 μL de ALDH ao tubo de DEAB e 1 μL de ALDH ao tubo ALDH/CD133.
   9. Vórtice todos os tubos para aproximadamente 2 s e incubar a 37 ° c por 45 min.
   10. Vortex todos os tubos novamente e centrifugar a 400 x g por 5 min em uma microcentrífuga.
   11. Etiqueta FACS tubos "Unmanchado", "DAPI", "APC-ISO", "DEAB", e "ALDH/CD133" e encher um recipiente de espuma isolados para anular.
   12. Aspirar o sobrenadante e suspender o controle "não manchado" em 400 μL de tampão de FACS (1X PBS com 2% FBS) e todos os outros tubos em 400 μL de tampão de FACS DAPI (tampão de FACS com 300 μM 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole).
   13. Coloc os tubos no recipiente com gelo até que analisado em um cytometer do fluxo.
       Nota: Para classificar para células-tronco de câncer de ovário, recolher todas as células que as medidas do citometro para ser ALDH + e CD133 + com portões definidos para incluir 0,5% sinal APC não específico e 0,15% sinal ALDH + não específico. Pelo menos 10.000 células precisam ser analisadas para resultados confiáveis. Detalhes adicionais podem ser encontrados nas publicações recentes^3,17.
2. Análise de populações de ALDH +/CD133 + em FlowJo
   1. Clique duas vezes no ícone FlowJo para abrir o programa e arraste os arquivos. FCS obtidos do software de citometria de fluxo para o espaço de trabalho.
   2. Clique duas vezes no arquivo não manchado e defina o eixo y para a altura de dispersão lateral (SSC-h) e o eixo x para encaminhar a altura de dispersão (FSC-h).
   3. Clique no botão T ao lado de cada eixo para ajustar a escala e a transformação para maximizar a separação entre as diferentes populações de células.
   4. Clique no botão polígono gating e desenhe uma porta de polígono ao redor da população de células e rotule a população ' Cells '.
   5. Clique duas vezes na população de células no espaço de trabalho para exibir somente as células dentro da população ' Cells ' e, em seguida, clique no eixo FSC para alterar o canal do eixo para a largura do FSC e, em seguida, clique no eixo SSC e altere o canal do eixo para o FSC-H.
   6. Escolha a ferramenta Rectangle Gate e desenhe um retângulo em torno da população mais densa da esquerda de células abrangendo a totalidade do eixo y para excluir potenciais doublets em direção à direita da janela e rotular Este portão ' células individuais '.
   7. Clique com o botão direito do mouse e copie as células e o portão de células única aninhada e cole-os em cada amostra no espaço de trabalho.
   8. Clique duas vezes na porta de células única aninhada o exemplo DAPI no espaço de trabalho para exibir a população de célula única desse tubo de amostra e clique no eixo FSC e altere o canal do eixo para o canal DAPI-Area.
   9. Clique no eixo SSC e altere o canal do eixo para histograma.
      Observação: as células ao vivo serão para a esquerda como eles excluem DAPI, enquanto células mortas tomarão no DAPI e aparecem para a direita do gráfico.
   10. Clique no botão T ao lado do eixo DAPI e clique em Personalizar eixo para ajustar a escala para maximizar a separação entre os picos DAPI positivos e DAPI negativos.
       Nota: Uma janela irá aparecer com opções de dimensionamento. Muitas vezes, definindo o campo de escala para biex e ajustando o extra negativo décadas e largura base produzirá a maior separação.
   11. Clique em aplicar na janela pop-up para aplicar alterações de dimensionamento, escolha o botão Range Gate e espalhe-o sobre o pico negativo DAPI, correspondente à população de células em directo.
   12. Rotule este portão ' células ao vivo ' e clique direito para copiar o portão ' Live Cells ' para colá-lo o portão ' células individuais ' o ' APC-ISO, ' DEAB ', e ' ALDH/CD133 ' tubos para selecionar a mesma porção de células ao vivo em cada tubo de amostra.
