Физиологические пациент выведенных 3D сфероидов для анти-неопластических наркотиков скрининга целевой рак стволовых клеток

Резюме

Этот протокол описывает генерацию сфероидов, полученных из пациента, и анализ вниз по течению, включая количественную оценку пролиферации, тестирование цитотоксичности, цитометрию потока, оленивание иммунофлюоресценции и конфокальные изображения, для оценки препарата потенциал кандидатов в качестве анти-неопластической терапии. Этот протокол поддерживает прецизионную медицину с определением специфических препаратов для каждого пациента и стадии заболевания.

Аннотация

В этом протоколе мы описываем процедуру генерации опухолевых сфероидов в 384-хорошо висячих каплях, чтобы обеспечить высокосквозной скрининг противораковой терапии в физиологически репрезентативной микросреде. Мы описываем формирование пациентов полученных сфероидов стволовых клеток, а также, манипуляции этих сфероидов для тщательного анализа после лечения наркотиками. В частности, мы описываем сбор сфероидной морфологии, пролиферации, жизнеспособности, токсичности наркотиков, фенотипа клеток и данных о локализации клеток. Этот протокол в значительной степени фокусируется на методах анализа, которые легко реализуются с помощью 384-хорошо висящей платформы drop, что делает его идеальным для скрининга с высокой пропускной проликстью наркотиков. Хотя мы подчеркиваем важность этой модели в исследованиях рака яичников и исследования стволовых клеток рака, 384-хорошо платформа поддается исследованию других типов рака и моделей заболеваний, расширяя полезность платформы во многих областях. Улучшая скорость персонализированного скрининга на наркотики и качество результатов скрининга за счет легко реализуемых физиологически репрезентативных 3D культур, эта платформа, по прогнозам, поможет в разработке новых терапевтических и специфических для пациентов стратегии лечения, и, таким образом, имеют широкое клиническое воздействие.

Введение

Смертность от рака во всем мире достигла 9,8 миллионаслучаев смерти в 2018 году 1, что подчеркивает необходимость развития улучшенной терапии. К сожалению, стоимость разработки противораковых препаратов растет, при этом разработка одного лекарства стоимостью около 650 миллионов долларов США² указывает на необходимость совершенствования стратегий разработки новых противораковых препаратов. Раковые стволовые клетки (CSCs), которые характеризуются повышенной химиорезистентности³, способность к самообновлению, и способность семян новыхопухолей^4, как полагают, несет ответственность за рецидив опухоли⁴, метастаз 5 , и химиорезистентность^4,6, которые все способствуют злокачественной способности опухоли и, следовательно, высокий уровень смертности. При раке яичников, эти клетки находятся обогащенные в злокачественных асцитов жидкости в полости перитонеальной полости, состояние, связанное с плохими клиническими исходами¹. В результате злокачественных возможностей CSCs, наблюдается толчок к разработке новых CSC ориентации наркотиков для использования в сочетании с традиционной химиотерапии. Существует ряд проблем, которые сопровождают разработку CSC ориентации наркотиков, включая: 1) трудности в расширении и поддержании CSCs in vitro; 2) нехватка образцов пациентов; 3) физиологическая значимость культурной платформы; и 4) неоднородность в чувствительности к лекарственным препаратам между пациентами. В этом протоколе излагается реализация платформы 3D-культуры с высокой пропускной стоимостью, которая может преодолеть каждую из этих проблем. В частности, эта система позволяет быстро скрининг атиса с использованием небольшого числа пациентов полученных яичников CSCs, и в значительной степени поддается вниз по течению методов анализа. В то время как идеально подходит для изучения рака яичников и CSCs, наша платформа также ценна в изучении других видов рака и дифференцированных типов клеток в сложных 3D-средах.

Сложные 3-мерные (3D) модели имеют решающее значение при изучении микроокружения опухоли (TME), которая представляет собой 3D нишу, состоящую из раковых клеток, нераковых поддерживающих клеток и внеклеточных матричных (ECM) белков⁴. Эта 3D-среда приводит к уникальной морфологии клеток, клеток и клеточной матрицы взаимодействий, дифференциации клеток, миграции клеток, плотности клеток, и диффузии градиентов по сравнению с традиционной 2D-клеточной культуры в пробирке⁴. Все эти факторы кульминацией дифференциальной реакции наркотиков в 3D культур, проявляя повышенную лекарственную устойчивость и физиологическую актуальность^7,8. В связи с ролью 3D TME в дифференциации CSC и химиорезности, очень важно, чтобы экран для CSC ориентации наркотиков в физиологических микросредах. Улучшение физиологической значимости платформ скрининга наркотиков CSC имеет потенциал для улучшения пациента конкретных скрининга наркотиков, разработка лекарственных средств, формулировка стратегий лечения, и в конечном итоге клинические результаты. Не менее важно, чтобы платформа, используемая для скрининга лекарственных средств, была высокой пропускной способом исовместима с методами анализа вниз по течению, чтобы свести к минимуму затраты, время и время клинического перевода перспективных препаратов 9.

