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要約

ここでは、HIVに感染した個体および健全なコントロールからヒト一次単球を分離、培養、トランスフェクション、および区別するための最適化されたプロトコルです。

要約

ヒト免疫不全ウイルス(HIV)は、1990年代半ばに併用抗レトロウイルス療法(cART)が導入されたにもかかわらず、依然として大きな健康上の懸念事項である。抗レトロウイルス療法は、効率的に全身性ウイルス負荷を低下させ、正常なCD4+T細胞数を復元するが、それは完全に機能的な免疫系を再構成しない。cARTを受けているHIV感染者の機能不全免疫系は、免疫活性化、免疫細胞の早期老化、または持続的な炎症によって特徴付けられる。これらの状態は、HIV感染に関連する併発因子と共に、細胞および動物モデルでは容易に再現できない疾患に複雑さを加える。これらの患者における免疫機能障害の根底にある分子事象を調べるために、インビトロでヒト一次単球を培養および操作するシステムをここに提示する。具体的には、このプロトコルは、cARTを受けているHIV感染個体から得られる一次CD14+単球の培養およびトランスフェクション、ならびにHIV陰性対照から可能である。この方法は、単球および単球由来マクロファージの単離、培養、およびトランスフェクションを含む。市販のキットと試薬が採用されている間、このプロトコルは、miRNA模倣および阻害剤およびsiRNAを用いた単球の付着およびトランスフェクションを成功させるための重要なヒントと最適化された条件を提供する。

概要

ヒト免疫不全ウイルス-1(HIV-1)感染は重度の免疫機能障害を引き起こし、日和見感染や後天性免疫不全症候群(AIDS)を引き起こす可能性がある。cARTを受けているHIV感染患者は、ウイルス負荷が低く、正常なCD4+T細胞数を特徴とするが、免疫系の機能はこれらの個体において損なわれ得るが、癌を発症するリスクの増加に関連する機能不全免疫応答につながる。cART上のHIV患者における免疫機能障害のメカニズムはほとんど未知のままである。したがって、患者由来の免疫細胞を特徴付け、その生物学と機能を調べるのは、現在のHIV研究の重要な要素です。

単球およびマクロファージは免疫応答の主要な調節剤であり、HIV感染において基本的な役割を果たす2,3,4,5.本質的に異種およびプラスチックは、マクロファージを広く古典的に活性化(M1)または代替活性化(M2)に分類することができる。この一般的な分類は実験条件を設定する際に必要であるが、マクロファージの偏光状態は、種々のサイトカイン6、7、8、9によって逆転してもよい。いくつかの研究は、単球および樹状細胞に対するHIV感染の影響を調査しているが、単球媒介応答の分子詳細はほとんど不明である6,7,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19.免疫細胞の調節および機能に関与する因子の中で、microRNA(miRNA)は、遺伝子発現後に転写的に調節する短い非コードRNA、主要な細胞経路(すなわち、増殖、分化、発達、およびアポトーシス)20の文脈において重要な役割を果たすることが示されている。これらの分子は、マクロファージ21の機能的分極化を指示するために不可欠な転写因子の重要な調節因子として記載されている。cARTを受けているHIV感染者からの単球におけるmiRNAの潜在的な役割が調査されているが、現場での進歩は、はるかに多くの作業を必要とする22、23、24、25、26。本論文では、HIVに感染した患者と対照からmiRNAとsiRNAを原発性ヒト単球にトランスフェクトする最適化された方法について論じる。

このプロトコルは、技術的な手順の連続性は臨床サンプルを扱うときに不要な実験変数を排除するのに役立つため、市販の試薬およびキットに依存しています。それにもかかわらず、この方法は、重要なヒント(すなわち、プレートへの細胞の付着を促進するために無血清媒体を用いためっきまたは短時間のインキュベーションの細胞数)を提供する。さらに、このプロトコルで使用される偏光条件は、公開された作品27、28、29に由来する。

プロトコル

以下に説明するすべての方法は、ルイジアナ州立大学健康科学センターニューオーリンズ機関審査委員会によって承認されています.インフォームド・コンセントを得た後、すべての血液を採取した。