   13. Em seguida, clique duas vezes na população de células ao vivo aninhada o arquivo de exemplo APC-ISO e alterne o eixo x para o canal aldh — área e o eixo y para o canal APC — área.
   14. Novamente, ajuste a escala do eixo clicando no botão T e Personalize o eixo de cada eixo para que os eventos sejam localizados na região inferior esquerda da plotagem e selecione a opção Quad Gate e clique na janela de plotagem para estabelecer um portão de quadrante .
   15. Ajuste a interseção do portão de tal forma que aproximadamente 0,5% da população se encontra no canto superior esquerdo da janela de plotagem ou quadrante ' APC positivo '.
       Nota: Este 0,5% representa a coloração não específica do isotipo APC.
   16. Clique com o botão direito em cada rótulo de quadrante individualmente no espaço de trabalho e renomeie-os apropriadamente. Controle ou comando clique em cada rótulo de porta de quadrante no espaço de trabalho e copiá-los.
       Nota: ' Q1 ' representa células CD133 +; ' Q2 ' representa as células CD133 + e ALDH + '; ' Q3 ' representa as células ALDH +; e ' Q4 ' representa células CD133-e ALDH-.
   17. Cole os portões do quadrante na população de células ao vivo aninhada o arquivo ' deab '. Ajuste a linha vertical de tal forma que aproximadamente 0,15% da população celular se encontra dentro do quadrante ' ALDH + ' tomando cuidado para não mover a linha horizontal.
       Nota: Este 0,15% representa o sinal ALDH não específico.
       1. Para garantir que a linha horizontal não alterasse a posição, copie os novos portões do quadrante aninhados o arquivo Deab e cole-os nas células ao vivo o arquivo ISO da APC. Selecione Sim quando solicitado para substituir o portão do quadrante existente.
       2. Verifique no espaço de trabalho que o percentual ' CD133 + ' ainda é aproximadamente 0,5 o arquivo ' APC-ISO '.
   18. Copie e cole os portões do quadrante para a população ' células Live ' do arquivo ' ALDH/CD133 '.
       Nota: A percentagem da população de células viáveis presente no quadrante superior direito será a percentagem de ALDH + e CD133 + CSCs duplo positivo dentro da amostra.

Resultados

Os esferóides formados com linhagens celulares ou CSCs derivadas de pacientes podem ser formados com uma variedade de pequenos números de células dentro de gotas suspensas (Figura 2a). Os spheroids formam confiantemente com tão poucos quanto 10 pilhas por o poço, que permite a conservação de amostras pacientes raras. Células dentro desses esferóides são cercados por outras células em 3 dimensões como eles estariam in vivo, permitindo que os contatos de células celulares fisioló...

Discussão

O 384-poço pendurado plataforma de placa de queda para a formação de esferóide 3D é uma ferramenta facilmente implementada para qualquer biologia celular ou laboratórios de biologia do câncer. Esta plataforma fisiológica permite o estudo de linhas celulares, bem como, amostras de pacientes primários dentro de culturas 3D fisiologicamente relevantes, permitindo a triagem de drogas de alta taxa de transferência. A plataforma igualmente assegura-se de que as condições da cultura sejam altamente ajustáveis, perm...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% trypsin-EDTA	Gibco	ILT25200056
10 mL serological pipet	Fisher Scientific	13-678-11E
10,000 cSt Si oil	Millipore Sigma	63148-62-9	Used to coat spheroid array mold to facilitate removal of tissue processing gels, like Histogel, from the mold.
100 mm tissue culture dish	Thermo Scientific	130182
15 ml conical tube	Celltreat	FL4021
1X DMEM for Serum Free Medium	Gibco	11965-092
1X F12 for Serum Free Medium	Gibco	11765-054
1X phosphate buffered saline (PBS)	Gibco	ILT10010023
4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Thermo Fisher	D1306
40 µm filter	Fisher Scientific	22363547
6-well plate	Fisher Scientific	353046
Accutase	Innovative Cell Technologies Inc.	1449	A gentle cell detachment enzyme composed of proteolytic and collagenolytic enzymes.