В настоящее время комплекс TME лучше всего поддерживать для применения скрининга наркотиков через in vivo модели, такие как морин сингенных моделей опухолей, клеточной линии полученных ксенотрансплантатов, и пациента полученных ксенотрансплантата (PDX) модели¹², как они обеспечивают физиологические Условия. Тем не менее, низкая пропускная стоимость этих моделей, а также, стоимость, время и технические навыки, которые они требуют ограничивает их полезность в быстрой, высокой пропускной стьюбиния наркотиков скрининга приложений¹³. В качестве альтернативы этим моделям in vivo, многие модели in vitro 3D, используя гидрогели⁸, культуры в микрофлюидных устройствах или устройствах "орган-на-чипе"^10,14, и неприсоединения культур^3,8 были также разработаны, в связи с их низким барьером для входа с точки зрения стоимости, времени и требуемого набора навыков.

Платформы культуры гидрогеля выгодны в тонком контроле, предоставляемом над матричной композицией, механическими свойствами и матричной структурой^15; однако, они могут ингибировать культуру клетки высокой плотности^14. Кроме того, сбор клеток из гидрогелей может осложнить анализ ниже по течению, из-за потенциально вредного воздействия методов сбора урожая^15. Микрофлюидические устройства, с другой стороны, являются микромасштабными устройствами, которые позволяют обнаруживать выход в пределах одного устройства и для клеточной культуры в физиологически значимых масштабах с минимальным потреблением реагентов, снижением времени реакции, минимичными отходами и быстрая диффузия¹⁴. Эти характеристики делают их перспективными платформами для исследования токсичности, эффективности и фармакокинетики. Тем не менее, проблемы эффективной, количественной, воспроизводимой и удобной для пользователя 3D-клеточной культуры, а также громоздких и дорогостоящих насосных систем ограничили микрофлюидные приложения в высокопроизводительных исследованиях^10. Эффективные установки обнаружения и потенциально трудное внедрение в различных областях также препятствуют широкому внедрению микрофлюидных систем^10.

Напротив, сфероиды, генерируемые в неприсоединения в вращающихся смесителях (нутаторах), сверхнизких пластинах крепления и висячих каплях, не включают в себя матричные компоненты, определяемые пользователем. Эти методики особенно актуальны для изучения рака яичников, так как несоблюдение условий являются репрезентативными условий, в которых сфероиды растут в полости перитонеальной полости^5. В рамках этих неприсоединения методы культуры, nutator и висит падение сфероидов было показано, чтобы показать более высокое уплотнение, ремоделирование, и химиорезистентность по сравнению с сфероидами, генерируемых в ультра-низких пластин вложения, предлагая увеличение физиологических актуальность^16,17,18,19. Из-за увеличения емкости для высокопроизводительного скрининга от меньших размеров скважин и минимальных требуемых номеров клеток, генерация сфероидов в висячих пластинах является идеальной платформой для скрининга наркотиков. Здесь мы представляем настраиваем 3D физиологические платформы в 384-хорошо висит падение пластин, что легко реализовать и высоко поддается вниз по течению анализа, что делает его идеальным для высокой пропускной способности наркотиков скрининга рака яичников и яичников CSCs.

Наша 3D физиологическая платформа обеспечивает все преимущества 3D-культуры, в том числе физиологические контакты клеток, градиенты диффузии, плотность клеток, и естественно производства белков ECM, которые могут способствовать реалистичным лекарственным реакциям^{16, 17,18,19}. Кроме того, генерируя эти сфероиды с помощью CSCs, полученных из пациента, мы можем определить конкретные реакции пациента на препараты¹ с большим количеством технических реплик одновременно, чтобы преодолеть неоднородность, которая может быть найдена в опухоли пациента образцы²⁰. Кроме того, 3D-культура была показана дляповышения поддержания популяций CSC 3,¹⁶ и, таким образом, является репрезентативным для обогащенных популяций CSC в ascites⁷. Это в сочетании с легким анализом вниз по течению, включая анализ цитометрии потока жизнеспособности и пропорций CSC позволяет оптимально оценивать эффективность CSC, нацеленную на эффективность препарата. Наконец, эта физиологичная платформа совместима с визуализацией в несколько точек времени в ходе эксперимента, оценкой гибели клеток и пролиферации, организацией клеток и морфологией с иммуногистохимией, растворимым сигнализирующим с ELISA на условии средние, клеточные фенотипы с цитометрией потока и экспрессией генов после ПЦР.

протокол

Все образцы пациентов собираются в соответствии с утвержденным протоколом IRB от согласных пациентов, чьи образцы де-идентифицированы после удаления опухоли и асцита.

1. Поколение сфероидов из малых номеров клеток в 384-хорошо висячие пластины Drop

