Patients physiologiques dérivés sphéroïdes 3D pour le dépistage des médicaments anti-néoplastiques pour cibler les cellules souches cancéreuses

Résumé

Ce protocole décrit la génération des sphéroïdes patients-dérivés, et l'analyse en aval comprenant la quantification de la prolifération, l'essai de cytotoxicité, la cytométrie de flux, la coloration d'immunofluorescence et l'imagerie confocale, afin d'évaluer le médicament potentiel des candidats en tant que thérapeutique anti-néoplastique. Ce protocole soutient la médecine de précision avec l'identification de médicaments spécifiques pour chaque patient et stade de la maladie.

Résumé

Dans ce protocole, nous décrivons la procédure pour la génération des sphéroïdes de tumeur dans les gouttelettes de 384-puits pendantes pour permettre le criblage à haut débit des thérapies anticancéreuses dans un microenvironnement physiologiquement représentatif. Nous décrivons la formation des sphéroïdes dérivés de cellules souches de cancer de patient, aussi bien que, la manipulation de ces sphéroïdes pour l'analyse complète suivant le traitement de drogue. Plus précisément, nous décrivons la collection de la morphologie sphéroïde, la prolifération, la viabilité, la toxicité des médicaments, le phénotype cellulaire et les données de localisation cellulaire. Ce protocole se concentre fortement sur les techniques d'analyse qui sont facilement mises en œuvre à l'aide de la plate-forme de 384 puits de chute suspendue, ce qui le rend idéal pour le dépistage des médicaments à haut débit. Bien que nous soulignions l'importance de ce modèle dans les études sur le cancer de l'ovaire et la recherche sur les cellules souches du cancer, la plate-forme de 384 puits est propice à la recherche sur d'autres types de cancer et modèles de maladies, étendant ainsi l'utilité de la plate-forme à de nombreux domaines. En améliorant la vitesse du dépistage personnalisé des médicaments et la qualité des résultats du dépistage grâce à des cultures 3D facilement représentatives sur le plan physiologique, cette plate-forme devrait faciliter le développement de nouvelles thérapies et de cultures spécifiques aux patients. d'un impact clinique de grande envergure.

Introduction

La mortalité liée au cancer dans le monde a atteint un bilan de 9,8 millions de décès en 2018¹, soulignant la nécessité de développer des thérapies améliorées. Malheureusement, le coût du développement de médicaments contre le cancer augmente, la mise au point d'un seul médicament coûtant environ 650 millions de dollars US² indiquant la nécessité d'améliorer les stratégies pour mettre au point de nouveaux médicaments anticancéreux. Les cellules souches cancéreuses (CSC), qui sont caractérisées par une chimiorésistance accrue³, la capacité d'auto-renouvellement, et la capacité de semer de nouvelles tumeurs⁴ sont pensés pour être responsables de la récurrence tumorale⁴, métastes⁵, et chemoresistance^4,6, qui contribuent tous à la capacité maligne de la tumeur et donc le nombre élevé de décès. Dans le cancer de l'ovaire, ces cellules se trouvent enrichies dans le liquide ascites malins dans la cavité péritonéale, une condition associée à de mauvais résultats cliniques¹. En raison des capacités malignes des CSC, on a tenté de mettre au point de nouveaux médicaments ciblant le SCC à utiliser en conjonction avec les chimiothérapies traditionnelles. Plusieurs défis accompagnent le développement de médicaments ciblant le SCC, notamment : 1) la difficulté d'étendre et de maintenir les CSC in vitro; 2) rareté des échantillons de patients; 3) pertinence physiologique de la plate-forme culturelle; et 4) hétérogénéité dans la sensibilité des médicaments entre les patients. Ce protocole décrit la mise en œuvre d'une plate-forme de culture 3D à haut débit qui peut surmonter chacun de ces défis. En particulier, ce système permet un dépistage rapide des médicaments à l'aide d'un petit nombre de CSC ovariens d'origine du patient, et est très favorable aux techniques d'analyse en aval. Bien qu'idéale pour l'étude du cancer de l'ovaire et des CCS, notre plate-forme est également utile pour étudier d'autres cancers et types de cellules différenciées dans des environnements 3D complexes.

Les modèles tridimensionnels complexes (3D) sont essentiels dans l'étude du microenvironnement tumoral (TME), qui est une niche 3D composée de cellules cancéreuses, de cellules de soutien non cancéreuses et de protéines de matrice extracellulaire (ECM)⁴. Cet environnement 3D se traduit par une morphologie cellulaire unique, des interactions cellule-cellule et cellule-matrice, la différenciation cellulaire, la migration cellulaire, la densité cellulaire et les gradients de diffusion par rapport à la culture cellulaire 2D traditionnelle in vitro⁴. Tous ces facteurs aboutissent à une réponse différentielle des médicaments dans les cultures 3D, montrant une résistance accrue aux médicaments et une pertinence physiologique^7,8. En raison du rôle du TME 3D dans la différenciation et la chimiorésistance du SCC, il est essentiel de dépister les médicaments ciblant le SCC dans les microenvironnements physiologiques. L'amélioration de la pertinence physiologique des plateformes de dépistage des médicaments du SCC a le potentiel d'améliorer le dépistage des médicaments par les patients, le développement de médicaments, la formulation de stratégies de traitement et, en fin de compte, les résultats cliniques. Il est tout aussi important que la plate-forme utilisée pour le dépistage des médicaments soit à haut débit et compatible avec les méthodes d'analyse en aval afin de minimiser le coût, le temps et le temps de traduction clinique des médicaments prometteurs⁹.

Actuellement, le TME complexe est le meilleur maintenu pour des applications de criblage de drogue par des modèles in vivo tels que des modèles syngénéiques de tumeur murine, les xénogreffes de ligne cellulaire-dérivées, et les modèles de xénogreffe patient-dérivé (PDX)^12,car ils fournissent physiologique Conditions. Cependant, la nature à faible débit de ces modèles, ainsi que le coût, le temps et les compétences techniques dont ils ont besoin limitent leur utilité dans les applications rapides et à haut débit de dépistage des médicaments¹³. Comme alternatives à ces modèles in vivo, de nombreux modèles 3D in vitro utilisant des hydrogels⁸, la culture dans les dispositifs microfluidiques ou «organe sur puce» dispositifs^10,14, et les cultures non-adhérents^3,8 ont également été développés, en raison de leur faible obstacle à l'entrée en termes de coût, de temps et de compétences requises.