ACK Lysing Buffer	Thermo Scientific	A1049201
alamarBlue	Invitrogen	DAL1025	Resazurin dye used to measure viability and proliferation of cells based on their ability to reduce resazurin to resorufin, which is highly fluorescent.
ALDEFLUOR assay kit	Stem Cell Tech	1700	Kit to identify stem and progenitor cells that express high levels of aldehyde dehydrogenase , an indicator of cancer stem cells. The kit is composed of ALDEFLUOR Reagent, DEAB, Hydrochloric Acid, Dimethylsulphoxide, and ALDEFLUOR Assay Buffer.
ALDEFLUOR Diethylaminobenzaldehyde (DEAB)	Stem Cell Tech	1705	Diethylaminobenzaldehyde (DEAB) is an inhibitor of ALDH isozymes, used to determine non-specific ALDH staining.
Andor iXon x3 CCD Camera	Oxford Instruments	-
Antibiotics and Antimycotics	Gibco	15240-062
APC-isotype IgG2b	Miltenyi biotec	130-092-217	Isotype control to quantify non-specific staining of IgG2b antibodies.
B27 Supplement	Gibco	17504044
basic Fibroblast Growth Factor	Stem Cell Technologies	78003.1
BD Lo-Dose U-100 Insulin Syringes	Fisher Scientific	14-826-79
BioTek Synergy HT Microplate Reader	BioTek	7091000
CD133-APC	Miltenyi biotec	130-113-184	Fluorescent antibody targeting CD133, a cancer stem cell marker.
cellSens Dimension Software	Olympus
Cisplatin	Sigma-Aldrich	P4394	Platinum based chemotherapy agent that functions as an alkylating agent that disrupts DNA.
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)	Invitrogen	D1306
Epidermal Growth Factor	Gibco	PHG0311
EVOS XL Core Cell Imaging System	Life Technologies	AME3300
Fetal Bovine Serum - premium (FBS)	Atlanta Biologicals	S11150
Ficoll 400	Sigma-Aldrich	F4375
Hemacytometer	Hausser Scientific	1490
Histogel	Thermo Scientific	HG-4000-012	Tissue processing gel that can penetrate and hold the specimen within the gel while preventing discoloration around the specimen upon staining.
Human Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells	Lonza	PT-5006
Human Microvascular Endothelial Cells	Lonza	CC2543
Insulin-Transferrin-Selenium Supplement	Gibco	51500-056
Live/Dead viability kit	Invitrogen	L3224	Kit for the fluorescence based detection of live (calcein-AM) and dead cells (Ethidium Homodimer-1).
MEM Non-essential Amino Acids	Gibco	11140-050
MetaMorph 7.8 Software	Molecular Devices	-
Olympus IX81 Inverted Confocal Microscope	Olympus	-
Olympus IX83 Research Inverted Microscope	Olympus
Parafilm M	Thomas Scientific	7315D35	Thermoplastic polymer strips that serve to limit droplet evaporation in hanging drop plates while still allowing for gas exchange.
Perfecta 3D 384 Well Hanging Drop Plates	3D Biomatrix	HDP1384-8	Available through Sigma-Aldrich
phalloidin AlexaFluor488	Invitrogen	A12379	Phalloidin is a peptide to fluorescently label F-actin in fixed cells.
ProJet 3500 HD Max	3D Systems	-	3D printer
Sterile DI water	Fisher Scientific	353046
Trypan Blue	Gibco	15250061	Azo dye used to differentiate between live and dead cells based on its ability to pass through the damaged membrane of dead cells, but not the intact membrane of live cells.
VisiJet M3 Crystal	3D Systems	-	A biocompatible polymer material for 3D printing.
Yokogawa CSU-X1 Confocal Scanner Unit	Yokogawa	-