1. Поместите висячие пластины капли в звуковой, наполненный стерильной деионированной (DI) воды и sonicate в течение 20 минут.
2. С перчаткой стороны, удалить пластину из звукового и мыть его с проточной водой DI.
3. Разрешить пластины сидеть в ванне 0,1% Pluronic кислоты в течение 24 ч, чтобы предотвратить адсорбцию белка и сфероид присоединения к скважинам.
4. Удалить пластины с перчатками стороны и промыть обе стороны пластины с проточной водой DI тщательно.
5. Энергично нажмите или встряхнуть пластину внутри шкафа биобезопасности, чтобы удалить воду из колодцев в стерильной среде.
6. Поместите пластину под ультрафиолетовым светом в течение 30-60 минут с каждой стороны, чтобы стерилизовать пластины и свести к минимуму загрязнение.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Пластина также может подвергаться воздействию оксида этилена в камере для стерилизации.
7. Заполните каждый колодец из 6-колодец пластины с 4-5 мл стерильной воды autoclaved DI и бутерброд висит падение пластины между крышкой и нижней части 6-колодец пластины. Добавьте 800-1000 л стерильной воды DI вокруг обода висячей пластины капли, чтобы обеспечить влажную, стабильную и стерильную среду, чтобы свести к минимуму объем, потерянный для испарения(Рисунок 1 A-C).
8. Для 2D выращенных клеток, аспирсреднего покрытия клеток в их бревенчатой фазе роста и мыть с 1x фосфат буферного солине (PBS), чтобы удалить следы сыворотки крупного рогатого скота плода (FBS) в среде роста, так как это препятствует действию трипсина.
9. Аспирировать PBS и добавить 1,5-2 мл 0,25% трипсин-EDTA в 100 мм ткани культуры блюдо. Инкубировать клетки в течение 5 мин в инкубаторе установлен до 37 градусов по Цельсию.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки могут отсоединяться с разной скоростью, поэтому пластины должны быть проверены на скамейке световой микроскоп, чтобы обеспечить отслоение клеток после 5 мин. Отрегулируйте протокол отслоения на поставщика инструкции при использовании клеточной линии.
10. Добавьте 6-8 мл клеточной среды, содержащей FBS или любую сыворотку, к блюду, чтобы нейтрализовать трипсин, собрать клетки с серологическим пайпетом 10 мл и успокоить их в конической трубке объемом 15 мл.
11. Подсчитайте клетки, загрузив 10 л клеточной подвески с каждой стороны гемоцитометра и следуйте связанному протоколу подсчета.
12. Для пациентов полученных клеток, собранных из первичных или метастатических твердых опухолей или из асцитов, которые не были 2D культивируется, подготовить одноклеточных суспензий в сыворотке свободной среде (SFM), описанные ранее³.
13. Обработка опухолевых тканей, как описано ранее и хранить одноклеточные суспензии для последующего использования в соответствующей среде замораживания^21,22.
    1. Для твердой ткани опухоли, фарш механически с лезвием бритвы и фильтр в результате решения через фильтр 40 мкм перед изоляцией желаемых клеток от градиента плотности^21,22.
    2. Для ascites образцов, концентрат клетки центрифугации, лисиц красных кровяных клеток в буфере аммония-хлорида -калия (ACK), мыть в 1x PBS, а затем пройти через фильтр 40 мкм и 28 G иглы 4 раза²².
14. Для изоляции ЦИКов яичников, сортировать клетки с цитометрией потока, как описано ниже в деталях.
15. Свежеизолированные одиночные ячейки замораживаются для хранения и размораживаются, когда это необходимо для экспериментов.
16. Чтобы подготовить суспензию ячейки к покрытию, вычислите необходимый объем клеточного раствора, необходимого для покрытия: 20 qL за падение X общее количество капель и общий объем раствора.
17. Разбавить концентрацию клеток до желаемой концентрации клеток на 20 л (т.е. 100 клеток при падении на 20 л).
18. Смешайте клеточной подвески осторожно с помощью пипетки перед покрытием, чтобы обеспечить однородное распределение клеток и улучшить единообразие между каплями.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Пересмешивание суспензии клетки может привести к гибели клеток и мусора в висячих сфероидов капли.
19. Поместите кончик пипетки в колодец под углом около 45 "и пайпет 20 л клеточного раствора в каждом висячих капли хорошо.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Шаблоны покрытия могут быть скорректированы в зависимости от количества необходимых сфероидов. Покрытие сфероидов в любой другой скважине безопаснее, когда большое количество сфероидов не требуется в эксперименте, потому что это предотвращает случайное слияние капель(Рисунок 1D, E). Если для эксперимента необходимо большое количество сфероидов, пластины каждый колодец, оставляя один ряд пограничных скважин со всех сторон(рисунок 1F).
20. Поместите крышку 6-колодец обратно на верхней части висячие пластины падение и использовать эластичный термопластичной полосой, которая нечувствительна к потере влаги, чтобы запечатать края и предотвратить дополнительное испарение капель. Инкубировать в стандартном CO₂ увлажняемом инкубаторе (5% CO_2,37 градусов по Цельсию).
21. Корм апогея капли один раз в 2-3 дня для пополнения среды клеточной культуры для необходимых питательных веществ, добавив 2-3 зл к каждому сфероиду, содержащему хорошо.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После визуализации всегда рекомендуется кормить подвесные капли, так как воздействие воздуха во время визуализации приводит к испарению.

2. Добавление клеточной культуры Средний висячие Drop Сфероидные пластины

1. Снимите термопластиковую полоску и крышку в шкафу для биобезопасности и добавьте 2-3 л соответствующей среды культуры к каждому хорошо содержащему висящую каплю.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Добавленный объем будет зависеть от размера капли и количества времени между кормлениями.
2. После кормления накройте тарелку верхней крышкой и нанесите свежую термопластичной полосой на внешние края, прежде чем положить тарелку обратно в инкубатор.

3. Фазовая контрастная визуализация сфероидной морфологии

1. Удалите термопластиковую полоску по краям пластины в шкафу для биобезопасности.
2. Тщательно удалите 384-хорошо висит падение сфероидов пластины из биобезопасности шкаф с крышкой еще на месте и поместите его в микроскоп лоток на эпифлуоресцентный микроскоп.
3. Используйте опцию живой визуализации в программном обеспечении для визуализации в 4x, 10x или 20x, чтобы наблюдать за висячими сфероидами и принимать желаемые изображения.
4. После сохранения изображений, принять пластины обратно в кабинет биобезопасности и кормить клетки, как описано выше.
5. Запечатайте тарелку со свежей термопластичной полосой и поместите запечатанную тарелку обратно в инкубатор.