Les plates-formes de culture hydrogel sont avantageuses dans le contrôle fin accordé sur la composition de matrice, les propriétés mécaniques, et la structure de matrice¹⁵; cependant, ils peuvent inhiber la culture cellulaire de haute densité¹⁴. En outre, la récolte des cellules à partir d'hydrogels peut compliquer l'analyse en aval, en raison des effets potentiellement nocifs des méthodes de récolte¹⁵. Les dispositifs microfluidiques, d'autre part, sont des dispositifs à micro-échelle qui permettent la détection de sortie dans le même dispositif et pour la culture cellulaire à des échelles physiologiquement pertinentes avec une consommation minimale de réactifs, diminution du temps de réaction, minimisation des déchets, et diffusion rapide¹⁴. Ces caractéristiques en font des plates-formes prometteuses pour étudier la toxicité, l'efficacité et la pharmacocinétique des médicaments. Cependant, les défis de la culture de cellules 3D efficaces, quantifiables, reproductibles et conviviales, ainsi que des systèmes de pompage volumineux et coûteux ont restreint les applications microfluidiques dans la recherche à haut débit¹⁰. Des configurations de détection efficaces et une mise en œuvre potentiellement difficile dans tous les domaines ont également entravé l'adoption généralisée de systèmes microfluidiques¹⁰.

En revanche, les sphéroïdes générés dans des conditions non adhérentes dans les mélangeurs rotatifs (nutators), les plaques d'attachement ultra-faibles et les gouttelettes suspendues n'incluent pas les composants de matrice définis par l'utilisateur. Ces méthodologies sont particulièrement pertinentes pour l'étude du cancer de l'ovaire car les conditions non adhérentes sont représentatives des conditions dans lesquelles les sphéroïdes se développent dans la cavité péritonéale⁵. Dans ces méthodes de culture non-adhérentes, les sphéroïdes de goutte de nutator et de pendaison ont été montrés pour montrer le compaction plus élevé, le remodelage, et la chimiorésistance comparés aux sphérooïdes produits dans les plaques d'attachement ultra-faibles, suggérant physiologique accru pertinence^16,17,18,19. En raison de la capacité accrue pour le dépistage à haut débit à partir de plus petites tailles de puits et le nombre minimal requis de cellules, la génération de sphéroïdes dans les plaques de chute suspendues est une plate-forme idéale pour le criblage de drogue. Ici, nous présentons une plate-forme physiologique 3D réglable dans les plaques de chute suspendues de 384 puits, qui est facile à mettre en œuvre et très favorable à l'analyse en aval, ce qui le rend idéal pour le dépistage à haut débit des médicaments contre le cancer de l'ovaire et les CSC ovariens.

Notre plate-forme physiologique 3D fournit tous les avantages de la culture 3D, y compris les contacts physiologiques de cellules-cellules, les gradients de diffusion, les densités de cellules, et les protéines naturellement produites d'ECM, qui peuvent contribuer aux réponses réalistes de drogue^{16, 17,18,19}. En outre, en générant ces sphéroïdes avec les CSC patients-dérivés, nous sommes en mesure de déterminer des réponses spécifiques du patient aux médicaments¹ avec de nombreuses répliques techniques simultanément, pour surmonter l'hétérogénéité qui peut être trouvée dans la tumeur patiente échantillons²⁰. En outre, la culture 3D a été montré pour améliorer le maintien des populations csc^3,16 et est donc représentatif des populations enrichies CSC dans les ascites⁷. Ceci combiné à une analyse facile en aval, y compris l'analyse de la cytométrie des débits de viabilité et les proportions du SCC, permet une évaluation optimale de l'efficacité du sCC ciblant les médicaments. Enfin, cette plate-forme physiologique est compatible avec l'imagerie à plusieurs moments au cours de l'expérience, l'évaluation de la mort cellulaire et la prolifération, l'organisation cellulaire et la morphologie avec immunohistochimie, la signalisation soluble avec ELISA sur conditionné phénotypes moyens, cellulaires avec cytométrie de flux, et expression de gène suivant PCR.

Protocole

Tous les échantillons de patients sont prélevés en vertu d'un protocole approuvé de la CISR auprès de patients consentants, dont les échantillons sont dé-identifiés après la collecte de la tumeur et des ascites.