注:全手順は、生物学的材料の処理に注意が必要になるように、バイオセーフティレベル2(BSL2)施設の滅菌条件下で行われます。特に、各工程は、バイオセーフティキャビネット下で滅菌技術を用いて行われる。血液、血液製剤、細胞、または細胞産物ピペットを含む各ステップの後、適切な処分の前にフード内の廃棄物容器から10%の漂白剤ですべてのプラスチック材料(すなわち、血清学的ピペット、ピペットチップ、チューブ)をすすぐることが重要です。

1. 免疫磁気陰性選択による原発性ヒト単球の単離

  1. 4つの10 mLエチレンジアミンテトラ酢酸(EDTA)真空管(チューブあたり10 mLの血液)で、新鮮なヒト全血(HIV+患者または健康対照のいずれかから)を収集します。バイオセーフティキャビネットの下で滅菌技術を使用して、血液のすべての40 mLを1つの50 mL円錐プロピレンチューブに移します。
  2. 選択したヒト単球単球単離キット(材料の表)のメーカーのプロトコルに従って、キットで提供される単球単一細胞分離カクテルを血液のチューブに2 mL追加します。ボルテックス磁気ビーズは、キットにも設け、30s用、血液の管に2mLを加える。
    1. 40 mL 未満の血液が使用可能な場合は、追加した試薬をスケールダウンします。溶液を混合するには、プラスチック25 mL血清ピペットで上下にピペットし、室温(RT)で5分間インキュベートします。
  3. 血液混合物を4つの50 mLチューブに均等に分離し、1 mM EDTAを含む滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)を30mL各チューブに加えます。プラスチック25 mL血清ピペットで上下にピペットで混合します。
  4. チューブを磁石ホルダーに10分間入れ、抗体共役磁気ビーズを取り外します。各血液サンプルの一貫したインキュベーションと分離時間を可能にするために、チューブごとに1つずつ、4つの磁石ホルダーを同時に使用します。
  5. ピペットを使用して、各チューブの中央から内容物を描き、磁石ホルダーに残ります。赤血球(10mL開始体積の10%以下)を引き出さないように注意し、4つの新しい50 mLチューブのいずれかに内容物を入れます。
  6. 50mLのチューブに500μLのボルテックス磁気ビーズを加えます。ピペットは25 mLピペットで上下にピペットし、RTで5分間インキュベートします。次に、チューブを磁石ホルダーに5分間入れます。
  7. 磁石ホルダーを4本の新しい50mLチューブの1つに入れながら、各チューブの中央から内容物を慎重に転送します。新しい50 mLチューブを磁石ホルダーに5分間直接置きます。
  8. 慎重に4つの新しい50 mLチューブのいずれかに各チューブの中心から内容物を転送します。すべての新しい50 mLチューブを300 x gで5分間回転させ、上清を吸引し、4つの細胞ペレットをすべて合計10mLの滅菌PBSで再スピンします。
  9. 血球計を用いたトリパンブルーの除外によって細胞をカウントする。
    注:8-20 x 106細胞は、一般に、全血の40mLから得られる。

2. 原発性ヒト単球の培養

  1. 37°Cの水浴を使用して、1%ペニシリンストレプトマイシン(ペン/ストレップ)を補充した温かい無血清RPMI 1640媒体、および(バイオセーフティキャビネットの下で無菌技術を使用し続けている間)1x 106細胞/mLの濃度でこのメディアで単離された単球を再懸濁する。
  2. 6ウェルプレートまたは35mm皿(最終的な細胞数は1 x 106細胞/プレートでなければなりません)に再懸濁した細胞の1 mLを追加し、5%CO2で37°Cのインキュベーターに入れます。細胞が付着するまで0.5~1.0時間待ちます。
  3. 37°水浴を使用して、温熱不活化(HI)胎児ウシ血清(FBS)。各プレートにFBSの100 μL(最終濃度10%)を加えます。細胞に成長因子を加えるマクロファージ分化を促進する。
    1. 25 ng/mLの顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)を媒体に添加することにより、M1様表現型の主マクロファージ。M2様表現型に対する主マクロファージは、50ng/mLのマクロファージコロニー刺激因子(M-CSF)を媒体28に添加することにより、
      注:GM-CSFおよびM-CSFの両方は、M1またはM2のプライミング細胞がそれぞれ7、28、30である間、一般的なマクロファージ表現型(M0)に単球分化を可能にする。