4. Количественная оценка распространения и жизнеспособности в сфероидах

1. Плита сфероидов в достаточном количестве скважин, чтобы получить йgt;10 технических репликаторов для каждого момента времени (т.е. день 1 и день 7), который должен быть рассмотрен.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Скважины, которые используются для этого ассея, как правило, не используются снова из-за потенциальных загрязняющих веществ из красителя resazurin.
2. Добавьте 2 зЛ отфильтрованного раствора на основе резазурина к скважинам, предназначенным для анализа пролиферации, как если бы они питались этими скважинами и инкубировали в течение заранее определенного инкубационного периода.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это время инкубации может варьироваться в зависимости от типа клеток и количество клеток в сфероид. Рекомендуется определить необходимое время инкубации, необходимое до начала экспериментов по распространению, начав измерения после 1 часа инкубации, а затем повторно измеряя каждые 30 минут до тех пор, пока сигнал считывания в контрольных скважин плато. Показания сажа можно взять столько раз, сколько пожелает. Инкубация, как правило, 4 ч для сфероидов, инициированных с 100 раковых клеток.
3. Включите микроплитустого читателя, за которым сначала последовало связанное программное обеспечение для чтения пластин по крайней мере за 15 минут до первого чтения, чтобы машина прогрелась и закрепила внутреннюю температуру при температуре 22 градусов по Цельсию, так как температура может повлиять на показания.
4. Откройте 384-колодец пластины протокол аус с 530/25 нм возбуждение и 590/35 нм длины эмиссии с оптикой установить на дно, Gain установить до 35, Читать Скорость установлена на нормальный, и читать тип установлен на флуоресценции .
5. После инкубационного периода, откройте висячие капли бутерброд в шкаф биобезопасности и принести 384-ну пластины с крышкой еще на месте, чтобы плита читателя.
6. Поместите 384-ну хорошо пластины с крышкой еще на месте в лоток считывателя пластины, которая будет расширена, как только машина нагревается и нажмите Ok читать пластины.
7. Верните пластину скважины на 6-ну хорошую основу и поместите ее в инкубатор. Если все временные точки были прочитаны в течение дня, запечатать пластину, прежде чем поместить его обратно в инкубатор.
8. Сохранить эксперимент в всплывающем окне, а затем нажмите Да, когда побудило Вы хотите выполнить PowerExports для плиты 1 для вывода данных из программного обеспечения чтения пластин в электронную таблицу для организации.
9. Средние значения флуоресценции для каждого состояния и нормализовать в среднем условие контроля сообщить изменения раза в пролиферации в различных экспериментальных условиях.
10. При сравнении день 1 к дню 7, нормализуется путем деления на день 1 средняя флуоресценция, чтобы получить изменения раза в распространении с течением времени.
11. Рассчитать бары ошибок, используя стандартную погрешность среднего и определить статистическую значимость между экспериментальными группами с соответствующим статистическим тестом, таким как двуххвостый T-тест студента.

5. Оценка токсичности лекарств в сфероидах

1. Медикаментов
   1. В любое время после образования сфероидов доставить препарат, разбавленный до нужной концентрации, так что 2 юЛ доза содержит 10x желаемой конечной концентрации препарата.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это предполагает испарение 2 зл от капли, так что окончание объема после медикаментозного лечения составляет 20 зл. Например, доза цисплатина в 50 км будет иметь подготовленный раствор в 500 мкм. Если капли содержат более 20 кл, то концентрация препарата и/или добавленный объем должны быть соответствующим образом скорректированы.
   2. Лечить контрольные образцы с 2 ЗЛ среды клеточной культуры.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Цисплатин растворяется в воде. Таким образом, контроль 2 зл клеточной среды культуры; однако, если средство снадобья другое растворитель (например, DMSO), то управление должно быть средством культуры клетки с равной концентрацией DMSO как использовано в обработке снадобья.
   3. Продолжайте контролировать лечение препарата и контроль сфероидов на протяжении всего периода инкубации препарата с фазовой микроскопией, чтобы иметь визуальный отчет о влиянии токсичности наркотиков, а также с красителем resazurin, как описано выше, чтобы контролировать жизнеспособность клеток.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, препараты добавляются после 5-7 дней в подвесных капель и токсичности измеряется после 48--72 hs, но это может быть разнообразны в зависимости от эксперимента. Препараты могут быть добавлены, как только стабильные сфероиды сформировались, как правило, между 1-4 дней.
2. Количественная токсичность лекарств при подсчете клеток
   1. В конце времени лечения наркотиками, собрать 10 сфероидов каждый из контроля и наркотиков лечение скважин с помощью 1000 мл пипеты и депозит каждого набора сфероидов в свою собственную микроцентрифугую трубку.
   2. Разбейте сфероиды на одиночные клетки путем повторного пипетки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы уменьшить потенциальное повреждение клеток из-за повторного пипеттинг, ферментальное пищеварение с ферментом, таким как трипсин может быть выполнено для облегчения генерации одноклеточных растворов до pipetting²³. Минимизация клеточной смерти из-за пипетки будет зависеть от типа клеток и должна быть оптимизирована соответствующим образом. Если обеспокоены смертью из-за дезагрегирования, обратитесь к анализу с красителя резазурина и цитотоксичность анализ альтернативных методов, которые не требуют сфероид ной дезагрегации.
   3. Центрифуга труб в течение 5 мин на 400 х г, чтобы собрать клетки в нижней части микроцентрифуговых труб и аспирировать супернатант.
   4. Добавьте 20 зл и средств массовой информации или 1x PBS к каждой трубке и хорошо перемешайте.
   5. Добавьте трипан синий в соотношении 2 л трипан голубого пятна до 20 Зл клеточной суспензии.
   6. Загрузите 10 зл и синюю подвеску Трипан в каждую камеру гемоцитометра и подсчитайте клетки под легким микроскопом, с синими окрашенными клетками, представляющими мертвые клетки и неокрашенные клетки, представляющие живые клетки.
      1. В живой клетке % (количество живых клеток - общее количество ячеек) x 100.