1. Génération de sphéroïdes à partir de petits nombres de cellules dans 384-puits Hanging Drop Plates

1. Placez la plaque de chute suspendue dans un sonicator rempli d'eau déionisée stérile (DI) et sonicate pendant 20 min.
2. À l'intérieur d'une main gantée, retirez la plaque du sonicator et lavez-la avec de l'eau DI courante.
3. Laisser reposer la plaque dans un bain de 0,1 % d'acide pluronique pendant 24 h afin d'éviter l'adsorption protéique et l'adhérence sphéroïde aux puits.
4. Retirer les assiettes à l'aide d'une main gantée et rincer les deux côtés de la plaque avec de l'eau DI en cours d'exécution à fond.
5. Appuyez vigoureusement ou secouez la plaque à l'intérieur d'une armoire de biosécurité pour retirer l'eau des puits dans un environnement stérile.
6. Placez la plaque sous la lumière UV pendant 30 à 60 min de chaque côté pour stériliser les plaques et minimiser la contamination.
   REMARQUE: La plaque peut également être exposée au gaz d'oxyde d'éthylène dans une chambre pour la stérilisation.
7. Remplissez chaque puits d'une assiette de 6 puits avec 4 à 5 ml d'eau stérile autoclaved DI et sandwich la plaque de chute suspendue entre le couvercle et le fond de la plaque de 6 puits. Ajouter 800 à 1 000 l d'eau stérile de DI autour du rebord de la plaque de largage suspendu pour fournir un environnement humide, stable et stérile afin de minimiser le volume perdu à cause de l'évaporation (figure 1 A-C).
8. Pour les cellules cultivées en 2D, aspirez les cellules moyennes couvrant les cellules dans leur phase de croissance et lavez-les avec 1x phosphate tamponné saline (PBS) pour enlever des traces de sérum bovin foetal (FBS) dans le milieu de croissance, car il entrave l'action de la trypsine.
9. Aspirez le PBS et ajoutez 1,5-2 ml de 0,25 % de trypsine-EDTA au plat de culture tissulaire de 100 mm. Incuber les cellules pendant 5 min dans un incubateur réglé à 37 oC.
   REMARQUE: Les cellules peuvent se détacher à des vitesses différentes, de sorte que les plaques doivent être vérifiées sur un microscope léger sur le banc pour assurer le détachement cellulaire après 5 min. Ajuster le protocole de détachement par instructions du fournisseur lors de l'utilisation d'une ligne cellulaire.
10. Ajouter 6 à 8 ml de milieu cellulaire contenant du SIF ou tout sérum au plat pour neutraliser la trypsine, recueillir les cellules avec une tuyauterie sérologique de 10 ml et les déposer dans un tube conique de 15 ml.
11. Comptez les cellules en chargeant 10 l l de la suspension cellulaire de chaque côté d'un hémocytomètre et suivez le protocole de comptage associé.
12. Pour les cellules dérivées du patient prélevées sur des tumeurs solides primaires ou métastatiques ou d'ascites qui n'ont pas été cultivées en 2D, préparez des suspensions à cellule unique dans un milieu sans sérum (SFM) décrit précédemment³.
13. Traiter les tissus tumoraux comme précédemment décrit et stocker des suspensions de cellules individuelles pour une utilisation ultérieure dans le milieu de congélation approprié^21,22.
    1. Pour le tissu tumoral solide, hacher mécaniquement avec une lame de rasoir et filtrer la solution résultante à travers un filtre de 40 m avant d'isoler les cellules désirées à partir d'un gradient de densité^21,22.
    2. Pour les échantillons d'ascites, concentrer les cellules par centrifugation, lyser les globules rouges dans le tampon ammonium-chlorure-potassium (ACK), laver dans 1x PBS, puis passer à travers un filtre de 40 m et une aiguille de 28 G 4 fois²².
14. Pour l'isolement des CCS ovariens, triez les cellules avec cytométrie de flux comme décrit ci-dessous en détail.
15. Les cellules individuelles fraîchement isolées sont congelées pour être entreposées et décongelées au besoin pour l'expérimentation.
16. Pour préparer la suspension cellulaire pour le placage, calculez le volume souhaité de la solution cellulaire requise pour le placage : 20 L par gouttelettex X nombre total de gouttelettes, volume total de la solution nécessaire.
17. Diluer la concentration cellulaire à la concentration cellulaire désirée par 20 L (c.-à-d. 100 cellules dans une goutte de 20 l).
18. Mélanger délicatement la suspension cellulaire à l'aide d'une tuyauterie avant le placage afin d'assurer une distribution homogène des cellules et d'améliorer l'uniformité entre les gouttelettes.
    REMARQUE: Le surmélange de la suspension cellulaire peut entraîner la mort cellulaire et des débris dans les sphéroïdes suspendus.
19. Placer l'extrémité de la pipette dans le puits à un angle d'environ 45 degrés et le tuyau de 20 l de la solution cellulaire dans chaque puits de pendaison.
    REMARQUE: Les modèles de placage peuvent être ajustés en fonction du nombre de sphéroïdes nécessaires. Le placage des sphéroïdes dans tous les autres puits est plus sûr lorsque de grandes quantités de sphéroïdes ne sont pas nécessaires dans une expérience, car il empêche la fusion accidentelle des gouttelettes (Figure 1D, E). Si de grandes quantités de sphéroïdes sont nécessaires pour une expérience, plaquez chaque puits en laissant une rangée de puits de bordure de tous les côtés (Figure 1F).
20. Placez le couvercle de la plaque de 6 puits sur le dessus de la plaque suspendue et utilisez une bande thermoplastique extensible qui est insensible à la perte d'humidité, pour sceller les bords et empêcher l'évaporation supplémentaire des gouttelettes. Incuber dans un incubateur humidifié CO₂ standard (5 % CO₂, 37 oC).
21. Nourrir les gouttes suspendues une fois tous les 2 à 3 jours pour reconstituer le milieu de culture cellulaire pour les nutriments nécessaires en ajoutant 2 à 3 L à chaque sphéroïde contenant bien.
    REMARQUE: Après l'imagerie, il est toujours conseillé de nourrir les gouttes suspendues, car l'exposition à l'air pendant l'imagerie conduit à l'évaporation.

2. Ajout de la culture cellulaire moyenne à la pendaison Drop plaques sphéroïdes

1. Retirez la bande et le couvercle thermoplastiques dans une armoire de biosécurité et ajoutez 2 à 3 l du milieu de culture approprié à chaque puits contenant une goutte suspendue.
   REMARQUE: Le volume ajouté dépendra de la taille de la goutte et de la quantité de temps entre les aliments.
2. Après l'alimentation, recouvrir la plaque du couvercle supérieur et appliquer une bande thermoplastique fraîche sur les bords extérieurs avant de remettre la plaque dans l'incubateur.

3. Imagerie de contraste de phase de la morphologie sphéroïde

1. Retirer la bande thermoplastique sur les bords de la plaque dans une armoire de biosécurité.
2. Retirez soigneusement la plaque de sphéroïdes de 384 puits suspendue de l'armoire de biosécurité avec le couvercle toujours en place et placez-le dans le bac de microscope à un microscope épifluorescent.
3. Utilisez l'option d'imagerie en direct dans le logiciel d'imagerie à 4x, 10x ou 20x pour observer les sphéroïdes de chute suspendus et prendre les images désirées.
4. Après avoir sauvegardé les images, ralez la plaque à l'armoire de biosécurité et les cellules d'alimentation comme décrit ci-dessus.
5. Refermer la plaque avec une bande thermoplastique fraîche et remettre la plaque scellée dans l'incubateur.