3. 培養中の原発ヒト単球のトランスフェクション

  1. miRNA模倣または阻害剤またはsiRNAを有するトランスフェクト単球は、ポリマー系トランスフェクション試薬(材料表)を含有するキットを用いた。
    1. トランスフェクションキットのメーカーのプロトコルに従い(そしてバイオセーフティキャビネットの下で滅菌技術を使用し続ける)、まず、選択されたmiRNA模倣/阻害剤またはsiRNAをバッファー内の最終濃度1.83μMに希釈し、1x 106細胞のトランスフェクション当たり10μLの希釈模倣/阻害剤を調製します。
  2. 提供されたポリマーを1μLの新しい1.5 mLマイクロ遠心管に加えてトランスフェクション試薬を調製し、すぐに90μLの緩衝液を加えます(トランスフェクションあたり合計91μLの試薬)。3-5 sのための渦。
  3. 希釈されたmiRNA模倣/阻害剤またはsiRNAの10μLを含むチューブにトランスフェクション溶液のピペット90μL。穏やかなピペットで混ぜ、RTで15分間インキュベートします。
  4. 1 x 106めっき単球の1つの井戸(または皿)に100μLのトランスフェクション複合体を加えます。37°Cで4時間細胞をインキュベートし、GM-CSFまたはM-CSFのいずれかを含む完全な培地(RPMI 1640を1%ペニシリン・ストレプトマイシンと10%熱不活性化FBSで補充)の3mLに交換します。

4. M1/M2の差別化と活性化

  1. 単球は、培養中のめっき時に広いM0マクロファージに分化し始める。めっき後3日目に、バイオセーフティキャビネットの下で滅菌技術を使用し続け、新鮮なRMPI 1640媒体(ペニシリン・ストレプトマイシン1%、熱不活性化FBS10%、および25ng/mL GM-CSFを補う)の3mLでメディアを交換し、M1様偏光または50ng/mL MFを促進します。これらの条件で細胞を培養し、初期めっきから合計6日間、インキュベーターで37°、5%CO2で培養する。
  2. M1-マクロファージ表現型への素子細胞の偏光を進めるために、細胞媒体を5%熱不活性化FBS、1%ペン/ストレップ、100ng/mL大腸菌由来リポ多糖(LPS)、および20ng/mLインターフェロンガンマ(IFN γ)を含む新しい媒体に置き換えることによって、インキュベーションの6日目に細胞を活性化する。
  3. M2-マクロファージ表現型への素子細胞の偏光を進めるために、細胞媒体を5%の熱不活性化FBS、1%ペン/ストレップ、10 ng/mL M-CSF、および20 ng/mLインターロイキン4(IL-4)を含む新しい媒体に置き換えることによって、インキュベーションの6日目に細胞を活性化します。
  4. 24時間後、RNA、タンパク質、またはフローサイトメトリー分析用の細胞を採取します。
    1. 細胞を採取する準備ができたら、PBSで皿2xで細胞を洗浄します(RNA抽出の場合はRTで、またはタンパク質抽出のために氷上で冷却)。分化したマクロファージがプレートにしっかりと取り付けられているため、細胞をプレートに直接リゼし、RNAおよびタンパク質分析用の材料を得ます。
    2. フローサイトメトリーのための材料の収集のために、皿に2 mM EDTAを含むPBSを追加し、37°で10分間細胞をインキュベートし、皿から細胞を穏やかに掻き取り、標準プロトコルで進む前に1.5 mLマイクロ遠心管で内容物を収集します。