6. Сфероидная характеристика с гистологическими методами

ПРИМЕЧАНИЕ: Есть два варианта формы 3D напечатаны в биосовместимых полимера для репликации сфероидных формы массива, сделанные Иванов и др.²⁴: 1) 20 хорошо плесени, которая может содержать 28 Л л в скважине и 2) 63 хорошо плесень, которая может содержать 9 л в хорошо (Рисунок 2D).

1. Стерилизовать гистологию плесень и ее границы, вытирая их вниз с 70% этанола и прикрепить границу твердо вокруг формы и заложить форму вертикально. Обе формы подходят примерно 3 мл жидкости (3,203 мл для 20 сфероидного массива и 3,196 мл для 63 сфероидного массива).
2. Слегка пальто сфероидного массива с 10000 cSt Si нефти с помощью остроконечного ватного тампона для облегчения удаления образца обработки гель отлиты в последующие шаги.
3. Разогрейте образец обработки геля до сжиженного через микроволновую печь в течение 10-20 с крышкой ослаблены.
4. Добавьте между 2.6 и 2.8 ml расплавленного геля обработки в форму до приблизительно уровня с верхней частью границы.
5. Через несколько минут, как только затвердевает, удалить обработки гель литые, отделяя границу от формы, а затем инвертирование массива формы.
6. Вставьте пинцет отзыв между плесенью и границы, чтобы тщательно отделить их, а затем использовать клетку скребок, чтобы помочь выбить литые из формы, если он не отделяется сразу.
7. Урожай сфероидов из висячих падение пластины путем pipetting содержимое одного колодца на 100 или 150 мм клеточной петри блюдо с 1000 л пипетка, и изолировать сфероид визуально.
8. Pipet 5 ЗЛ содержимого скважины, включая идентифицированный сфероид в одну из скважин массива, пока массив не будет заполнен.
9. Подождите 3 минуты, чтобы обеспечить сфероиды поселились в нижней части массива, прежде чем мягко pipetting расплавленного геля обработки в каждом из скважин быть осторожным, чтобы не беспокоить сфероидов.
10. Добавьте дополнительный обрабатывающий гель, чтобы выровнять верхнюю часть массива и после охлаждения, поместите затвердеваемый сфероидный массив в помеченную кассету для обработки.
11. Погружение помечены кассеты в 4% формалин ночь, чтобы исправить сфероидов на 4 КС, а затем хранить в 70% этанола при 4 кв С до готовности к обработке.
12. Процесс со стандартной 1 h парафин программы, а затем вставлять сфероидных массивов таким образом, что обработанные массивы сталкиваются вертикально с нижней части скважин ближе всего к блоку лицо.
13. Убедитесь, что массивы встроены как можно более плоские, с нижней стороны заподлицо с нижней части блока и место блоков на льду.
14. Загрузите блок на микротомию и отрегулируйте блок таким образом, чтобы лезвие было параллельно с загруженным лицом блока.
15. Вырезать массив (глубина образца - 15 мкм) до тех пор, пока дно скважины массива не будет достигнуто, убедившись, что круглые скважины видны на образцах разреза.
16. Переключитесь на глубину образца 5 мкм и продолжайте нарезать и собирать ленты. Проверьте под микроскопом каждые несколько ломтиков, чтобы определить, если сфероид глубина была достигнута. После того, как сфероиды достигаются собирать каждый последующий слайд, пока сфероиды больше не видны.
17. Пятно каждого слайда со стандартным протоколом Н И E.