4. Quantification de la prolifération et de la viabilité chez les sphéroïdes

1. Plaques sphéroïdes dans un nombre suffisant de puits pour obtenir des répliques techniques pour chaque point de temps (c.-à-d., jour 1 et jour 7) qui doit être examiné.
   REMARQUE: Les puits qui sont utilisés pour cet assay ne sont généralement pas utilisés à nouveau en raison de contaminants potentiels du colorant en résine.
2. Ajouter 2 ll de solution à base de résine filtrée aux puits désignés pour l'analyse de la prolifération comme s'ils alimentaient ces puits et incinaient pendant une période d'incubation prédéterminée.
   REMARQUE: Ce temps d'incubation peut varier en fonction du type de cellule et du nombre de cellules dans le sphéroïde. Il est conseillé de déterminer le temps d'incubation nécessaire avant de commencer les expériences de prolifération en commençant les mesures après 1 heure d'incubation, puis en mesurant à nouveau toutes les 30 minutes jusqu'à ce que le signal soit lu dans le plateau des puits témoins. Les lectures d'analyse peuvent être prises autant de fois que désiré. L'incubation est généralement de 4 h pour les sphéroïdes initiés avec 100 cellules cancéreuses.
3. Allumez d'abord le lecteur de microplaque suivi du logiciel de lecteur de plaque associé au moins 15 minutes avant la première lecture pour permettre à la machine de se réchauffer et de fixer la température interne à 22 oC, car la température peut affecter les lectures.
4. Ouvrez un protocole de plaque de 384 puits réglé avec 530/25 nm d'excitation et 590/35 nm longueurs d'onde d'émission avec optique réglé au fond, Gain réglé à 35, Lire la vitesse réglé à la normale, et lire le type réglé à Fluorescence .
5. Après la période d'incubation, ouvrez le sandwich suspendu dans une armoire de biosécurité et apportez la plaque de 384 puits avec le couvercle toujours en place pour le lecteur de plaque.
6. Placez la plaque de 384 puits avec le couvercle toujours en place dans le plateau de lecture de plaque, qui sera étendu une fois que la machine est réchauffée et cliquez sur Ok pour lire la plaque.
7. Remettre la plaque de puits à la base de 6 puits et la placer dans l'incubateur. Si tous les points de temps ont été lus pour la journée, refermer la plaque avant de la remettre dans l'incubateur.
8. Enregistrez l'expérience dans la fenêtre contextuelle, puis cliquez sur Oui lorsqu'il est invité Voulez-vous exécuter PowerExports pour La plaque 1 pour les données de sortie du logiciel de lecteur de plaques dans une feuille de calcul pour l'organisation.
9. Valeurs moyennes de fluorescence pour chaque condition et normaliser par la moyenne de l'état de contrôle pour rapporter le changement de pli dans la prolifération dans diverses conditions expérimentales.
10. En comparant le jour 1 au jour 7, normalisez en divisant par fluorescence moyenne de jour 1 pour obtenir le changement de pli dans la prolifération au fil du temps.
11. Calculez les barres d'erreur à l'aide d'une erreur standard de la moyenne et déterminez la signification statistique entre les groupes expérimentaux avec un test statistique approprié, comme le test T à deux queues de l'élève.

5. Évaluation de la toxicité des médicaments chez les sphéroïdes

1. Administration des médicaments
   1. À tout moment après la formation sphéroïde, livrer le médicament dilué à la concentration désirée de telle sorte qu'une dose de 2 L contient 10 fois la concentration finale désirée de drogue.
      REMARQUE: Il s'agit de supposer une évaporation de 2 L de la gouttelette de sorte que le volume de fin après le traitement médicamenteux est de 20 L. Par exemple, une dose de cisplatine de 50 millions d'euros aura une solution préparée de 500 M. Si les gouttelettes contiennent plus de 20 L, la concentration de médicaments et/ou le volume ajouté doivent être ajustés en conséquence.
   2. Traiter les échantillons témoins avec 2 L de milieu de culture cellulaire.
      REMARQUE: Le cisplatine est solubilisé dans l'eau. Par conséquent, les contrôles sont de 2 l de milieu de culture cellulaire; toutefois, si le véhicule médicamenteux est un solvant différent (p. ex., DMSO), les témoins doivent être un milieu de culture cellulaire avec une concentration égale de DMSO comme utilisé dans le traitement médicamenteux.
   3. Continuer à surveiller le médicament traité et les sphéroïdes témoins tout au long de la période d'incubation des médicaments avec la microscopie de phase pour avoir un dossier visuel de l'effet de la toxicité des médicaments ainsi qu'avec le colorant en résénaïne tel que décrit ci-dessus pour surveiller la viabilité cellulaire.
      REMARQUE: Typiquement, les médicaments sont ajoutés après 5 à 7 jours dans les gouttes suspendues et la toxicité mesurée après 48-72 hs, mais cela peut être varié en fonction de l'expérience. Les médicaments peuvent être ajoutés dès que des sphéroïdes stables se sont formés, généralement entre 1 et 4 jours.
2. Quantification de la toxicité des médicaments par comptage cellulaire
   1. À la fin du traitement médicamenteux, collectez 10 sphéroïdes chacun dans des puits de contrôle et traités par des médicaments à l'aide d'un tuyautde de 1 000 l et déposez chaque ensemble de sphéroïdes dans son propre tube de microcentrifuge.
   2. Décomposez les sphéroïdes en cellules individuelles par pipetting répétée.
      REMARQUE: Pour réduire les dommages potentiels aux cellules dus à la pipetage répété, la digestion enzymatique avec une enzyme telle que la trypsine peut être effectuée pour faciliter la génération de solutions à cellule unique avant la pipetting²³. La minimisation de la mort cellulaire due à la tuyauterie dépendra du type de cellule et devrait être optimisée en conséquence. Si vous êtes préoccupé par la mort due à la désagrégation, se référer à l'analyse avec le colorant de résine et l'analyse de cytotoxicité pour les méthodes alternatives qui ne nécessitent pas de désagrégation sphéroïde.
   3. Centrifuger les tubes pendant 5 min à 400 x g pour recueillir les cellules au fond des tubes de microcentrifuge et aspirer le supernatant.
   4. Ajouter 20 l de supports frais ou 1x PBS à chaque tube et bien mélanger.
   5. Ajouter le bleu Trypan à un rapport de 2 'L de tache bleue Trypan à 20 'L de suspension cellulaire.
   6. Chargez 10 L de cellules et suspension bleue Trypan dans chaque chambre de l'hémocytomètre et comptez les cellules sous un microscope léger, avec des cellules tachées bleues représentant des cellules mortes et des cellules non tachées représentant des cellules vivantes.
      1. Le pourcentage de cellules vivantes (Nombre de cellules vivantes et nombre total de cellules) x 100.