5. フローサイトメトリー

  1. 培養培地を除去するためにPBS中の細胞をすすす。100,000細胞(各フローサイトメトリー条件あたり)をスピンダウンし、HuFcR結合阻害剤の2μLを含むPBSの100μLでペレットを再サスペンドします。RTで15分間インキュベートします。
  2. 50 μLの染色バッファーを加え、所望の抗体(ここでは、CD80、CD83、CD163、CD209を使用)を推奨量で添加します。
  3. ゆっくりと混ぜ、暗闇の中で4°Cで30分間インキュベートします。
  4. 2xをPBSで洗浄し、染色された細胞を150μLのPBSで再サスペンドしてから、サンプルをサイトフルオリメータで実行します。

結果

記載された手順を用いて、HIV感染者および健康なドナーからの原発性ヒト単球を単離した。ここで提示されたすべてのデータは、低い(<20コピー/mL)または検出不能なウイルス負荷と通常のCD4+T細胞数を有するcARTを受けているHIV+被験者から得られた。単離直後に細胞を染色し、フローサイトメトリーを行い、細胞集団の純度を確認した。結果は、>97%の?...

ディスカッション

提示されたプロトコルは、単球およびマクロファージを研究するためのモデルとしてHIV感染被験者からの一次細胞の使用を示す。HIV+cARTを受けている患者は、何年も感染症と共に生きており、また、侵害された免疫系に関連する他の共感染を持つことができます。HIV慢性感染の存在下で免疫調節を研究するために、細胞を患者から直接採取した。miRNAが細胞の発達と分化に大きな役割?...

開示事項

著者たちは何も開示する必要はない。

謝辞

著者らは、患者サンプルを提供するためのHIV臨床/腫瘍バイオレポジトリコアと、フローサイトメトリー分析を提供するための細胞免疫学代謝コアに感謝したいと考えています。このプロジェクトは、NIH P20GM121288とP30GM114732によって資金提供されました。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
0.5M EDTAInvitrogenAM9260G
BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tubes with K2EDTABD Biosciences366643
Brilliant Stain BufferBD Horizon563794Flow cytometry
CD14 PerCPInvitrogen46-0149-42Flow cytometry- conjugated antibody
CD163 BV711BD Horizon563889Flow cytometry- conjugated antibody
CD209 BV421BD Horizon564127Flow cytometry- conjugated antibody
CD80 FITCBD Horizon557226Flow cytometry- conjugated antibody
CD83 APCBD Horizon551073Flow cytometry- conjugated antibody
Easy 50 EasySep MagnetStemCell Technologies18002
Easy Sep Direct Human Monocyte Isolation KitStemCell Technologies19669
EIF4EBP1 mAbCell Signaling9644Monoclonal antibody for Western blot
EIF4EBP1 siRNASanta Cruzsc-29594
Fetal Bovin Serum Defined Heat InactivatedHycloneSH30070.03HI
Gallios Flow CytometerBeckman CoulterB43618
GAPDH mAbSanta CruzSC-47724Monoclonal antibody for Western blot
HuFcR Binding InhibitoreBiosciences14-9161-73Flow cytometry- blocking buffer
Kaluza Analysis SoftwareBeckman CoulterB16406Software to analyze flow cytometry data
Lipopolysaccharides from Escherichia coli O55:B5SigmaL4524
miRCURY LNA microRNA Mimic hsa-miR-146a-5pQiagenYM00472124
MISSION miRNA Negative ControlSigmaHMC0002Scrambled miRNA conjugated with a near infrared dye
Nunc 35mm Cell Culture DishThermo Scientific150318
PBSGibco20012027
Penicillin-StreptomycinGibco15140122
Recombinant Human GM-CSFR&D Systems215-GM-050
Recombinant Human IFN-γR&D Systems285-IF-100
Recombinant Human IL-4R&D Systems204-IL-010
Recombinant Human M-CSFR&D Systems216-MC-025
RPMI 1640 with L-GlutamineCorning10040CVMP
Scrambled Control siRNASanta Cruzsc-37007
Viromer Blue Transfection Reagent KitLipocalyxVB-01LB-01
WST-1 Cell Proliferation ReagentRoche5015944001Colorimetric assay to assess cell viability

参考文献

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