7. Live Мертвые Цитотоксичность Ассаи

1. К каждой висячей капли добавьте живой клеточный краситель, кальцин-АМ к конечной концентрации в 2 мкм, а мертвый клеточный краситель, этот йомимер-1 до конечной концентрации 4 МКм, имея в виду, что объем падения составляет 20 мл.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Старайтесь, чтобы объемы добавили к минимуму, и, как правило, добавить 2 Зл красителей вместе взятых.
2. Поместите тарелки обратно в инкубатор, зажатый в 6-колодчатой тарелке с крышкой, и инкубировать сфероиды в течение 45 минут при 37 градусах Цельсия.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от размера сфероидов, это время инкубации значительно меняется. Например, сфероиды под 400 мкм обычно требуют только 30-45 мин инкубационного времени, в то время как более крупные сфероиды, приближавшиеся к 800 мкм, требуют до 90 мин инкубационного времени. Время инкубации должно быть оптимизировано для эксперимента человека.
3. Для последующего изображения, урожай сфероидов с 1000 л пипеты в шкафбиобезопасности и депозит каждого сфероида на предварительно очищенный стеклянный микроскоп слайды.
4. Изображение сфероидов через стекло, на перевернутом конфокальном микроскопе.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от близости конфокального микроскопа к лаборатории, в которой собирают сфероиды, сфероиды могут быть либо изображены в оригинальной капле среды, размещенной на слайде, либо заключены в 2% агарозы, если для переноса сфероидов требуется большая стабильность.
5. Используя режим многомерного приобретения в программном обеспечении микроскопа, найдите сфероид с помощью диктовки DIC при 10-м увеличении, а затем сканирует z-плоскость, чтобы определить высоты, охватывающие сфероид.
6. Нажмите на серию и установите верхний и нижний предел z-scan немного выше верхней части сфероида и немного ниже нижней части сфероида.
7. Возбуждайте сфероиды на уровне 488 нм для кальцин-АМ (живые клетки; зеленый) и 561 нм для имхидия homodimer-1 (мертвые клетки; красный) с размером шага, рекомендованный программным обеспечением, максимальный выигрыш и минимальное воздействие для каждого цвета.
8. Нажмите Приобрести для получения композитного z-стек изображение живых и мертвых клеток в сфероид.
9. Количественная пропорция живых/мертвых с помощью программного обеспечения для обработки изображений для количественной оценки процента интенсивности пикселей от канала, соответствующего живым клеткам, по сравнению с процентом интенсивности пикселей от канала, соответствующего мертвым клеткам композита z-проекционные изображения.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за ограничений в количественной 3D структуры с 2D-проекцией, альтернативный метод количественной оценки жить против мертвых флуоресценции, в висячих пластин падение заключается в использовании пластины читателя после протокола, включенного с кальцийн-AM и итихов комплект омодимера-1.

8. Иммунофлуоресценция

1. Нагрейте низкоплавленный 2% раствор агарозы, поэтому раствор вязкий и чуть выше точки плавления и поместите на слайд микроскопа, чтобы создать мягкую кровать агарозы
2. Урожай сфероидов, нажав 20 л PBS через падение на мягкую кровать 2% агарозы.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это должно быть сделано быстро, так что агароза не затвердевает, прежде чем сфероиды встроены.
3. После того, как агароуз охлаждается и гели с собранным сфероидом в ловушке в течение (менее 5 мин), добавить 4% нейтральных буферных формалин исправить сфероидов. Кроме того, добавить ледяной метанол, и исправить агарозы встроенных сфероидов при -20 градусов по Цельсию в течение 30 минут.
4. Вымойте 3x в течение 5 минут каждый с 1x PBS, отбрасывая PBS после каждой стирки.
5. Блок для 1 ч на RT с 10% сыворотки (т.е. сыворотки лошади) и 0,15% мыльного раствора (Triton X-100) в 1x PBS.
6. Вымойте 3x в течение 5 минут каждый с 1x PBS, отбрасывая PBS после каждой стирки.
7. Сфероиды с желаемыми флуоресцентными антителами при рекомендуемом или предопределенном разбавлении антител (т.е. флуоресцентно помеченный фаллоидином при разбавлении 1:100), инкубации в течение не менее 90 мин при комнатной температуре, покрытые светом.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Протоколы будут варьироваться в зависимости от антител и цели и разбавления антител, возможно, потребуется оптимизировать в зависимости от эксперимента.
8. Визуализируйте флуоресцентно окрашенные сфероиды с перевернутым конфокльным микроскопом с помощью методов, изложенных в предыдущем разделе для визуализации сфероидов.
9. Композитные изображения z-stack продемонстрируют 3D морфологию в сфероидах.