6. Caractérisation sphéroïde avec techniques histologiques

REMARQUE: Il y a deux options de moule 3D imprimées dans un polymère biocompatible pour reproduire les moules de tableau sphéroïdes faits par Ivanov et autres²⁴: 1) moule de puits de 20 qui peut contenir 28 l par puits et 2) moule de puits de 63 qui peut contenir 9 l par puits (figure 2D).

1. Stérilisez le moule histologiques et sa bordure en les essuyant avec 70% d'éthanol et attachez la bordure fermement autour du moule et déposez le moule droit. Les deux moules s'adaptent à environ 3 ml de liquide (3.203 ml pour le tableau de 20 sphéroïdes et 3.196 ml pour le tableau 63 sphéroïdes).
2. Enrober légèrement le tableau sphéroïde de 10 000 cSt Si à l'aide d'un coton-tige pointu pour faciliter l'enlèvement du gel de traitement du spécimen moulé dans les étapes suivantes.
3. Réchauffer le gel de traitement des échantillons jusqu'à ce qu'il soit liquéfié au micro-ondes pendant 10 à 20 s avec le bouchon desserré.
4. Ajouter entre 2,6 et 2,8 ml de gel de traitement fondu dans le moule jusqu'à ce qu'il soit à peu près à niveau avec le haut de la bordure.
5. En quelques minutes, une fois solidifié, retirer le gel de traitement en séparant la bordure du moule, puis en inversant le moule de tableau.
6. Insérez la pointe de pince à épiler entre la moisissure et la bordure pour les séparer soigneusement, puis utilisez un grattoir cellulaire pour aider à déloger la fonte du moule si elle ne se détache pas immédiatement.
7. Récoltez les sphéroïdes de la plaque de largage suspendue en pipeting le contenu d'un seul puits sur un plat de pétri à cellules de 100 ou 150 mm avec une tuyauterie de 1 000 l, et isolez le sphéroïde visuellement.
8. Pipet 5 -L du contenu du puits, y compris le sphéroïde identifié dans l'un des puits de tableau, jusqu'à ce que le tableau est rempli.
9. Attendez 3 min pour vous assurer que les sphéroïdes se sont installés au fond du tableau avant de pipetting doucement gel de traitement fondu dans chacun des puits en faisant attention de ne pas déranger les sphéroïdes.
10. Ajoutez du gel de traitement supplémentaire pour niveler le haut du tableau et une fois refroidi, placez le tableau sphéroïde solidifié dans une cassette étiquetée pour le traitement.
11. Immerger la cassette étiquetée dans 4 % de formaline pendant la nuit pour fixer les sphéroïdes à 4 oC, puis entreposer 70 % d'éthanol à 4 oC jusqu'à ce qu'ils soient prêts à être transformés.
12. Procédez avec le programme standard de paraffine de 1 h et intégrez ensuite les tableaux sphéroïdes de telle sorte que les tableaux traités sont orientés vers le haut avec le fond des puits les plus proches de la face de bloc.
13. Assurez-vous que les tableaux sont intégrés aussi plat que possible, avec la face inférieure rincer avec le fond du bloc et placer des blocs sur la glace.
14. Chargez le bloc sur le microtome et ajustez le bloc de telle sorte que la lame est parallèle à la face du bloc chargé.
15. Couper le tableau (profondeur de l'échantillon de 15 m) jusqu'à ce que le fond des puits de tableau soit atteint en s'assurant que les puits circulaires sont visibles sur les échantillons coupés.
16. Passer à une profondeur d'échantillon de 5 m et continuer à trancher et à recueillir des rubans. Vérifiez sous le microscope toutes les quelques tranches pour déterminer si la profondeur sphéroïde a été atteinte. Une fois que les sphéroïdes sont atteints recueillir chaque diapositive ultérieure jusqu'à ce que les sphéroïdes ne sont plus visibles.
17. Taiser chaque diapositive avec le protocole standard de H et E.