9. Сбор и анализ популяций стволовых клеток рака с помощью цитометрии потока

1. Подготовка сфероидов для анализа цитометрии потока
   1. Соберите сфероиды из каждой скважины в висячих пластинах капли с помощью 1000 л трубик и депозит их в 15 мл центрифуги трубки для дезагрегирования с повторным pipetting.
   2. Подсчитайте жизнеспособные клетки на гемоситометре, используя Trypan Blue для определения количества клеток и концентрации, как описано выше.
   3. Подвеска клеток Aliquot в пять микроцентрифуговых трубок, которые содержат минимум 50 000 клеток.
   4. Центрифуга все трубы на 400 х г в течение 5 мин в микроцентрифуге.
   5. Призадыхать супернатант из каждой трубки и resuspend гранулы в 100 зл буфера.
   6. Этикетки труб "Неокрашенные", "DAPI", "APC-iso", "DEAB" и "ALDH/CD133", соответственно.
   7. Добавьте 0,5 злиц антитела APC-изотипа к трубке APC-iso и 1 Зл антитела CD133 к трубке ALDH/CD133, как это определено последовательной рекомендацией разбавления и производителей.
   8. Добавьте 5 зл и 0,5 зл ALDH в трубку DEAB и 1 ЗЛ ALDH в трубку ALDH/CD133.
   9. Vortex все трубки в течение примерно 2 с и инкубировать при 37 кв кв 45 мин.
   10. Vortex все трубы снова и центрифуга на 400 х г в течение 5 мин в микроцентрифуге.
   11. Этикетка FACS трубки "Неокрашенные", "DAPI", "APC-iso", "DEAB", и "ALDH/CD133" и заполнить изолированные контейнер пены, чтобы отложить.
   12. Аспирсупернатант и resuspend "неокрашенный" контроль в 400 ЗЛ FACS Buffer (1x PBS с 2% FBS) и все другие трубы в 400 ЗЛ FACS DAPI буфера (FACS буфера с 300 мкм 4',6-diamidino-2-phenylindole).
   13. Поместите трубки в контейнер со льдом до анализа на цитометр потока.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы сортировать для стволовых клеток рака яичников, собрать все клетки, что цитометр меры, чтобы быть ALDH и CD133 "с воротами установить включить 0,5% неспецифических сигнала APC и 0,15% неспецифических ALDH' сигнал. По крайней мере 10000 клеток должны быть проанализированы для надежных результатов. Дополнительную информацию можно найтив последних публикациях 3,¹⁷.
2. Анализ популяций ALDH/CD133 в FlowJo
   1. Дважды щелкните значок FlowJo, чтобы открыть программу и перетащите файлы .fcs, полученные из программного обеспечения цитометрии потока, в рабочее пространство.
   2. Дважды щелкните неокрашенный файл и установите y-оси в сторону рассеять высоту (SSC-H) и x-оси для вперед рассеять высоту (FSC-H).
   3. Нажмите кнопку T рядом с каждой оси, чтобы настроить масштаб и преобразование, чтобы максимизировать разделение между различными популяциями клеток.
   4. Нажмите на кнопку Polygon gating и нарисуйте многоугольные ворота вокруг популяции клеток и обозначьте популяцию 'Cells'.
   5. Дважды щелкните популяцию клеток в рабочей области, чтобы просмотреть только ячейки в популяции «Ячеек», а затем нажмите на ось FSC, чтобы изменить канал оси на ширину FSC, а затем нажмите на ось SSC и измените канал оси на FSC-H.
   6. Выберите инструмент ворота Rectangle и нарисуйте прямоугольник вокруг самой плотной популяции клеток, охватывающих всю ось y,чтобы исключить потенциальные дублеты справа от окна и обозначить эти ворота 'Single Cells'.
   7. Нажмите правой кнопкой мыши и скопировать клетки и вложенные ворота single Cells и вставьте их под каждый образец в рабочем пространстве.
   8. Дважды щелкните ворота Single Cells, вложенные под образец DAPI в рабочей области, чтобы просмотреть популяцию одной ячейки из этой выборочной трубки и нажать на ось FSC и изменить канал оси на канал DAPI - Area.
   9. Нажмите на ось SSC и измените канал оси на Гистограмму.
      ПРИМЕЧАНИЕ: живые клетки будут влево, поскольку они исключают DAPI, в то время как мертвые клетки будут принимать в DAPI и появляются справа от графика.
   10. Нажмите на кнопку T рядом с оси DAPI и нажмите на настраиваемую ось, чтобы настроить шкалу, чтобы максимизировать разделение между положительными и отрицательными пиками DAPI.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Окно появится с опциями масштабирования. Часто, устанавливая поле шкалы к Biex и регулировка дополнительных отрицательных декад и базиса ширины принесет большое разделение.
   11. Нажмите Применить в всплывающем окне применять изменения масштабирования, выбрать кнопку диапазона ворот, и распространить его на DAPI отрицательный пик, соответствующий живой популяции клеток.
   12. Пометьте эти ворота 'Live Cells' и правым щелчком мыши, чтобы скопировать ворота 'Live Cells', чтобы вставить их под воротами 'Single Cells' под 'APC-iso, 'DEAB', и 'ALDH/CD133' трубки, чтобы выбрать ту же часть живых клеток в каждой пробетрубке.
   13. Затем дважды щелкните популяцию живых клеток, вложенных под образец файла APC-iso, и переключите ось x на ALDH - Area channel и y-оси на aPC - Area channel.
   14. Опять же, отрегулируйте шкалу оси, нажав кнопку T и настройте ось каждой оси так, чтобы события были локализованы в нижней левой области участка и выберите опцию четырехъядерных ворот и нажмите окно участка, чтобы установить ворота квадранта .
   15. Отрегулируйте пересечение ворот таким образом, что примерно 0,5% населения находится в верхнем левом углу окна участка или квадранта APC positive.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Это 0,5% представляет собой неспецифическое окрашивание изотитипа APC.
   16. Право нажмите каждый квадрант этикетки индивидуально в рабочей области и переименовать их соответствующим образом. Управление или команда нажмите каждый квадрант ворот этикетки в рабочем пространстве и скопировать их.
       ПРИМЕЧАНИЕ: «No1» представляет клетки CD133; «2» представляет клетки CD133 и ALDH; «3» представляет собой клетки ALDH; и 'No 4' представляет клетки CD133- и ALDH-.
   17. Вставьте ворота квадранта на популяцию живых клеток, вложенные под файлом 'DEAB'. Отрегулируйте вертикальную линию таким образом, что примерно 0,15% популяции клеток находится в квадранте «ALDH», заботясь о том, чтобы не перемещать горизонтальную линию.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Это 0,15% представляет собой неспецифический сигнал ALDH.
       1. Чтобы горизонтальная линия не изменила положение, скопируйте новые ворота квадранта, вложенные под файл DEAB, и вставьте их в живые ячейки под файлом APC iso. Выберите Да, когда его попросят заменить существующие квадрантные ворота.
       2. Уверяйте в рабочей области, что процент 'CD133' по-прежнему составляет примерно 0,5 под файлом 'APC-iso'.
   18. Копировать и вставить ворота квадранта в 'ALDH/CD133' файла 'Live Cells' населения.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Процент жизнеспособной популяции клеток, присутствующих в правом верхнем квадранте, будет в процентном соотношении ALDH и CD133 с двойным положительным CSC в выборке.