7. Live Dead Cytotoxicity Assay

1. À chaque goutte suspendue, ajoutez le colorant cellulaire vivant, la calcéine-AM à la concentration finale de 2 M, et le colorant cellulaire mort, l'éthidium homodimère-1 à la concentration finale de 4 M, en gardant à l'esprit que le volume de chute est de 20 l.
   REMARQUE: Essayez de garder les volumes ajoutés à un minimum, et ajoutez généralement 2 L des colorants combinés.
2. Remettre les assiettes dans un incubateur en sandwich dans une assiette de 6 puits avec un couvercle et incuber les sphéroïdes pendant 45 min à 37 oC.
   REMARQUE: Selon la taille des sphéroïdes, ce temps d'incubation varie considérablement. Par exemple, les sphéroïdes de moins de 400 m ne nécessitent généralement que 30 à 45 min de temps d'incubation, alors que les sphéroïdes plus gros de plus de 800 m ont nécessité jusqu'à 90 min de temps d'incubation. Les temps d'incubation doivent être optimisés pour l'expérience d'un individu.
3. Pour l'imagerie ultérieure, récoltez les sphéroïdes avec un tuyau de 1 000 livres l dans une armoire de biosécurité et déposez chaque sphéroïde sur des lames de microscope en verre prénettoyées.
4. Sphéroïdes d'image à travers le verre, sur un microscope confocal inversé.
   REMARQUE: Selon la proximité du microscope confocal au laboratoire dans lequel les sphéroïdes sont récoltés, les sphéroïdes peuvent être représentés dans la gouttelette originale du milieu placé sur la glissière ou enfermés dans 2% d'agarose si plus de stabilité est nécessaire pour le transport sphéroïde.
5. En utilisant le mode d'acquisition multidimensionnelle dans le logiciel de microscope, localiser le sphéroïde à l'aide de l'éclairage DIC à 10x grossissement, puis scanner le z-plan pour identifier les hauteurs englobant le sphéroïde.
6. Cliquez sur la série Z et fixez la limite supérieure et inférieure du z-scan légèrement plus haut que le haut du sphéroïde et légèrement inférieur au bas du sphéroïde.
7. Excitez les sphéroïdes à 488 nm pour la calcéine-AM (cellules vivantes; vert) et 561 nm pour l'éthime homodimer-1 (cellules mortes; rouge) avec la taille de l'étape recommandée par le logiciel, gain maximal et exposition minimale pour chaque couleur.
8. Cliquez sur Acquérir pour obtenir une image composite z-pile de cellules vivantes et mortes dans le sphéroïde.
9. Quantifier les proportions vivantes/mortes à l'aide d'un logiciel de traitement d'image pour quantifier un pourcentage d'intensité de pixels à partir du canal correspondant aux cellules vivantes par rapport au pourcentage d'intensité de pixels du canal correspondant aux cellules mortes du composite z-projection images.
   REMARQUE: En raison des limites dans la quantification d'une structure 3D avec une projection 2D, une méthode alternative pour quantifier la fluorescence vivante contre morte, dans les plaques de chute suspendues est d'utiliser un lecteur de plaque suivant le protocole inclus avec la calcéine-AM et l'éthidium homodimer-1 kit.

8. Immunofluorescence

1. Chauffer une solution d'agarose à faible fusion de 2 %, de sorte que la solution est visqueuse et juste au-dessus du point de fusion et placez-la sur une lame de microscope pour créer un lit mou d'agarose
2. Récoltez les sphéroïdes en poussant 20 L de PBS à travers la goutte sur le lit mou de 2% agarose.
   REMARQUE: Ceci devrait être fait rapidement de sorte que l'agarose ne se solidifie pas avant que les sphéroïdes soient incorporés.
3. Une fois que l'agarose refroidit et gels avec le sphéroïde récolté piégé à l'intérieur (moins de 5 min), ajouter 4% neutre tamponné formaline pour fixer les sphéroïdes. Alternativement, ajouter le méthanol glacé et fixer les sphéroïdes incorporés à l'agarose à -20 oC pendant 30 min.
4. Laver 3x pendant 5 min chacun avec 1x PBS, en jetant PBS après chaque lavage.
5. Bloquer pour 1 h à RT avec 10% de sérum (c.-à-d., sérum de cheval) et 0,15% solution de savon (Triton X-100) en 1x PBS.
6. Laver 3x pendant 5 min chacun avec 1x PBS, en jetant PBS après chaque lavage.
7. Taïre les sphéroïdes avec l'anticorps fluorescent désiré à la dilution recommandée ou prédéterminée d'anticorps (c.-à-d., phalloidin fluorescentà étiqueté à une dilution 1:100), incuber pendant au moins 90 min à température ambiante, couvert de lumière.
   REMARQUE: Les protocoles varient en fonction de l'anticorps et de la cible et la dilution des anticorps peut devoir être optimisée en fonction de l'expérience.
8. Visualisez les sphéroïdes souillés fluorescents avec le microscope confocal inversé utilisant des méthodes décrites dans la section précédente pour des sphéroïdes d'imagerie.
9. Les images composites de z-stack démontreront la morphologie 3D dans les sphéroïdes.