Результаты

Сфероиды, образованные с помощью клеточных линий или csCs, полученных пациентом, могут быть сформированы с диапазоном небольших номеров клеток в пределах висячих капель(рисунок 2A). Сфероиды образуют надежно всего 10 клеток на скважину, что позволяет сохранить редкие образ...

Обсуждение

384-хорошо висит падение пластины платформы для 3D сфероидов формирования легко реализован инструмент для любой клеточной биологии или рака биологии лабораторий. Эта физиологическая платформа позволяет изучать клеточные линии, а также первичные образцы пациентов в физиологически знач...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% trypsin-EDTA	Gibco	ILT25200056
10 mL serological pipet	Fisher Scientific	13-678-11E
10,000 cSt Si oil	Millipore Sigma	63148-62-9	Used to coat spheroid array mold to facilitate removal of tissue processing gels, like Histogel, from the mold.
100 mm tissue culture dish	Thermo Scientific	130182
15 ml conical tube	Celltreat	FL4021
1X DMEM for Serum Free Medium	Gibco	11965-092
1X F12 for Serum Free Medium	Gibco	11765-054
1X phosphate buffered saline (PBS)	Gibco	ILT10010023
4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Thermo Fisher	D1306
40 µm filter	Fisher Scientific	22363547
6-well plate	Fisher Scientific	353046
Accutase	Innovative Cell Technologies Inc.	1449	A gentle cell detachment enzyme composed of proteolytic and collagenolytic enzymes.
ACK Lysing Buffer	Thermo Scientific	A1049201
alamarBlue	Invitrogen	DAL1025	Resazurin dye used to measure viability and proliferation of cells based on their ability to reduce resazurin to resorufin, which is highly fluorescent.
ALDEFLUOR assay kit	Stem Cell Tech	1700	Kit to identify stem and progenitor cells that express high levels of aldehyde dehydrogenase , an indicator of cancer stem cells. The kit is composed of ALDEFLUOR Reagent, DEAB, Hydrochloric Acid, Dimethylsulphoxide, and ALDEFLUOR Assay Buffer.
ALDEFLUOR Diethylaminobenzaldehyde (DEAB)	Stem Cell Tech	1705	Diethylaminobenzaldehyde (DEAB) is an inhibitor of ALDH isozymes, used to determine non-specific ALDH staining.
Andor iXon x3 CCD Camera	Oxford Instruments	-
Antibiotics and Antimycotics	Gibco	15240-062
APC-isotype IgG2b	Miltenyi biotec	130-092-217	Isotype control to quantify non-specific staining of IgG2b antibodies.
B27 Supplement	Gibco	17504044
basic Fibroblast Growth Factor	Stem Cell Technologies	78003.1
BD Lo-Dose U-100 Insulin Syringes	Fisher Scientific	14-826-79
BioTek Synergy HT Microplate Reader	BioTek	7091000
CD133-APC	Miltenyi biotec	130-113-184	Fluorescent antibody targeting CD133, a cancer stem cell marker.
cellSens Dimension Software	Olympus
Cisplatin	Sigma-Aldrich	P4394	Platinum based chemotherapy agent that functions as an alkylating agent that disrupts DNA.
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)	Invitrogen	D1306
Epidermal Growth Factor	Gibco	PHG0311
EVOS XL Core Cell Imaging System	Life Technologies	AME3300
Fetal Bovine Serum - premium (FBS)	Atlanta Biologicals	S11150
Ficoll 400	Sigma-Aldrich	F4375
Hemacytometer	Hausser Scientific	1490
Histogel	Thermo Scientific	HG-4000-012	Tissue processing gel that can penetrate and hold the specimen within the gel while preventing discoloration around the specimen upon staining.
Human Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells	Lonza	PT-5006
Human Microvascular Endothelial Cells	Lonza	CC2543
Insulin-Transferrin-Selenium Supplement	Gibco	51500-056
Live/Dead viability kit	Invitrogen	L3224	Kit for the fluorescence based detection of live (calcein-AM) and dead cells (Ethidium Homodimer-1).
MEM Non-essential Amino Acids	Gibco	11140-050
MetaMorph 7.8 Software	Molecular Devices	-
Olympus IX81 Inverted Confocal Microscope	Olympus	-
Olympus IX83 Research Inverted Microscope	Olympus
Parafilm M	Thomas Scientific	7315D35	Thermoplastic polymer strips that serve to limit droplet evaporation in hanging drop plates while still allowing for gas exchange.
Perfecta 3D 384 Well Hanging Drop Plates	3D Biomatrix	HDP1384-8	Available through Sigma-Aldrich
phalloidin AlexaFluor488	Invitrogen	A12379	Phalloidin is a peptide to fluorescently label F-actin in fixed cells.
ProJet 3500 HD Max	3D Systems	-	3D printer
Sterile DI water	Fisher Scientific	353046
Trypan Blue	Gibco	15250061	Azo dye used to differentiate between live and dead cells based on its ability to pass through the damaged membrane of dead cells, but not the intact membrane of live cells.
VisiJet M3 Crystal	3D Systems	-	A biocompatible polymer material for 3D printing.
Yokogawa CSU-X1 Confocal Scanner Unit	Yokogawa	-