9. Collecte et analyse des populations de cellules souches cancéreuses atteintes de cytométrie de flux

1. Préparation des sphéroïdes pour l'analyse de cytométrie du flux
   1. Recueillir les sphéroïdes de chaque puits dans les plaques de chute suspendues à l'aide d'une tuyauterie de 1 000 l et les déposer dans un tube de centrifugeuse de 15 ml pour la désagrégation avec des tuyaux répétés.
   2. Comptez les cellules viables sur un hémocytomètre à l'aide de Trypan Blue pour déterminer le nombre et la concentration des cellules tels qu'ils sont décrits ci-dessus.
   3. Suspension des cellules Aliquot en cinq tubes de microcentrifuge, de sorte que chacun contient un minimum de 50 000 cellules.
   4. Centrifuger tous les tubes à 400 x g pendant 5 min dans un microcentrifugeur.
   5. Aspirez le supernatant de chaque tube et suspendez les granulés dans 100 l'amorti.
   6. Tubes d'étiquette "Non tachés", "DAPI", "APC-iso", "DEAB", et "ALDH/CD133", respectivement.
   7. Ajouter 0,5 L d'anticorps aPC-isotype au tube APC-iso et 1 l d'anticorps CD133 au tube ALDH/CD133 selon la recommandation de dilution en série et de fabricants.
   8. Ajouter 5 lde de RÉACTIF DEAB et 0,5 l d'ALDH au tube DEAB, et 1 l d'ALDH au tube ALDH/CD133.
   9. Vortex tous les tubes pendant environ 2 s et incuber à 37 oC pendant 45 min.
   10. Vortex tous les tubes à nouveau et centrifugeuse à 400 x g pendant 5 min dans un microcentrifugeur.
   11. Étiquetez les tubes FACS "Non tachés", "DAPI", "APC-iso", "DEAB", et "ALDH/CD133" et remplissez un contenant en mousse isolée à mettre de côté.
   12. Aspirate supernatant et resuspendre le contrôle « non taché » dans 400 'L FACS Buffer (1x PBS avec 2% FBS) et tous les autres tubes dans 400 'L de FACS DAPI Buffer (FACS Buffer avec 300 'M 4',6-diamidino-2-phenylindole).
   13. Placer les tubes dans le récipient avec de la glace jusqu'à ce qu'ils soient analysés sur un cytomètre d'écoulement.
       REMARQUE: Pour trier les cellules souches du cancer de l'ovaire, collectez toutes les cellules que le cytomètre mesure pour être ALDHMD et CD133MD avec des portes qui doivent inclure 0,5 % de signal APC non spécifique et 0,15 % de signal ALDHMD non spécifique. Au moins 10 000 cellules doivent être analysées pour obtenir des résultats fiables. Des détails supplémentaires peuvent être trouvés dans les publications récentes^3,17.
2. Analyse des populations d'ALDHMD/CD133MD à FlowJo
   1. Double cliquez sur l'icône FlowJo pour ouvrir le programme et faire glisser les fichiers .fcs obtenus à partir du logiciel de cytométrie de flux dans l'espace de travail.
   2. Double cliquez sur le fichier non taché et définir l'axe y à la hauteur de diffusion latérale (SSC-H) et l'axe x à la hauteur de diffusion vers l'avant (FSC-H).
   3. Cliquez sur le bouton T à côté de chaque axe pour ajuster l'échelle et la transformation afin de maximiser la séparation entre les différentes populations cellulaires.
   4. Cliquez sur le bouton de gating Polygon et dessinez une porte en polygone autour de la population cellulaire et étiquetez la population 'Cells'.
   5. Double clic sur la population de cellules dans l'espace de travail pour afficher uniquement les cellules de la population 'Cells', puis cliquez sur l'axe FSC pour changer le canal axe en largeur FSC, puis cliquez sur l'axe SSC et changer le canal axe vers le FSC-H.
   6. Choisissez l'outil de porte Rectangle et dessinez un rectangle autour de la population de cellules la plus dense de gauche couvrant l'ensemble de l'axe y afin d'exclure les doublets potentiels vers la droite de la fenêtre et d'étiqueter cette porte 'Single Cells'.
   7. Cliquez et copiez à droite les cellules et la porte des cellules individuelles imparables et collez-les sous chaque échantillon dans l'espace de travail.
   8. Double clic la porte des cellules uniques imisée sous l'échantillon DAPI dans l'espace de travail pour afficher la population de cellules uniques à partir de ce tube d'échantillon et cliquez sur l'axe FSC et changer le canal axe vers le canal DAPI - Zone.
   9. Cliquez sur l'axe SSC et changer le canal de l'axe à Histogram.
      REMARQUE: Les cellules vivantes seront vers la gauche car elles excluent DAPI, tandis que les cellules mortes prendront dans le DAPI et apparaîtront vers la droite du graphique.
   10. Cliquez sur le bouton T à côté de l'axe DAPI et cliquez sur Personnaliser l'axe pour ajuster l'échelle afin de maximiser la séparation entre les pics négatifs DAPI et DAPI.
       REMARQUE: Une fenêtre apparaîtra avec des options de mise à l'échelle. Souvent, la mise en place du champ échelle à Biex et l'ajustement des décennies et de la base de largeur extra négatives donneront la plus grande séparation.
   11. Cliquez sur Appliquer dans la fenêtre contextuelle pour appliquer des modifications de mise à l'échelle, choisissez le bouton De la porte de gamme et étalez-le sur le pic négatif DAPI, correspondant à la population de cellules vivantes.
   12. Étiquetez cette porte 'Live Cells' et cliquez à droite pour copier la porte 'Live Cells' pour la coller sous la porte 'Single Cells' sous les tubes 'APC-iso', 'DEAB' et 'ALDH/CD133' pour sélectionner la même partie de cellules vivantes dans chaque tube d'échantillon.
   13. Ensuite, cliquez deux fois sur la population de cellules vivantes nichée sous le fichier d'échantillon APC-iso et passez l'axe x à l'ALDH — Canal de zone et l'axe y au canal APC — Zone.
   14. Encore une fois, ajuster l'échelle d'axe en cliquant sur le bouton T et personnaliser l'axe de chaque axe de sorte que les événements sont localisés dans la région inférieure gauche de l'intrigue et sélectionnez l'option de porte Quad et cliquez sur la fenêtre de l'intrigue pour établir une porte quadrante .
   15. Ajuster l'intersection de la porte de façon à ce qu'environ 0,5 % de la population se trouve en haut à gauche de la fenêtre de la parcelle ou quadrant « APC positif ».
       REMARQUE: Ce 0,5 % représente la coloration non spécifique de l'isotype APC.
   16. Cliquez à droite sur chaque étiquette de quadrant individuellement dans l'espace de travail et renommez-les de manière appropriée. Contrôlez ou commandez chaque étiquette de porte de quadrant dans l'espace de travail et copiez-la.
       REMARQUE: 'Q1' représente les cellules CD133MD; 'Q2' représente les cellules CD133 et ALDHMD; 'Q3' représente les cellules ALDHMD; et 'Q4' représente les cellules CD133- et ALDH.
   17. Collez les portes du quadrant sur la population de cellules vivantes nichée sous le fichier «DEAB». Ajustez la ligne verticale de façon à ce qu'environ 0,15 % de la population cellulaire se trouve dans le quadrant « ALDHMD » en prenant soin de ne pas déplacer la ligne horizontale.
       REMARQUE: Ce 0,15% représente un signal ALDH non spécifique.
       1. Pour vous assurer que la ligne horizontale n'a pas changé de position, copiez les nouvelles portes de quadrant imparées sous le fichier DEAB et collez-les sur les cellules vivantes sous le fichier Iso APC. Sélectionnez Oui lorsqu'on vous demande de remplacer la porte quadrantexistante.
       2. Vérifiez dans l'espace de travail que le pourcentage de «CD133» est encore d'environ 0,5 sous le fichier 'APC-iso'.
   18. Copiez et collez les portes du quadrant à la population de « cellules vivantes » du fichier ' ALDH/CD133'.
       REMARQUE: Le pourcentage de la population cellulaire viable présente dans le quadrant supérieur droit sera le pourcentage d'ALDHMD et de CD133MD doublement positif dans l'échantillon.

Résultats

Les sphéroïdes formés avec des lignées cellulaires ou des CCS dérivés du patient peuvent être formés avec une gamme de petits nombres de cellules dans les gouttelettes suspendues (Figure 2A). Les sphéroïdes se forment de façon fiable avec aussi peu que 10 cellules par puits, ce qui permet la conservation d'échantillons de patients rares. Les cellules de ces sphéroïdes sont entourées d'autres cellules en 3 dimensions comme elles le seraient in vivo, ce qui permet des contacts c...

Discussion

La plate-forme de plaque de chute suspendue de 384 puits pour la formation sphéroïde 3D est un outil facile à implémenter pour n'importe quel laboratoire de biologie cellulaire ou de biologie du cancer. Cette plate-forme physiologique permet l'étude des lignées cellulaires, ainsi que des échantillons de patients primaires dans des cultures 3D physiologiquement pertinentes tout en permettant le dépistage à haut débit des médicaments. La plate-forme garantit également que les conditions de culture sont très r?...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% trypsin-EDTA	Gibco	ILT25200056
10 mL serological pipet	Fisher Scientific	13-678-11E
10,000 cSt Si oil	Millipore Sigma	63148-62-9	Used to coat spheroid array mold to facilitate removal of tissue processing gels, like Histogel, from the mold.
100 mm tissue culture dish	Thermo Scientific	130182
15 ml conical tube	Celltreat	FL4021
1X DMEM for Serum Free Medium	Gibco	11965-092
1X F12 for Serum Free Medium	Gibco	11765-054
1X phosphate buffered saline (PBS)	Gibco	ILT10010023
4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Thermo Fisher	D1306
40 µm filter	Fisher Scientific	22363547
6-well plate	Fisher Scientific	353046
Accutase	Innovative Cell Technologies Inc.	1449	A gentle cell detachment enzyme composed of proteolytic and collagenolytic enzymes.
ACK Lysing Buffer	Thermo Scientific	A1049201
alamarBlue	Invitrogen	DAL1025	Resazurin dye used to measure viability and proliferation of cells based on their ability to reduce resazurin to resorufin, which is highly fluorescent.
ALDEFLUOR assay kit	Stem Cell Tech	1700	Kit to identify stem and progenitor cells that express high levels of aldehyde dehydrogenase , an indicator of cancer stem cells. The kit is composed of ALDEFLUOR Reagent, DEAB, Hydrochloric Acid, Dimethylsulphoxide, and ALDEFLUOR Assay Buffer.
ALDEFLUOR Diethylaminobenzaldehyde (DEAB)	Stem Cell Tech	1705	Diethylaminobenzaldehyde (DEAB) is an inhibitor of ALDH isozymes, used to determine non-specific ALDH staining.
Andor iXon x3 CCD Camera	Oxford Instruments	-
Antibiotics and Antimycotics	Gibco	15240-062
APC-isotype IgG2b	Miltenyi biotec	130-092-217	Isotype control to quantify non-specific staining of IgG2b antibodies.
B27 Supplement	Gibco	17504044
basic Fibroblast Growth Factor	Stem Cell Technologies	78003.1
BD Lo-Dose U-100 Insulin Syringes	Fisher Scientific	14-826-79
BioTek Synergy HT Microplate Reader	BioTek	7091000
CD133-APC	Miltenyi biotec	130-113-184	Fluorescent antibody targeting CD133, a cancer stem cell marker.
cellSens Dimension Software	Olympus
Cisplatin	Sigma-Aldrich	P4394	Platinum based chemotherapy agent that functions as an alkylating agent that disrupts DNA.
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)	Invitrogen	D1306
Epidermal Growth Factor	Gibco	PHG0311
EVOS XL Core Cell Imaging System	Life Technologies	AME3300
Fetal Bovine Serum - premium (FBS)	Atlanta Biologicals	S11150
Ficoll 400	Sigma-Aldrich	F4375
Hemacytometer	Hausser Scientific	1490
Histogel	Thermo Scientific	HG-4000-012	Tissue processing gel that can penetrate and hold the specimen within the gel while preventing discoloration around the specimen upon staining.
Human Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells	Lonza	PT-5006
Human Microvascular Endothelial Cells	Lonza	CC2543
Insulin-Transferrin-Selenium Supplement	Gibco	51500-056
Live/Dead viability kit	Invitrogen	L3224	Kit for the fluorescence based detection of live (calcein-AM) and dead cells (Ethidium Homodimer-1).
MEM Non-essential Amino Acids	Gibco	11140-050
MetaMorph 7.8 Software	Molecular Devices	-
Olympus IX81 Inverted Confocal Microscope	Olympus	-
Olympus IX83 Research Inverted Microscope	Olympus
Parafilm M	Thomas Scientific	7315D35	Thermoplastic polymer strips that serve to limit droplet evaporation in hanging drop plates while still allowing for gas exchange.
Perfecta 3D 384 Well Hanging Drop Plates	3D Biomatrix	HDP1384-8	Available through Sigma-Aldrich
phalloidin AlexaFluor488	Invitrogen	A12379	Phalloidin is a peptide to fluorescently label F-actin in fixed cells.
ProJet 3500 HD Max	3D Systems	-	3D printer
Sterile DI water	Fisher Scientific	353046
Trypan Blue	Gibco	15250061	Azo dye used to differentiate between live and dead cells based on its ability to pass through the damaged membrane of dead cells, but not the intact membrane of live cells.
VisiJet M3 Crystal	3D Systems	-	A biocompatible polymer material for 3D printing.
Yokogawa CSU-X1 Confocal Scanner Unit	Yokogawa	-